ANTIBODI

POLIKLONAL DAN
CARA PRODUKSI
DI TELUR AYAM
Aulia Risqi F. (G4C019016)
S2 SLM Unimus
 BUT,
INTRODUCTION
FIRST ! ^^

Antibodi atau imunoglobulin (Ig), adalah molekul glikoprotein yang

terdapat dalam serum dan diproduksi oleh sel plasma yang
merupakan diferensiasi dari limposit B. Antibodi dibentuk oleh
tubuh sebagai reaksi terhadap antigen yang masuk dalam tubuh.
 “ABOUT ANTIBODY”
 Antibodi dari hasil respon imun terhadap salah satu jenis
antigen mempunyai asam amino yang berbeda dg antibodi
respon imun antigen lain.
 Masing-masing antibodi hanya dapat berikatan dg antigen
yang relevan.
 Bagian antigen yg dapat menimbulkan terjadinya respon
imun dan dapat bereaksi dg produk dari respon imun
tersebut disebut antigen determinan atau epitop.
 “ABOUT ANTIBODY”

 Setiap antigen misalnya protein atau

karbohidrat apabila berada dalam
tubuh vertebrata akan menimbulkan
sejumlah besar klon-klon limfosit yang
berbeda-beda sesuai dengan jumlah
Antibodi Antibodi
epitop yang ada pada antigen tersebut. Poliklonal Monoklonal
 Klon-klon yang terstimulasi akan
berproliferasi dan berdiferensiasi yang
kemudian menghasilkan antibodi yang
terdapat sebagian besar di dalam
serum.
 ANTIBODY
Antibodi Poliklonal:
Antibodi-antibodi
yang berasal dari
berbagai klon 
hanya memiliki
spesifisitas terhadap
epitop tertentu.

Antibodi
Monoklonal:
Antibodi-antibodi
yang diperoleh dari
satu klon trombosit
 ANTIBODY POLIKLONAL

Antibodi poliklonal
adalah campuran
antibodi heterogen
yang berikatan
terhadap berbagai
epitop dari antigen
sama. Antibodi ini
dihasilkan oleh
klon sel B yg
berbeda.
 “P E R B E D A A N”
Antibodi Poliklonal
Tidak mahal dalam pembuatannya
Tidak butuh teknologi yang terlalu
canggih
Waktu produksi relatif singkat
Menghasilkan antibodi nonspesifik
dalam jumlah banyak
Mengenal beberapa epitop pada antigen
Kumpulan yang terbentuk bervariasi
Antibodi Monoklonal
Mahal dalam pembuatannya
Membutuhkan teknologi yang sangat
canggih
Waktu produksi lama karena harus
membentuk hibridoma
Menghasilkan antibodi spesifik dalam
jumlah banyak
Hanya mengenal satu epitop pada
antigen
Setelah hibridoma dibuat konstan dan
sumber yang terbarukan dan semua
kumpulan akan sam
Cara Produksi Antibodi P
oliklonal di Telur Ayam
Hal yang perlu disiapkan :

Galur Bakteri dan Ayam

Media Bakterial

Bahan Penelitian
yang lain
 Cara Produksi Antibodi Poliklonal di Telur Ayam

GALUR BAKTERI DAN AYAM MEDIA BAKTERIAL

Sebagai bahan penelitian adalah Untuk pertumbuhan bakteri

bakteri Salmonella typhiO dan Salmonella typhiO dan
Salmonella typhi H yang diisolasi Salmonella typhi H digunakan
dari pasien di Rumah Sakit media Brain Heart Infusion/BHI
Dokter Kariadi Semarang. Ayam cair (MERCK) dan media Agar
yang diimunisasi dengan protein Base (OXOID).
hemaglutinin adalah ayam petelur
dari galur ISA umur 22 bulan yang
diperoleh dari peternak ayam di
daerah Gunung Pati Semarang.
 Cara Produksi Antibodi Poliklonal di Telur Ayam

BAHAN PENELITIAN YANG LAIN

Bahan” pendukung penelitian ini :
acrylamide dan bis-acrylamide
(electrophoresis grade), amonium persulfat,
TEMED, APS, Glisin, Mercapto Etanol,
Bromophenol Blue, Glycerine, Coomassie
Brilliant Blue R-250 (Sigma), TCA
(MERCK), PEG 6000, NaCl (MERCK),
K2HPO4 (MERCK), Poncoeau, KCL, Tris,
NBT/BCIP (SIGMA), Antibodi anti chicken
IgG (whole molecule) alkalin phospatase
conjugate dari SIGMA, Triton X-100,
Tween-20, Freund adjuvan incomplete,
protein size marker.
 METODE PENELITIAN

