JURNAL BIOTEKNOLOGI

Cloning, Expression and Characterization of Recombinant

Exotoxin A-Flagellin Fusion Protein as a New Vaccine Candidate
against Pseudomonas aeruginosa Infections
Metode Penelitian
1. Strain bakteri dan plasmid.
• Strain P. aeruginosa PAO1 dan 8821M yang digunakan untuk ekstraksi
DNA dan amplifikasi gen exoA dan FliC,
• Strain E. coli DH5α dan BL21 (Novagen, USA),
• plasmid pTZ57R (Fermentas, Lithuania)
• pET22b (Novagen, USA) yang digunakan dalam kloning dan ekspresi
rekombinan.
2. Design Primer
• Primer untuk gen exoA (domain I-II, pengikat dan translocator
domain) dirancang berdasarkan urutan gen exoA P. aeruginosa PAO1.
• Primer untuk fliC dirancang untuk memperkuat N-terminal asam
amino 170 dari urutan gen FliC P. aeruginosa 8821M.
• 1.212 bp N-terminal nukleotida gen exoA dan 510 bp nukleotida N-
terminal dari gen Flic dipilih untuk desain primer (Tabel 1).
3. Ekstraksi DNA dan amplifikasi PCR gen fliC dan exoA
Amplifikasi untuk
exoA didenaturasi
pada suhu 94°C
selama 4 min dan
31 siklus yang terdiri
Gen exoA dan dari 94°C (1 menit),
Genomik DNA fliC 65°C (1 menit), 72°C
Produk PCR dari fliC
diamplifikasi (1 menit) dan
diekstraksi dan exoA berupa gel
ekstensi akhir pada
dengan secara terpisah 72°C (5 menit). yang dimurnikan secara
metode fenol- oleh PCR terpisah dengan
kloroform dalam volume pemurnian kit
25 ml. Untuk fliC (Macherey Nagel,
didenaturasi pada Jerman) dan dianalisis
suhu 94°C selama 4 dengan elektroforesis.
menit, 31 siklus
yang terdiri dari
94°C (1 menit), 58°C
(1 menit), 72°C (1
menit) dan waktu
ekstensi tambahan
pada 72°C (5 menit)
4. Preparasi dan amplifikasi gen fusi exoA-fliC dengan metode PCR.

5 μl produk PCR exoA

dan fliC didinginkan Produk PCR
dan digunakan
dielektroforesis
sebagai template
dalam reaksi PCR pada 1% gel
yang mengandung agarosa dan
forward exoA dan dianalisis dengan
reverse primer fliC.
dokumen gel.

Amplifikasi gen pada Pita PCR yang

suhu 95°C selama 4 berhubungan
menit, 30 siklus yang dengan gen fusi
terdiri dari 94°C (1
dipotong dan
menit), 60°C (60 s),
72°C (1,5 menit) dan dimurnikan dengan
waktu ekstensi pemurnian KIT
tambahan pada 72°C (MN, Macherey
(10 menit). Nagel, Jerman).
5. Kloning dan sekuensing.
• Kloning gen fusi sebagai pembawa ligasi dari produk PCR ke dalam
vektor pTZ57R menggunakan metode kloning TA (Fermentas,
Lithuania).
• Ligasi itu berubah menjadi E. coli DH5a, dan skrining dilakukan
dengan PCR dan analisis restriksi.
• Klon positif dari PTZ-exoA-Flic disekuensing (Eurofins MWG Operon,
Jerman) untuk analisis urutan integritas.
6. Subcloning dan ekspresi protein fusi.

Untuk ekspresi rekombinan protein fusi exoA-fliC dalam E. coli, sisipan dihapus dari PTZ-exoA-fliC
vektor oleh pencernaan dengan enzim Xhol dan disubkloning ke dalam vektor pET22b.

Struktur pET22b exoA-fliC diubah menjadi E. coli BL21

Kultur di LB broth yang mengandung ampisilin dan diinkubasi pada 37°C dan disentrifuse 15
rpm/min. Dalam kerapatan optik sama dengan 0,5 (600 nm), kultur diinduksi dengan
penambahan 1 mM IPTG dan dilanjutkan selama lebih empat jam.

Sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6.000 ×g selama 3 menit dan ekspresi
protein dianalisis menggunakan SDS-PAGE.
7. Preparasi sel Lisat dan analisis kelarutan dari ekspresi Protein
Setelah 18 jam, dipindahkan
E. coli BL21 yang mengandung
ke kaldu LB 100ml yang
vektor pET22b exoA-fliC
mengandung ampisilin dan
dikultur di 10 ml LB broth
diinkubasi pada 37°C dan
dilengkapi dengan ampisilin.
disentrifuse 250 rpm.

Dalam optik kepadatan Eua = 0,5

(600 nm) 1 mM IPTG ditambahkan
ke kultur dan inkubasi dilanjutkan
selama dua jam di 37°C dan
disentrifuse lagi 250 rpm.

Pellet bakteri dikumpulkan dengan

sentrifugasi pada 7000 ×g selama
10 menit, dilarutkan dalam 3 ml
buffer lisis dan disonikasi dalam es
(20 detik, 80%, 10 periode).
8. Pemurnian protein dari inklusi.

Metode Ni-NTA kromatografi Pemurnian

afinitas (Qiagen, Chatsworth, menggunakan 8 M
CA, USA) digunakan urea untuk
pemurnian protein fusi.
didenaturasi.

Sonikasi pelet dicuci 3 ×

dengan PBS + 1% Triton X-
100 dan dilarutkan dalam
4-6 ml 8 M urea lisis buffer.

