DEVELOPMENT OF NOVEL LIQUID CHROMATOGRAPHY

METHOD FOR CLINICAL MONITORING OF VITAMIN B1

METABOLITES AND B6 STATUS IN THE WHOLE BLOOD

Tugas KFA 2
Kelas 3C
Anggota :
Nida Puspa Dewi
Suci Sri Dewi
 Latar Belakang
Vitamin yang larut dalam air adalah kelompok yang luas dari mikronutrien esensial yang memainkan
peran penting dalam proses fisiologis tubuh manusia. Di antara semua vitamin, yang pertama
ditemukan turunan vitamin B1, karena dampak positif mereka pada pengobatan berbagai penyakit.
Diantara nya yaitu tiamin dan turunan esterifikasinya, yaitu tiamin trifosfat, diphosphate, monofosfat,
adenosin tiamin triphosphate, dan adenosin tiamin diphosphate. Vitamin yang aktif secara biologis ini
sangat penting sebagai kofaktor dalam jalur metabolisme karbohidrat, asam amino, lipid, dan glukosa.

Dari vitamin B6, yaitu piridoksin, pyridoxal, pyridoxamine, dan masing-masing produk fosfat dengan
bentuk biologis yang paling aktif pyridoxal-5-fosfat, yang tergabung dalam lebih dari 140 enzim dan
kompleks enzim.

Penentuan vitamin B1 dan B6 dan vitamersnya menantang karena ketidakstabilannya, sifat fisik dan
kimia, dan karena kompleksitas matriksnya biasanya terjadi. Pengukuran simultan vitamin yang larut
dalam air menggunakan cairan kromatografi agak menantang karena berbagai polaritasnya

Status vitamin B1 dan B6 sebelumnya telah dinilai dalam eritrosit, plasma, serum, susu manusia, dan
urin. Namun, telah ditunjukkan bahwa seluruh darah adalah spesimen yang paling representatif untuk
mengukur kadar vitamin dan vitamers masing-masing.
 Analit Yang Dianalisis
o Vitamin B1 o Vitamin B6

Contents Title
Sinonim: ThiamineHydrochloride Sinonim : Pyridoxine hydrochloride
Rumus kimia : C12H17ClN4OS.HCl Rumus kimia : C8H11NO3.HCl
BM : 337.25 BM : 205.64
Contents_Here
Pemerian : Hablur kecil atau serbuk hablur; Pemerian : Hablur putih atau tidak berwarna,
putih;Example
bau khas lemah
Text : Get
modern PowerPoint
a mirip ragi; rasa pahit. atau serbuk hablur putih; tidak berbau, rasa asin.
Kelarutan : Mudah
Presentation that is larut dalam air, sukar larut Kelarutan : Mudah larut dalam air; sukar
beautifully designed. I
dalamhopeetanol (95 %) P; praktis tidak larut
and I believe larut dalam etanol (95 %) P; praktis tidak larut
dalamthat
eter P dan
this Template
your Time, Money
dalam benzen P, larut dalam
will dalam eter P.
gliserolandP.Reputation. pKa : 5.0, 9.0 (25o)
Titik leleh : 248o dengan dekomposisi. pH : pH larutan lebih kurang 3
pH: pH larutan 1% b/v, 2,7 sampai 3,4. Titik lebur : Sekitar 205o; 202o-206o; 205o-212o,
dengan peruraian. Basa bebas melebur pada
o
 Pemisahan Analit dari Matriks

Sampel darah diambil dari 10 orang sukarelawan dewasa yang sehat, 9 wanita dan 1 pria. Pertama, dara diambil
pagi
hari kemudian sukarelawan diberi 100 mg tiamin peroral. Pada hari kedua, darah diambil lagi pada pagi hari.
Dilakukan selama 3 bulan.

o Preparasi sampel :
Darah diambil dari Content Here 600 µL darah
cubital vein dan
disimpan dalam tube
spray 6 mL yang
03
Campurkan dan
homogenisasi.
dimasukkan dalam
tube 2 mL, segera
Content Here
Simpan sampai akan
digunakan.
dilapisi 10.8 mg garam
EDTA dehydrate.
02
bekukan pada -80o C
sampai selnya lisis.