4. Isolasi Protein
1. Kultivasi Bakteri
Hemaglutinin

2. Isolasi 5. Uji
Protein Pilli Hemaglutinasi

6. Produksi Antibodi
3. Separasi Protein
Poliklonal Anti
Pilli SDS-PAGE
Protein Hemaglutinin
 1. KULTIVASI BAKTERI
Kultivasi bakteri Salmonella typhi O dan Salmonella typhi H isolat RS. Kariadi Semarang

Menggunakan Satu koloni bakteri dari media Mac

media bifasik Conkey diinokulasikan ke dalam 5
(BHI agar ml media BHI cair, kemudian
ditambah BHI diinkubasi pada suhu 37 C selama
cair). 24 jam dengan agitasi,

setelah itu kultur tersebut digunakan sebagai starter

dimasukkan ke dalam 50 ml media BHI cair diinkubasikan pada
suhu 37 C selama 3 jam dengan agitasi, selanjutnya kultur
tersebut dimasukkan ke dalam media BHI agar miring (dalam
botol pipih), setiap botol untuk 15 ml-20 ml kultur bakteri,
diinkubasi 48 jam pada suhu 37 C tanpa agitasi, kultur siap
dipanen
2. ISOLASI PROTEIN PILI
Tabung sentrifus volume 250 ml
01 disiapkan, kemudian 200 ml
kultur bakteri dimasukkan ke
dalam tabung, ditambah Tricloro
Acetid Acid ( TCA ) hingga
konsentrasinya 3% (6 ml TCA ke
dalam 200ml kultur kuman), dan
diinkubasikan pada suhu ruang
selama 10 menit.
02 kultur bakteri disentrifus 3000
rpm pada suhu 4ºC selama 20
menit, supernatan kemudian
dibuang, dan pelet
diresuspensikan dalam 10 ml
PBS pH 7,4.
2. ISOLASI PROTEIN PILI
Pilli bakteri kemudian dipotong dari
permukaan sel dengan vortex super
03 mixer selama 5 kali 3 menit pada
suhu 4º C, kemudian suspensi
bakteri disentrifus 3000 rpm selama
20 menit pada suhu 4º C.
Supernatan adalah protein pili,
04 kemudian ditambahkan 40 %
ammonium sulfat ke dalam
supernatan, dilarutkan pada suhu 4º
C sampai larut sempurna.
Supernatan disentrifus 3000 rpm
05 selama 20 menit pada suhu 4º C,
setelah itu pelet diresuspensikan
dalam 1 ml PBS pH 7,4.
2. ISOLASI PROTEIN PILI
Untuk menghilangkan ammonium
06 sulfat dari suspensi protein
dilakukan dialisa terhadap PBS
0,5 kali pH 7,4 selama 24 jam,
larutan dialisa diganti 2 kali.

07 Selanjutnya protein hasil dialisa

ditentukan konsentrasinya
dengan menggunakan Biorat
protein assay, diukur OD pada
panjang gelombang 595 nm
menggunakan spektrofotometer (
Bradford, 1970 ).
 3. SEPARASI PROTEIN PILI DENGAN SDS-PAGE
Separasi protein pilli dengan
SDS–PAGE menurut metode
Laemmli ( 1970 ) disiapkan
a.
plat glas, spaser, sisir yang
telah dibersihkan dengan
detergen dan alkohol 70%
untuk pencetak gel.
Setelah alat pencetak gel
disiapkan, dimasukkan 4 ml
larutan 12 % sebagai gel
pemisah, kemudian b.
ditambahkan butanol untuk
menutup permukaan larutan
secukupnya, ditunggu 30-60
Gel dibersihkan dg
menyemprotkan aquades ke
permukaannya, sisir
c. dimasukkan, dan gel
pemampat yang telah disiapkan
dimasukkan pula, ditunggu
selama 30 menit atau sampai
terjadi polimerisasi, sisir
diambil, gel siap digunakan.
Gel yang telah mengalami
polarisasi dipasang pada
d. Biorat mini protein II,
kemudian ditambahkan ke
dalamnya larutan elektroda
bufer pH 8,3.
 3. SEPARASI PROTEIN PILI DENGAN SDS-PAGE
Sampel disiapkan, sampel
ditambah 5x sampel bufer
dengan perbandingan 4:1
e.
(v/v) setelah itu campuran
tersebut dipanaskan selama
2 menit di dalam air yang
telah mendidih, setelah itu
langsung diletakkan di dalam
es.
Sampel selanjutnya siap
dimasukkan ke dalam gel,
setelah itu diberi aliran listrik
dengan tegangan 100 volt f.
hingga bromo phenol blue
keluar dari bagian bawah gel.
Gel diambil, selanjutnya
diwarnai dengan 0,1%
Coomassie Brilliant Blue R-250
g. 30-60 menit hingga pita-pita
protein terwarnai. Selanjutnya
untuk menghilangkan warna
pada gel yg tidak mengandung
protein diberi larutan
destaining, larutan destaining
diganti 3-4 kali hingga gel
tampak bersih.
Untuk menentukan berat
molekul protein yg diinginkan
h. dihitung Rf nya dan diplotkan
pada grafik logaritmik dari Rf
marker protein yg berat
molekulnya telah diketahui.
CONTOH HASIL
SDS-PAGE
4. ISOLASI PROTEIN HEMAGLUTININ

