Prosedur Diagnostik

Molekuler

TIM MK BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

 Definisi

Diagnosis molekuler merupakan metode diagnosis yang bertujuan untuk memahami

mekanisme molekuler suatu penyakit pada setiap individu pasien (personalized
medicine/dentistry). Metode ini akan sangat menguntungkan dalam peningkatan keamanan
penghantaran obat dan keefektivan terapi pada berbagai penyakit di masa mendatang.
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip kerjanya
memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis. Tehnik PCR telah dikembangkan untuk
diagnosis berbagai penyakit infeksi, seperti Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M.
Tuberculosis.

Teknologi polymerase chain reaction ( PCR) yang ditemukan Kary Mullis pada era 1980an, Mullis
memikirkan strategi dengan mencampur kedua primer dengan DNA genom terdenaturasi, untuk mengujinya
pada sampel manusia. Mullis kemudian menyadari dengan penggunaan DNA polimerase berulang akan
memicu reaksi berantai yang akan memperkuat segmen DNA tertentu, sehingga pada akhirnya ini menjadi
bagian dari teknologi yang disebutnya sebagai PCR tes.
Tahapan-tahapan Diagnostik Molekuler
EkstraksiDNA
Amplifikasi DNA PCR dan Real-Time PCR
Elektroforesis
Ekstraksi DNA

11
Ekstraksi DNA
• adalah Proses isolasi dan purifikasi DNA
Tujuan :
 Untuk mendapatkan DNA yang akan digunakan Pemanfaatan :
untuk uji lebih lanjut, seperti :
 PCR (polymerase chain reaction) • Untuk ekstraksi :
• DNA mitokondria
 RFLP (restriction fragment length • DNA genom
polymorphism) • DNA Plasmid
 Southern Blotting
 Sekuensing
 Kloning
 Genetic modified organism (GMO)-pertanian,
farmasi
 Lingkungan, Biodefense
 Diagnosis penyakit
 DNA profiling
 dll
Spesimen/ Jenis sel :

13
Komponen penting Prosedur ekstraksi DNA?
1. Memaksimalkan recovery DNA
2. Menghilangkan inhibitor Vortex
Vortex
Nucleas
Nucleas
3. Menghilangkan atau menghambat ee DNA terdegradasi
Sonikasi
Sonikasi
nuklease
4. Memaksimalkan kualitas DNA ETOH
ETOH
EDTA
EDTA
Phenol
Phenol
Chloroform
Chloroform
Jumlah DNA yang dapat di Recovery
 Satu sel diploid mengandung + 6 pg DNA
 Sperma mengandung : + 3 pg DNA
 Sel darah putih pd orang dewasa : 5 - 10 X 106 sel per ml darah 
teoritis dari 1 µl darah dapat diisolasi 30 - 60 ng.

Contoh yield yg dihasilkan oleh AccuPrep® Genomic DNA Extraction

Kit

Sufficient cell collection is critical for success.

Konsentrasi DNA yangdiperlukan untuk uji :
 RFLP minimial 50 ng  2 ul darah
 PCR : rata-rata 1 ng DNA  setara dengan 1/20 1 ul darah,
atau 350 sperma.

16
 Pemilihan Metode Ekstraksi DNA tergantung pada :

Jumlah dan berat molekul DNA

Kemurnian DNA yang diperlukan untuk pengujian

Waktu dan harga

Waktu dan harga

 Protokol dasar ekstraksi DNA
• Beragam teknologi dan metode esktraksi DNA
• Ekstraksi DNA terdiri dari 2 bagian
menghilangkan
kontaminasi protein,
Lisis sel dan
RNA atau Recovery DNA
solubilisasi DNA
makromolekul secara
enzimatik atau kimia

18
 Overview of DNA Extraction

Menghancurkan dinding Sentrifugasi untuk Protease Presipitasi DNA dengan

dan membrane sel memisahkan bagian isopropanol
padatan dengan DNA

Sentrifugasi untuk memisahkan

DNA dengan garam dan gula

Melarutkan DNA Cuci pellet DNA dengan

Ethanol dan mengerinkan
pellet DNA
1. Lysis Membran sel
Cell Lysis Buffer : Tris-Cl, Non-ionic detergent
(SDS), EDTA

