ANALISA

PROTEIN
DIENA WIDYASTUTI, S.TP, M.Si
PENGERTIAN
• Protein ialah senyawa organik kompleks
berbobot molekul tinggi (polimer) dari
monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan
peptida
• Protein tersusun atas atom C, H, O, N, dan
pada protein tertentu mengandung unsur
S. Jika membentuk kompleks dengan
senyawa lain dapat mengandung P
• Struktur protein: primer, sekunder, tersier,
kuarterner
TUJUAN ANALISIS
• Menera jumlah protein dalam suatu
bahan pangan
• Sifat protein yang diukur adalah
kuantitas bukan kualitas
• Pengukuran kualitas protein
biasanya diawali dengan pengukuran
kuantitas
Analisis Protein dapat dilakukan
dengan dua cara yaitu
• Secara Kuantitatif
• Secara Kualitatif
METODE KUALITATIF
• Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan
dengan hati-hati ke dalam larutan protein.
Setelah dicampur terjadi endapan putih
yang dapat berubah menjadi kuning apabila
dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah
nitrasi pada inti benzena yang terdapat
pada molekul protein. Reaksi ini positif
untuk protein yang mengandung tirosin,
fenilalanin dan triptofan.
• Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat
direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang
mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari
asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air.
Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole,
asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga
membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa
saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas
antara kedua lapisan tersebut
• Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan
merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila
pereaksi ini ditambahkan pada larutan
protein, akan menghasilkan endapan putih
yang dapat berubah menjadi merah oleh
pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif
untuk fenol-fenol, karena terbentuknya
senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil
yang berwarna.
• Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan
menghasilkan warna merah dengan protein yang
mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang
mengandung sistein dapat memberikan hasil positif
• Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan
natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi
ini memberikan hasil positif apabila ada
gugus guanidin. Jadi arginin atau protein
yang mengandung arginin dapat
menghasilkan warna merah
• Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH
kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji
ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa
yang mengandung gugus amida asam yang
berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini
memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan
timbulnya warna merah violet atau biru violet
METODE KUANTITATIF