Isolasi protein hemaglutinin dilakukan dengan

elektroelusi.

Protein pilli setelah dielektroforesis dengan 12% SDS-

PAGE akan diperoleh pita-pita protein yang menyusun
pili gel yang mengandung pita protein yang diinginkan
dipotong, kemudian dimasukkan ke dalam kantong
dialisa ynag telah diproses, ditambah kedalamnya
1000µl elektroda bufer untuk setiap 15 pita.

Selanjutnya kantong dialisa dijepit, dimasukkan ke

dalam agaroseelektrophorese apparatus yang telah
diberi elektroda bufer, kemudian dengan tegangan
100 volt selama 15 menit atau sampai semua warna
biru dari Coomassie Brilliant Blue hilang dari gel.
4. ISOLASI PROTEIN HEMAGLUTININ

Kemudian hasil dari elektroelusi dialisa

terhadap elektroda bufer 0,1 kali selama 24 jam,
larutan dialisis diganti 2 kali.

Hasil dialisis kemudian dikering bekukan,

setelah klering dilarutkan dalam PBS.

Suspensi protein siap diuji hemaglutininnya.

 5. UJI HEMAGLUTINASI

Uji hemaglutinasi Selanjutnya plat aglutinasi mikro

eritrosit mencit digoyang perlahan selama 1
dilakukan dengan menit, kemudian diinkubasikan
metode Hanne dan pada suhu kamar selama 1 jam
Finkeltein ( 1982 ). dan diamati terjadinya
hemaglutinasinya.

Sampel diencerkan berganda Titer hemaglutinasi ( HA )

dengan PBS pada plat ditunjukkan dengan kebalikan
aglutinasi mikro dengan volume angka pengenceran tertinggi yg
50µl 0,5 % eritrosit mencit masih menunjukkan adanya
dalam PBS. hemaglutinasi.
 6. Produksi Antibodi Poliklonal
Anti Protein Hemaglutinin

