TEKNIK KROMATOGRAFI

Oleh : Hamdhan Fathony

No. BP : 2020412003
 PENDAHULUAN

Di antara teknik analisis, kromatografi planar (baik kertas maupun

kromatografi lapis tipis) tetap menjadi metode pemisahan yang
menarik karena keuntungan yang tak terbantahkan termasuk
kemudahan, hemat biaya, persiapan sampel minimum yang
diperlukan, kemungkinan menganalisis beberapa sampel pada
waktu yang bersamaan, dan relatif konsumsi pelarut lebih sedikit
dibandingkan dengan metode pemisahan lainnya. Selain itu, fase
diam baru digunakan untuk setiap pemisahan dalam kromatografi
planar, sehingga sampel yang tidak dibersihkan dapat diterapkan
ke fase diam tanpa memerlukan langkah pembersihan sampel.
Karena kelebihan ini, kromatografi kertas masih digunakan di
laboratorium yang berbeda, misalnya untuk pemantauan kendali
mutu makanan dan obat .
Berbagai teknik analitik telah dikembangkan dan digunakan untuk
menentukan individu dan campuran pewarna makanan sintetis
dalam berbagai matriks seperti enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) , teknik elektroanalitik, spektrofotometri, metode
kolorimetri, elektroforesis kapiler , kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) , dan kromatografi lapis tipis (KLT) . Beberapa teknik ini
memungkinkan mencapai sensitivitas dan resolusi tinggi pewarna
makanan, meskipun secara ekonomi mahal dan biasanya
memerlukan beberapa langkah ekstraksi dan sampel sebelum
perlakuan yang memakan waktu. Semua langkah ini memiliki
potensi untuk mempengaruhi hasil analitis dengan hilangnya
sebagian kecil analit dan peningkatan pelarut beracun dan
konsumsi labor.
Di sini, penerapan TLC μPAD 3 dimensi yang dirancang, sebagai
perangkat analitik yang murah, portabel, dan dapat dibuang untuk
pemisahan dan penghitungan cepat dua pewarna azo, Tartrazine
(E102) dan Indigo carmine (E132), sebagai analit model.
 MATERIAL DAN METODA

chemical

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kemurnian tertinggi yang tersedia: pewarna
makanan sintetis Tartrazine (E102) dari Acros, natrium bikarbonat dari Interchem INC, Glisin dari
AnalaR, etanol dan aseton dari Panreac, serta asam asetat dan asam borat dari BDH. Kertas
kromatografi Whatman grade 2 (ukuran pori 8 μm dan ketebalan nominal 190 μm), dimetil
sulfoksida (DMSO), dan asam N-sikloheksil-3-aminopropanesulfonat (CAPS.) Dibeli dari Sigma-
Aldrich. Semua reagen lainnya (Indigo carmine (E132), sodium carbonate, KNO3, NaOH, n-hexane,
methanol, acetonitrile, ammonia, isopropyl alcohol, phosphoric acid, dan 1-propanol) memiliki
kualitas analitik dan dibeli dari Merck. Semua larutan disiapkan dalam air deionisasi.
Peralatan

Perangkat yang digunakan dalam metode ini terdiri dari printer (HP
laserjet1320), mikropipet Merk (Wertheim), oven (Memmert), dan pemindai
desktop flatbed (Canon, CanoScan LiDE 700F). Pengukuran pH dilakukan
dengan Metrohm 780 pH-meter menggunakan elektroda kaca gabungan.
Terakhir, digunakan cetakan kaca untuk menampung μPAD, yang dibuat di
toko kaca lokal.
Sistem HPLC (Knauer Azura) terdiri dari pompa biner, injektor manual,
degasser, dan detektor UV-vis, yang dikontrol oleh perangkat lunak
ClarityChrom
 Larutan

Larutan stok pewarna makanan (10,0 g L – 1 E132 dan 100,0 g L – 1 E102) disiapkan dengan melarutkan jumlah yang
sesuai dalam air suling ganda. Campuran biner analit yang diperlukan serta buffer dibuat setiap hari. Konsentrasi
pewarna dalam campuran berkisar antara 0,010 hingga 30,0 g L – 1 untuk E102 dan 0,010 hingga 10,0 g L – 1 untuk
E132.
Sampel asli adalah produk komersial yang biasanya dijual di toko grosir lokal (Shiraz, Iran). Mereka termasuk bubuk
jelly padat, dan permen (Farmand; Iran), minuman ringan seperti limun & Aloe Vera (Parto Baran Asia, Iran),
minuman jus apel (Golden Max, Iran), air berkarbonasi (Khoshgovar. Iran), dan berkarbonasi minuman jeruk (Pepsi
Persia, Iran). Untuk menyiapkan larutan encer dari sampel permen, sampel tersebut digiling dalam mortar dan 15 g
bagian bahan yang diarde dilarutkan dalam air deionisasi dalam labu ukur 100 mL (25 ° C). Larutan sampel jelly
dibuat dengan melarutkan 25 g sampel 100 mL air deionisasi, secara langsung dan tanpa penggilingan.
Desain dan fabrikasi perangkat berbasis kertas