 Tris buffer menjaga pH supaya DNA stabil

 1% SDS untuk membuka membran sel dan inti sel  DNA
masuk dalam cairan. (SDS menyebabkan denaturasi protein
sehingga lbh peka terhadap protease)
 EDTA merupakan agen pengkat Mg2+. Mg2+ adalah
kofactor Dnase nuclease

20
  Untukmerusak protein inti sel yang
mengikat DNA dan merusak ensim sitoplasma
yang merusak dan memotong DNA (nuclease)
2. Penambahan
Protease  Penambahan protease meningkatkan jumlah
DNA utuh saat ekstaksi
 Phenol/Chlorform – metode standard untuk menghilangkan protein dari
asam nukleat
 Fenol : denature protein; sangat korosif dandapat menyebabkan luka
serius
 Chloroform  mendenature protein dan menstabilkan interface antara
lapisan aquaeus dengan lapisan organic sehingga mempermudah
pemisahan . Chloroform juga untuk membersihkan fenol
Mix thoroughly with Aqueous
an equal volume of
organic solvent Centrifuge Collect aqueous phase
e.g. phenol, chloroform, or
Interphase
phenol:chloroform
Organic

Perform additional extractions for increased purity

Crude lysate containing The aqueous phase contains water-

nucleic acids and other soluble molecules, including nucleic acids.
cell constituents Proteins and lipids become trapped in the
organic phase, and are thus separated
away. Insoluble debris become trapped in
the interphase between the two layers
Presipitasi DNA :

Penambahan garam

Larutan Protease mengandung garam

Ion Na+ ( NaCI ) berikatan dengan group
fosfat molekul DNA yang akan menetralisisr
muatan negative molekul DNA

 Penambahan NaCl akan menyebabkan DNA

untuk ‘berkumpul’ sehingga proses
presipitasi lbh mudah terjadi pada saat
penambahan alcohol.
Penambahan Alkohol dingin / Isopropanol
 DNA tidak larut dalam alcohol
 Penambahan alcohol menyebabkan DNA akan menggumpal
 DNA terpresipitasi akan nampak seperti serabut benang halus

Before After

Supernatant 70% EtOH

Centrifuge Wash Centrifuge

Pellet

Add alcohol and salt to
precipitate nucleic acids
from the aqueous fraction
Dissolve pellet
(H2O, TE, etc.)
• Pellet down nucleic acids.
• Wash pellet with 70% ethanol to remove
residual salts and other contaminants.
• Discard ethanol and allow pellet to dry.
 Kolom Silika
• Kolom mengandung SiO (silica oxide)
• Silica dapat mengikat DNA jika ada agen chaotropic (Guanidine HCL,
Sodium iodide, Sodium perclorate).
• Agen chaotropic akan menganggu lingkungan hidrasi di SiO sehingga SiO
akan bermuatan positif.

• SiO  mengikat DNA

DNA murni
 Kemurnian DNA :

Rasio A260/A280 ratio is ~1.8 for dsDNA. Ratios lower than 1.7 usually indicate significant protein
contamination.

The A260/A230 ratio of DNA and RNA should be roughly equal to its A260/A280 ratio (and therefore ≥
1.8). Lower ratios may indicate contamination by organic compounds (e.g. phenol, alcohol, or
carbohydrates).

Turbidity can lead to erroneous readings due to light interference. Nucleic acids do not absorb
light at the 320 nm wavelength. Thus, one can correct for the effects of turbidity by
subtracting the A320 from readings at A230, A260 and A280.