6.1. IMUNISASI 6.2. ISOLASI ANTIBODI 6.3. REAKSI

AYAM POLIKLONAL DARI ANTIGEN
TELUR AYAM ANTIBODI
  Produksi antibodi poliklonal
terhadap protein
hemaglutinin dilakukan
pada tubuh ayam sesuai
metode Gasman et al,
(1990).
 Imunisasi ayam dilakukan
6.1. dengan mneyuntikkan 50 µl
IMUNISASI suspensi protein
hemaglutinin (50µg) dalam
AYAM PBS secara sub kutan yang
dicampur dengan 50µl
adjuvan Freund inkomplit.
Imunisasi diulang pada hari
ke 12,
  kemudian pada hari ke 21
imunisasi diulang dengan
50µl suspensi protein
hemaglutinin (50µg)
dalam PBS yang
dicampur dengan 50µl
adjuvan Freund tidak
6.1. komplit.
 Telur ayam dikumpulkan
IMUNISASI sampai dengan hari ke 40
AYAM setelah imunisasi
pertama. Setelah itu dari
telur ayam dipanen
antibodi poliklonal anti
protein hemaglutinin.
 6.2. ISOLASI
ANTIBODI
POLIKLONAL
DARI TELUR
Kuning telur Selanjutnya kuning Suspensi tersebut
dipisahklan hati- telur disuspensikan disentrifus 12.000
AYAM
hati dari putih dalam larutan rpm selama 10
telurnya, bufer A pH 7,2 menit pada suhu 4º
kemudian dicuci (10,0 mM K2 C, pelet yang
dengan aquades HPO4, 10,0 mM mengandng Ig Y
dan dihilangkan NaCl) kemudian (antibodi)
ulit kuning ditambah larutan disuspensikan
telurnya. 7% PEG 6000 dalam 10 ml bufer
dalam bufer A A (1:1) sehingga
hingga konsentrasi konsentrasi akhir
akhir 3,5 %. PEG adalah 12%.
 6.2. ISOLASI
ANTIBODI
POLIKLONAL
DARI TELUR
Larutan disentrifus Setelah antibodi Selanjutnya
12.000 rpm 10 didialisa keberadaan
AYAM
menit suhu 4º C, kemudian antibodi anti
pelet selanjutnya ditentukan hemaglutinin
disuspensikan konsentrasi dideteksi dengan
dalam 2,5ml bufer protein dengan reaksi antigen
Adan dilakukan metode Bradford antibodi.
dialisa terhadap (1970).
bufer A 0,5 kali
selama 24 jam,
larutan dialisa
diganti 2 kali.
 6.3. REAKSI ANTIGEN ANTIBODI
1. Disiapkan objek
glas yang telah
dibersihkan dengan
alkohol 70 % hingga
bebas dari kotoran
dan bebas lemak.
2. Kemudian diteteskan 5 µl
antibodi poliklonal yang telah
diisolasi dari kuning telur pada
objek glass yang telah tersedia
3. Setelah itu
dicampur dengan 5
µl protein
hemaglutinin yang
telah diisolasi dari
protein pilli dan
dihomogenkan
4. Ditunggu 2-3 menit
kemudian diamati
hasilnya, reaksinya.
 Daftar Pustaka
Asmara, W. dan Darmawati, S., 2001. Isolasi dan Karakterisasi Protein Sub Unit Pilli Pasteurella
multocida Serotipe B:2. Jurnal Pengembangan Peternakan Tropis. Fak. Peternakan UNDIP. Vol. 26
nomor 3
Darmawati, S. Dan Haribi, R, 2005 Analisis Profil Protein Pilli Salmonella typhi Isolat Rumah Sakit
Kariadi Semarang. Jurnal Litbang Universitas Muhammadiyah Semarang, 3(2)
Darmawati, S. dan Haribi, R., 2006. Analisis Molekuler Protein Hemaglutinin Sub Unit Pilli dari
Salmonella typhi O dan Salmonella typhi H. Prociding Seminar Nasional PIT Permi. Surakarta. Agustus
2006
Darmawati, S., 2007. Hambatan perlekatan Salmonella typhi pada Enterosit tikus Putih (Wistar) Oleh
Antibodi Poliklonal Anti protein Hemaglutinin Sub Unit Pilli. Jurnal Litbang Universitas Muhammadiyah
Semarang, 3(2) September 2007
Ehara M, M,Ishibashi, S. Watanabe, M. Iwanaga,. S. Shimotori, dan T. Naito, 1986. Fimbriae of Vibrio
cholerae 01: observation of fimbriae on the organism adherent to the intestinal epithelium and
development of new mwdium to enhance fimbriae. Trop. Med. 28: 21- 23
Eri, DM., 2006. Efek Anti Bakteri RIP dari Biji Momordica charantia Terhadap Salmonella typhi dan
Eschericia coli . Tesis. Program Studi Kedokteran Tropis. Program Pasca Sarjana. Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta.
 Daftar Pustaka
Murini, T., 1998. Isolasi dan Karakterisasi Protein Hemaglutinin Sub Unit Pilli Salmonella typhi. Tesis.
Program Studi Ilmu Farmasi. Program Pasca Sarjana. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
Nakasone, N. dan M.Iwanaga, 1990. Pilli of Vibrio parahaemolitycus. Strain as a possible colonization
factor. Infection and Immunity. 58: 61-69
Nagayama, K. , T. Oguchi, M. Arita dan T. Honda. 1995. Purification and charcterization of a cell –
associated hemagglutinin of vibrio parahaemolyticus. Infection and immunity. 63 : 1987 – 1992
Osek, J., G. Jonson., A.M. Svennerholm dan Holmgren, J. 1994. Role of antibodies againt biotype –
specific Vibrio cholerae pili in protection against experimental classical and Eltor cholera. Infection and
immunity. 62 : 2901 – 2907
Priest, F. dan Austi, B. 1993. Modern Bacterial Taxonomy. Chapman & Hall. London
Punjabi, N.H. 2004. Demam Tifoid dan Imunisasi Terhadap Penyakit ini. U.S. NAMRU-2, Jakarta.
http://www.papdi. Or.id/Imunisasi/demam typhoid dan imunisasi terh.htm
Simanjuntak, C. 1993. Demam Typoid. Epidemiologi dan Perkembangan Penelitian. Cermin Dunia
Kedokteran. Vol. 3:52-53
Thank you