• Methode Kjeldahl
Metode Kjeldahl merupakan metode yang
sederhana untuk penetapan nitrogen total
pada asam amino, protein dan senyawa
yang mengandung nitrogen
Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan
dikatalisis dengan katalisator yang sesuai
sehingga akan menghasilkan ammonium
sulfat
• Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia
yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke
dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara
titrasi
• Metode ini telah banyak mengalami modifikasi
• Metode ini cocok digunakan secara semimikro,
sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan
pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang
pendek
PRINSIP
• Penetapan nilai protein kasar dilakukan
secara tidak langsung, karena analisis
ini didasarkan pada penentuan kadar
nitrogen yang terdapat dalam bahan.
• Kandungan nitrogen yang diperoleh
dikalikan dengan angka 6,25 sebagai
angka konversi menjadi nilai protein.
• Nilai 6,25 diperoleh dari asumsi bahwa
protein mengandung 16% nitrogen
(perbandingan protein : nitrogen =100 :
16 = 6,25:1)
• Faktor konversi bisa berbeda
tergantung jenis protein dan kadar N
dalam protein tsb
Misal:
• Protein gandum : 5.70
• Protein susu : 6.38
• Gelatin : 5.55
TAHAPAN METODE KJEDAHL
• Destruksi
• Destilasi
• Titrasi
Destruksi
Destruksi merupakan suatu perlakuan untuk
melarutkan atau mengubah sampel menjadi
bentuk materi yang dapat diukur
sehingga kandungan berupa unsur-unsur
didalamnya dapat dianalisis
Prosedur Analisis
• Timbang contoh sampel kering oven
sebanyak ± 1 gram (catat sebagai A gram)
• Masukan ke dalam labu kjeldhal dengan hati-
hati, dan tambahkan 6 gram katalis
campuran
• Tambah 20 mL Asam Sulfat pekat
• Panaskan dalam nyala api kecil di lemari
asam. Bila sudah tidak berbuih lagi destruksi
diteruskan dengan nyala api yang besar
• Destruksi sudah di anggap selesai bila larutan
sudah berwarna hijau jernih, setelah itu
dinginkan
Destilasi
• Sebuah metode yang dipakai
memisahkan bahan kimia menurut
perbedaan kecepatan ataupun
kemudahan menguap maupun volatilitas
bahan
• Destilasi merupakan cara pemisahan
antara zat cair terhadap campurannya
menurut perbedaan titik didih ataupun
kemampuan zat guna menguap
Prosedur Analisis
• Siapkan alat destilasi selengkapnya, pasang dengan hati-
hati jangan lupa batu didih, vaselin dan tali pengaman
• Pindahkan larutan hasil destruksi ke dalam labu didih,
kemudian bilas dengan aquades sebanyak lebih kurang 50
Ml
• Pasangkan Erlenmeyer yang telah diisi asam borax 5%
sebanyak 5 mL untuk menangkap gas amonia, dan telah
diberi indikator campuran sebanyak 2 tetes
• Basakan larutan bahan dari destruksi dengan menambah
40-60 mL NaOH 40% melalui corong samping. Tutup kran
corong segera setelah larutan tersebut masuk ke labu didih
• Nyalakan pemanas bonsen dan alirkan air ke dalam kran
pendingin tegak
• Lakukan destilasi sampai semua N dalam larutan dianggap
telah tertangkap oleh asam borax yang ditandai dengan
menyusutnya larutan dalam labu didih sebanyak 2/3 bagian
(atau sekurang-kurangnya sudah tertampung dalam
erlenmeyer sebanyak 15 mL
Titrasi
Titrasi adalah penambahan lambat dari
satu larutan dengan konsentrasi yang
diketahui (disebut titran) ke volume yang
diketahui dari larutan lain dengan
konsentrasi yang tidak diketahui sampai
reaksi mencapai netralisasi, yang sering
ditandai dengan perubahan warna
TAHAP TITRASI
• Jika larutan asam penampung yang
digunakan HCl, sisa asam klorida yang
tidak bereaksi dengan amonia
(membentuk NH4Cl) dititrasi dengan
NaOH
• Jika digunakan indikator PP akhir titrasi
adalah perubahan larutan menjadi merah
mudah permanen (dari asam ke basa)
atau jika digunakan MR larutan berubah
menjadi kuning
• Buat titrasi untuk blanko (tanpa sampel)
 Perhitungan

%N= ml NaOH (blanko-sampel) X N NaOH X 14.008 X 100%

berat sampel (g) X 1000
 Jika larutan penampung adalah asam
borat/HBO3 (asam lemah), banyaknya
asam borat yang bereaksi dengan amonia
dapat diketahui dengan titrasi dengan HCl
0.1N dengan indikator MR+BCG
 HCl akan mentitrasi amonium-borat
menjadi amonium klorida sehingga pada
akhir titrasi terjadi kelebihan HCl/asam kuat
 Akhir titrasi ditandai dengan perubahan
larutan dari biru/hijau menjadi merah muda
Perhitungan
%N= ml HCl (sampel-blanko) X N HCl X 14.008 X 100%
berat sampel (g) X 1000
PERHITUNGAN KADAR PROTEIN