 Spektrofotometer
 Analisis gel agarose
Analisis gel agarose

 Elektroforesis : prosedur memisahkan makromolekul berdasarkan

kecepatan pergerakan makromolekul tersebut di agarose dibawah
medan listrik

 Yang mempengaruhi kecepatan pergerakan makromolekul DNA/RNA

 Ukuran
 Bentuk (DNA linier/sirkuler)

 DNA/RNA bermuatan negative

 Buffer : sumber ion untuk pergerakan DNA
DNA
DNA bermutan negative  pada saat
ada aliran listrik akan bergerak dari
kutub negative ke kutub positif

Polymerized agarose is porous,

allowing for the movement of % Agarose (w/v) Size Range (kb)
DNAScanning Electron Micrograph of Agarose Gel 0.5 2 - 30
(1×1 µm) 0.75 0.7 - 20
1.0 0.5 - 10
1.5 0.2 - 3
2.0 0.1 - 2
Visualizasi DNA

Monitor pada saat electrophoresis :

 Tracking dyes are visible to naked eye
during run
→ Xylene cyanol (migrates with ~5.0 kb fragments)
→ Bromophenol blue (migrates with 300 bp
fragments)
→ Orange G (migrates with fragments of ~50 bp)
But
 Mobility of tracking dyes can vary
substantially depending on agarose
→ Concentration
→ Type
 Vizualisasi DNA setelah running
EtBr

Karsinogenik
Tidak aman untuk manusia dan lingkungan
Limbah : penanganan khusus
Ladder
A B C D E
Poly Chain reaction
(PCR) dan Quantitative
PCR (qPCR)
PCR simple idea
 Polymerase Chain Reaction: Kary Mullis (1983)
 Metode invitro untuk mensintesa DNA menggunakan ensim
(DNA polymerase)
 Memerlukan primer yang akan menempel pada 2 untai sense dan
anti sense DNA
 Pengulangan siklus (denaturing, primer annealing dan extention)
 akumulasi produk PCR (Amplikon)
 Jumlah amplicon = 2 pangkat siklus (20 siklus)  220≈106 kopi
Bahan PCR
 DNA template
 Primers
 Enzyme
 dNTPs
 Mg2+
 buffers
 PCR vs q PCR
- Sensitivitas rendah - Sensitivitas tinggi
 Resolusi rendah  Resolusi tinggi
 Tidak otomatis  otomatis
 Membedakan ukuran amplicon  Membedakan kuantitas DNA/RNA
 Hasil tidak menunjukkan jumlah template
(kuantitas)  didasarkan pada  Intepretasi oleh mesin -> otomatis
intepretasi personal
 Analisis ‘End point’
Manfaat q PCR (Real-Time PCR)

 Menghitung jumlah DNA dalam suatu sample

 perbedaan allel
 SNIP single nucleotide polymorphism
 Ekspresi suatu gen di sel
 Prinsip Real-
time

• Didasarkan pada deteksi

dan kuantifikasi reporter
fluorescent
• Fokus utama analisis
adalah : siklus/waktu
pertama dimana terjadi
peningkatan jumlah PCR
produk yang significant
• Siklus atau waktu tersebut
akan berbanding terbalik
dengan jumlah DNA
template/cetakan
Baseline = fluoresensi basal pada tahap awal PCR Daftar
(background fluorescent)
Istilah
Threshold = tingkat fluorescent tertentu yang di set
diatas baseline ( nilai cutoff secara statistic
ditentukan diatas background fluorescent )

Rn = normalized Reporter signal, tingakt fluorescent

yang terdeteksi selama proses PCR. Dihitung dengan
membagi reporter dengan passive reference signal
(ROX)

Ct = threshold Cycle, siklus PCR dimana adanya

peningkatan fluorescent diatas sinyal baseline PCR
yang pertama kali terdeteksi.
 Bagaimana melakukan Pengukuran DNA
di dalam reaksi PCR
Menggunakan reagen yanga bisa berfluoresensi saat
terjadi amplifikasi DNA