Ketika sampel akan

digunakan, dicairkan
Homogenisasikan dulu dan lindungi dari
cahaya pada suhu
ruang.
o Derivatisasi sampel : Tambahkan 40 µL HClO4 Simpan secara
250 µL darah lisis (70 %) agar konsentrasi Sampel divortex vertikal dalam
dicampurkan dengan akhirnya mencapai 0.85 ruang gelap pada
250 µL 0.1 mol/L mol/L untuk dengan kuat
larutan HCL mengendapkan protein dan selama 1 menit suhu 4o selama 10
menggumpalkan sisa sel
menit

Disentrifugasi HClO4
250 µL supernatan Campuran dinetralisasi
pada 21 380 x g
disimpan dalam divortex selama 1 dengan 40 µL 3.89
selama 15 menit
vial baru menit mol/L KOH
pada 4o C

Diderivatisasi dengan Campurkan, dan Campurkan, dan

tambahkan 40 µL Tambahkan 40 µL
simpan di tempat simpan di tempat
K3Fe(CN)6 dalam 3.89 semicarbazide/ gelap selama 15
mol/L larutan KOH dan gelap selama 15
glycine menit pada 4o C
40 µL metanol menit pada 4o C

Campuran dibasakan
Sampel disegel Campuran disaring dengan penambahan 50 µL
dengan filter 0.2 µm 3.89 mol/L KOH dan 20
dan dianalisis kedalam tempat µL 10% metaphosporic
dengan HPLC mikrotitasi gelap acid untuk menghindari
degradasi tiamin
 Metode Yang Digunakan

Dilakukan analisis dengan

metode
HPLC, metode ini dilakukan
secara
elusi isokratik menggunakan
fase
Fase gerak akhir A mengandung
gerak yang mengandung 95% 95:5 v/v campuran 25 mmol/L
25 buffer K3PO4 pH 7 dan metanol.
mmol/L buffer K3PO4 pH 7 dan Fase gerak B 70% metanol.
Metode divalidasi dengan
5% metanol dengan flow rate penentuan selektifitas, linieritas
2.5 respon detektor pada proses
mL/menit yang meningkat larutan standar, batas deteksi
menjadi (LOD), batas quantitasi (LOQ),
presisi (repitabilitas), akurasi dan
3 mL/menit setelah 2 menit. ketidakrataan (ketahanan).
kurva kalibrasi

Kromatogram pyridoxal-5-fosfat (P-5-P), tiamin difosfat

(TDP), tiamin monofosfat (TMP), dan tiamin (Th)
menggunakan seluruh darah yang diekstraksi dari
sukarelawan sehat.
Gradien yang digunakan untuk elusi adalah : 1% B dalam
A pada 0-2 menit, 2-10 menit 1-40% B dalam A selama
10 menit diikuti oleh return ke kondisi awal (1% B) dan
equilibration selama 3 menit. Laju aliran 0,8 mL/menit
selalu digunakan. Jumlah total runtime adalah 15 menit.
Biasanya, 15 μL sampel, larutan standar, atau kontrol
disuntikkan dari micro-well plate dan digunakan dalam
analisis. Suhu rak changer pada 4° C. Panjang gelombang
375 nm untuk eksitasi dan 435 nm untuk emisi untuk
mendeteksi semua senyawa yang diminati. Tinggi dan
luas puncak sebanding dengan konsentrasi.
 Rata-rata Pengukuran Whole Blood

Untuk memproses seluruh darah, standar dan

kalibrator, kami menguji sejumlah teknik
preparasi sampel, termasuk presipitasi protein,
ekstraksi fasa padat, ekstraksi cair, pembekuan
ekstraksi cair-cair, dan ekstraksi penggaraman
cair-cair. Melakukan hal itu, kami membuat
modifikasi untuk meningkatkan hasil ekstraksi,
menghilangkan gangguan, dan mengakomodasi
prosedur untuk mengumpulkan sampel pasien.
.

Ditemukan bahwa volume besar metanol dan asetonitril diperlukan untuk pengendapan protein dan
mengaglutinasi sisa sel. Hal ini mengakibatkan pengenceran tinggi sampel dan menyebabkan hilangnya
retensi pada kolom. Zinc sulfat bukan pilihan ideal sebagai reagen presipitasi karena bereaksi dengan
reagen derivatisasi dan menurunkan intensitas fluoresensi
 Pembahasan

Pencucian dengan tert-butil metil eter atau dietil eter diperlukan untuk menghilangkan
asam trikloroasetat, atau asam ini harus dinetralisir dengan volume besar larutan natrium
hidroksida.

Faktor pengenceran kecil bermanfaat dalam hal sensitivitas dari metode ini. Hasil terbaik
diamati setelah menggunakan 40 μL 70% asam perklorat. Setiap spesimen diencerkan
untuk memperhitungkan perbedaan dalam viskositas dan kadar air dalam sampel dari
seluruh darah yang akan mengakibatkan pengendapan yang tidak merata.

Penambahan metanol meningkatkan intensitas fluoresensi. Nilai pH sampel meningkat

menjadi basa dengan reaksi derivatisasi dan 25 μL meta-phosphoric acid ditambahkan
untuk meningkatkan stabilitas produk derivatisasi yang cenderung perlahan-lahan
menurun. PH larutan akhir adalah ± 0,2 pH unit berbeda dari pH fase gerak. Akhirnya,
semua sampel disaring menggunakan pelat mikrotitrasi hitam yang disimpan terlindung
dari cahaya di pendingin autosampler.
 
Journal development of novel liquid chromatography method for clinical
monitoring of vitamin b1 metabolites and b6 status in the whole blood
Thank You