Supernatan kemudian Kontaminasi protein tercuci di

dicampur dengan 2 ml resin, kolom menggunakan wash
diinkubasi pada suhu kamar buffer (20 mM natrium fosfat,
selama 30 menit dan ditransfer 300 mM NaCl, 50 mM
ke kolom kromatografi. imidazol, pH 8,0).
9. Western-blotting
Protein
• Western-blotting digunakan untuk mengevaluasi sifat imunologiInfeksi
Kemudian, dariP.
rekombina
protein fusi rekombinan exoA-fliC.
reaktivitas aeruginosa pada
pasien ini adalah
n protein
nosokomial dan
dipisahkan rekombinan
infeksi obat
dengan multi-resisten.
pada SDS- antibodi P. HRP-
PAGE gel aeruginosa terkonjugasi
dan exoA (Sigma anti-IgG kelinci
Nomor Produk (1: 5000), HRP-
ditransfer terkonjugasi
P2318) dan
ke sera (1: 2000)
anti-IgG manusia
(1: 5000) dan
membran dari pasien DAB substrat
PVDF oleh dengan infeksi yang digunakan
blotting P. aeruginosa untuk deteksi
• Sampel darah
semi-dry. sistemik dan lokal dianalisis
pasien dengan infeksi P. reaksi. yang
aeruginosa
diperoleh dari Rumah Sakit Sina (Tabriz).
Hasil
1. Amplifikasi PCR dari gen exoA
dan Flic gen P. aeruginosa
PCR amplifikasi gen exoA (domain
I dan II) dari strain P. aeruginosa
PAO1 dan gen fliC dari strain P.
aeruginosa 8821M menghasilkan
produk PCR dari 1212 bp dan 510
bp
2. Persiapan gen fusi exoA-Flic
melalui overlapping PCR.
PCR amplifikasi gen fusi exoA-Flic
menggunakan forward exoA dan
reverse fliC primer menghasilkan
fragmen 1722 bp (pada gambar).
Sekuensing gen fusi setelah
kloning ke vektor pTZ57
dikonfirmasi integritas dan
masuk kedalam gen fusi exoA-
fliC.
 Ekspresi rekombinan
protein fusi exoA-flagellin
Untuk ekspresi tingkat tinggi protein fusi
exoA-Flic dalam E. coli, sisipan telah dihapus
dari vektor kloning PTZ-57 dan subcloned ke
vektor pET22b (gbr 3)
Gambar 4 menunjukkan pewarnaan
Coomassie biru pada gel SDS PAGE dari
kultur E. coli sebelum dan sesudah induksi.
Rekombinan protein fusi exoA-Flic
diekspresikan sebagai protein 63-kDa dalam
konsentrasi tinggi.
Pemurnian dari tagged protein fusi dengan
kromatografi afinitas Ni-NTA menghasilkan
protein yang sangat murni yang muncul
sebagai band tunggal dalam analisis SDS
PAGE dari protein yang dimurnikan
 Hasil Western-Blot
Analisis western-blott menunjukkan
rekombinan exoA-Flic direaksikan
dengan antibodi terhadap antibodi
exoA asli (Gambar. 5). Temuan ini
diverifikasi dengan struktur
konformasional yang benar dari
protein rekombinan yang diproduksi di
E. coli. Analisis untuk reaktivitas
protein fusi rekombinan untuk serum
dari pasien dengan infeksi P.
aeruginosa menunjukkan bahwa
semua serum mengandung antibodi
terhadap exoA-Flic dan mereka sangat
bereaksi terhadap protein rekombinan
(gbr 6)
 PEMBAHASAN
• P. aeruginosa adalah penyebab utama kedua dari infeksi nosokomial yang sering resisten
terhadap sebagian besar antibiotik yang umum digunakan. Berbagai pendekatan baru telah
diselidiki untuk memerangi infeksi pseudomonas. Di antara mereka, imunoterapi dan
pengembangan vaksin tampaknya menjadi terapi dan alat pencegahan yg menjanjikan. Penelitian
ini mengusulkan exoA dan Flic P. aeruginosa sebagai calon vaksin penting.
• Dalam penelitian ini, gen fusi exoA-Flic disiapkan dengan metode overlapping PCR dan
menunjukkan bahwa metode ini cepat, mudah dan hemat biaya untuk persiapan protein fusi.
Temuan ini konsisten dengan laporan sebelumnya tentang keuntungan dari overlapping PCR
untuk produksi gen fusi.
• Ekspresi protein fusi rekombinan dengan E. coli menggunakan vektor pET22b mengakibatkan
produksi protein fusi exoA Flic dalam konsentrasi tinggi, dan muncul pita di SDS PAGE sekitar 63-
kDa. Analisis Western blot menunjukkan-reaktivitas protein fusi exoA-Flic dengan antibodi
terhadap exoA asli, yang menegaskan struktur yang benar dari protein fusi rekombinan. Temuan
ini menunjukkan bahwa sistem ini adalah sistem ekspresi yang cocok untuk produksi protein fusi
exoA-Flic rekombinan.
• Serum dari pasien yang terinfeksi dengan P. aeruginosa dikenali protein
fusi rekombinan dalam pengenceran 1: 2000. Hasil ini menunjukkan
bahwa exoA dan Flic P. aeruginosa adalah imunogenik selama infeksi
dan serum semua pasien bereaksi dengan protein rekombinan. Hasil ini
juga menunjukkan bahwa protein fusi ini mungkin digunakan sebagai
antigen serodiagnostic untuk diagnosis cepat infeksi P. Aeruginosa
• Kesimpulannya, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa protein fusi
exoA-Flic disiapkan dalam penelitian ini adalah molekul yang sangat
antigenik yang dapat dianggap sebagai kandidat vaksin baru untuk
evaluasi lebih lanjut pada model binatang