Pewarna DNA Probe

• Ethidium bromide dan SYBR Green I
dye merupakan reagen yang dapat
digunakan unutk hal tersebut
• Mereka dapat mengikat DNA untai
ganda dan menghasilkan warna
pada Panjang gelombang tertentu
• SYBR Green I dye fluoresces lebih
terang dibandingkan ethidium
• untai DNA tunggal yang spesifik
untuk target dan mengandung
fluorophore
• Jenis probe :
• Hydrolysis (TaqMan) probes
• Molecular beacons
• Dual hybridization probes
• Eclipse probes
• Amplifluor assays
• Scorpions PCR primers
• LUX PCR primers
• QZyme PCR primers
 Kelebihan dan Kekurangan
Diagnostik Molekuler
KEKURANGAN
1. Mudah terkontaminasi.
2. Biaya peralatan dan reagen
mahal.
3. Iterprestasi hasil yang
KELEBIHAN positif belum tervalidasi
Beberapa kelebihan diagnostik untuk semua penyakit
molekuler adalah kecepatan infeksi (misalnya infeksi
dan hasil yang sangat spesifik pasif atau laten).
(tepat), dapat mendeteksi 4. Teknik prosedur yang
sampai pada tingkat molekul kompleks dan bertahap
DNA (gen), mendeteksi membutuhkan keahlian
berbagai patogen yang tidak khusu untuk melakukanya.
dapat di kultur, tersedianya
data base membuat diagnostik
menjadi jauh lebih baik, dan
dilakukan dengan metoda yang
tidak invasive sehingga dapat
memberikan kenyamanan pada
pasien yang bersangkutan.
 Prosedur Diagnostik
Molekuler

PROSEDUR KUANTITATIF ONE STEP REAL TIME RT-PCR

UNTUK VIRUS H7N9
Tujuan : Mendeteksi Keberadaan Materi Genetik Virus A H7N9 Menggunakan Metode Real Time RT-PCR
Referensi : WHO Collaborating Center for Reference and Research on Influenza Chinese National Influenza Center National
Institute for Viral Disease Control and Prevention, China CDC, 2013
Nama Kit : AgPath one-step RT-PCR kit
Peralatan
A. Bahan
1. Sentrifuge Spin Down
1. 25x RT-PCR enzyme mix Suhu -200C
2. Mikro pipet (200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl)
2. 2X Reaction Mix Suhu -200C
3. Cold block
3. 200 µl PCR tube Suhu Ruang
4. Mesin Real Time PCR
4. RNAse free water Suhu Ruang
5. 1,5 ml eppendorf tube Suhu Ruang
6. Aerosol Barier Tips (1000 µl,
7. 200 µl, 100 µl, 20 µl, 10 µl) Suhu Ruang
 Lanjutan..
C. Cara Kerja
1. Siapkan reagen RT-PCR Mix dengan menambahkan komponen-komponen dibawah ini ke dalam tabung reaksi steril 1,5
ml
o Nuclease Free Water 5.0
o 2X PCR Master Mix 12.5
o Primer F (40 µM) 0.5
o Primer R (40 µM) 0.5
o Probe (20 µM) 0.5
o Enzim RT/DNA Polymerase 1
2. Untuk menyiapkan RT-PCR Master Mix lebih dari satu reaksi, kalikan jumlah dalam kolom “volume” di atas dengan
jumlah reaksi yang dibutuhkan ditambah 2 reaksi sebagai cadangan.
3. Campur semua komponen tersebut dan disentrifuge beberapa detik, kemudian aliquot ke dalam plate 96 well atau tabung
strip 8 well masing-masing 20 µl.
4. Tambahkan kedalam tabung yang telah diisi master mix tersebut NTC (negative template control), specimen RNA, Mock
dan Kontrol Positif (Standard RNA) sebanyak 5 µl.
5. Tutup tabung dengan sealer atau strip cap sampai rapat, jangan sampai ada gelembung dan celah terbuka untuk
menghindari penguapan dan kontaminasi. 6. Tabung tersebut siap untuk dimasukkan ke dalam mesin Real Time Thermal
 Lanjutan..

a. Reverse Transkriptase : 45˚C 10 Min

b. Inaktivasi Inhibitor Taq : 95˚C 10 Min
c. Amplifikasi PCR, (45 CYCLE) :
- 95˚C 15 Det
- 60˚C 45 Det (Baca Real Time/Collection Data)
7. Tampilkan hasil dan periksa nilai Ct maupun kurva amplifikasi, pengaturan analis untuk baseline
dan threshold diatur secara otomatis oleh komputer ataupun manual.
8. Sampel dinyatakan positif bila nilai Ct < 38dan negatif bila nilai Ct > 40. Tes dinyatakan valid
jika hasil pada positif kontrol menunjukkan hasil positif dan negatif kontrol menunjukkan hasil
negative.