• Dengan mengalikan kadar N dengan

faktor konversi (FK), yaitu

Kadar protein (%) = Kadar N X FK

PENETAPAN SAMPEL
 Timbang 1 gram bahan yang telah dihaluskan dan masukkan
ke dalam labu kjeldahl. Kalau kandungan protein bahan tinggi,
gunakan bahan kurang dari 1 gram. Kemudian tambahkan 7.5
g K2S2O4 dan 0.35 g HgO (Awas: zat ini beracun) dan akhirnya
tambahkan 15 ml H2SO4 pekat.
 Panaskan semua bahan dalam labu kjeldahl dalam almari
asam sampai berhenti berasap. Teruskan pemanasan dengan
api besar sampai mendidih dan cairan menjadi jernih.
Teruskan pemanasan tambahan lebih kurang satu jam.
Matikan api pemanas dan biarkan bahan menjadi dingin.
 Kemudian tambahkan 100 ml aquades dalam labu kjeldahl
yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, juga
tambahkan 15 ml larutan K2SO4% (dalam air) dan akhirnya
tambahkan perlahan-lahan larutan NaOH 50% sebanyak 50 ml
yang sudah didinginkan dalam lemari es. Pasanglah labu
kjeldahl dengan segera pada alat distilasi.
 Panaskan labu kjeldahl perlahan-lahan sampai
dua lapisan cairan tercampur kemudian
panaskan dengan cepat sampai mendidih.
 Distilat ini ditampung dalam erlenmeyer yang
telah diisi dengan 50 ml larutan standar HCl (0.1
N) dan 5 tetes indikator metil merah. Lakukan
distilasi sampai distilat yang tertampung
sebanyak 75 ml.
 Titrasilah distilat yang diperoleh dengan standar
NaOH (0.1 N) sampai warna kuning. Buatlah juga
larutan blanko dengan mengganti bahan dengan
aquades, lakukan destruksi, distilasi dan titrasi
seperti seperti pada bahan contoh.
METODE BIURET

• Pengukuran jumlah ikatan peptida dalam

protein
• Semakin tinggi kadar protein bahan,
jumlah ikatan peptida semakin banyak
• Dasar analisis: bahan yang mengandung
ikatan peptida dua atau lebih membentuk
kompleks berwarna ungu dengan ion
Cu2+/kupri pada kondisi alkali
PREPARASI SAMPEL
 Sampel cair yang jernih: bisa langsung
digunakan atau dilakukan pengenceran
terlebih dahulu
 Sampel cair yang keruh atau mengandung
senyawa pengganggu seperti glukosa:
 Protein diendapkan dengan TCA
 Endapan dicuci dengan eter dan eter
dibuang
 Endapan dilarutkan dalam 4 ml air
Sampel padat:
• Sampel dihancurkan
• Disaring
• Disentrifusa
• Supernatan dianalisis
• Protein yang tertera adalah protein larut air
Cara analisis
• Pembuatan kurva standar
• Penetapan sampel
• Peneraan dengan spektrofotometri
• Perhitungan
Prosedur analisis
Pembuatan kurva standar
 Buat larutan standar BSA atau kasein dalam air dengan
konsentrasi 0.5 mg/ml.
 Masukkan ke dalam tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4,
0.6, 0.8. dan 1.0 ml larutan protein standar. Tambahkan
air sampai volume total masing-masing 4 ml.
 Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dalam masing-masing
tabung reaksi. Campur rata.
 Simpan tabung pada suhu 37C selama 10 menit atau
pada suhu kamar selama 30 menit sampai terbentuk
warna ungu yang sempurna.
 Ukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm.
 Persiapan sampel
• Timbang sampel padat. Hancurkan sampel
padat dengan menggunakan waring blender.
Hancuran yang diperoleh disaring lalu
disentrifugasi. Supernatan didekantasi untuk
dipergunakan selanjutnya (protein yang terdapat
dalam supernatan adalah soluble protein).
• Sampel cair yang berupa protein konsentrat,
isolat yang tidak keruh, maka persiapan sampel
cukup dengan pengenceran saja. Jika cairannya
keruh atau mengandung bahan-bahan yang
menganggu seperti glukosa maka harus
dilakukan perlakuan sebagai berikut:
• Timbang ekstrak. Ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi seperti
pada waktu penetapan standar, kemudian tambahkan air sampai
volume total masing-masing 1 ml.
• Tambahkan 1 ml TCA (Tri Chloroacetic Acid) 10% pada masing-
masing tabung reaksi sehingga protein akan terdenaturasi.
• Sentrifusa pada 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang
terdenaturasi mengendap, supernatan dibuang dengan cara
dekantasi.
• Ke dalam endapan tambahkan 2 ml etil eter, campur merata lalu
sentrifusa kembali untuk menghilangkan residu TCA. Biarkan
mengering pada suhu kamar.
• Ke dalam endapan kering ditambahkan air 4 ml, campur merata.
• Tambahkan 6 ml pereaksi biuret, alkali dalam pereaksi ini akan
melarutkan endapan yang tersisa.
TERIMA
KASIH