Pola perangkat yang diinginkan (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1)

digambar di AutoCAD 2015 dan kemudian dicetak dengan laser pada kertas
filter yang telah dicuci sebelumnya. Setiap kotak hitam (1,0 cm2) mewakili
lapisan perangkat origami. Area hitam yang dicetak membuat kertas menjadi
hidrofobik; menyimpan kertas cetakan dalam oven 200 ° C selama 40 menit
menyebabkan partikel tinta meleleh dan menyumbat pori-pori kertas.
Lingkaran putih (diameter 3,0 mm) menunjukkan saluran hidrofilik (kolom
kromatografi). Perlu dicatat bahwa pola kertas dengan pencetakan laser sisi
ganda awalnya disarankan oleh Dey et al. [38]. Dengan modifikasi prosedur
dalam kelompok penelitian kami, kami dapat menggunakan pencetakan satu
sisi untuk hidrofobisasi dan pola kertas.
 Prosedur analitis untuk pemisahan campuran
pewarna makanan dengan μPAD

Prosedurnya ditunjukkan secara skematis pada Gambar 1. Saluran hidrofilik 3 dimensi dibuat menggunakan 23 lapis
kertas. Alikuot 0,5 μL dari larutan analit (campuran E102 dan E132 atau larutan individualnya) disuntikkan ke lapisan
kedua dan setelah kertas dikeringkan, kertas dilipat menjadi origami 3D μPAD. Ukuran μPAD yang dihasilkan adalah
1.0 × 1.0 × 0.5 cm. Setelah itu, μPAD dipasang di antara dua pelat kaca persegi panjang yang dihubungkan dengan
baut dan mur. Melalui pori yang tertanam di tengah pelat kaca, fase gerak diterapkan dengan mikropipet.
Pengembangan kromatografi dilakukan pada suhu lingkungan.
Untuk semua percobaan, setelah menyelesaikan proses pemisahan, μPAD dipaparkan ke udara hingga kering. ΜPAD
yang tidak terlipat dipasang pada selembar kertas menggunakan pita perekat dua sisi. Kemudian dipindai oleh
pemindai digital beberapa kali berturut-turut (minimal 3 kali) dan gambar digital disimpan dalam format JPG.
Kemudian, gambar rata-rata dihitung [39] menggunakan perangkat lunak MATLAB. Nilai rata-rata elemen warna RGB
atas piksel di seluruh lingkaran di setiap lembar digunakan sebagai sinyal analitik. Untuk mengabaikan efek timbal
balik dari lapisan yang berdekatan, yang dilampirkan secara langsung, nilai warnanya diringkas. Kromatogram
diperoleh dengan memplot intensitas warna di atas nomor lapisan.
Kondisi kromatografi HPLC

Untuk mengevaluasi hasil perangkat, HPLC sebagai teknik yang paling umum
digunakan untuk penentuan pewarna sintetis dalam bahan makanan
digunakan. Pemisahan dicapai dengan menggunakan Eurosfer 100-5 C18
Kolom 250 × 4,6 mm (Knauer), dan elusi isokratik dengan air: metanol (1: 1).
Laju aliran diatur pada 1,0 mL menit -1, dan volume injeksi adalah 10 μL.
Panjang gelombang deteksi detektor, yang sesuai dengan penyerapan
maksimum pewarna, ditetapkan pada 427 nm dan 608 nm untuk Tartrazine
dan Indigo carmine, masing-masing. Sentrifugasi larutan dilakukan selama 20
menit pada 3000 rpm dan supernatan disaring melalui membran nilon
berukuran pori 0,22 μm sebelum diinjeksikan ke kolom HPLC. Setiap
percobaan diulang tiga kali untuk larutan campuran warna standar dan
sampel nyata.
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Sebelum dilakukan pemisahan kromatografi, keterbasahan permukaan μPADs ditentukan oleh sudut kontak
permukaan-cair. Area putih μPAD menunjukkan sudut kontak kecil (31,59 °) menunjukkan keterbasahan tinggi,
sedangkan sudut kontak besar (90 °) menunjukkan keterbasahan rendah (atau hidrofobisitas tinggi) dari bagian hitam
dari pola yang dicetak (Gbr. S3, mendukung informasi).
TLC berbasis 3D μPAD digunakan untuk pemisahan dan kuantisasi E102 dan E132 sebagai analit model. Namun, dapat
diterapkan untuk memisahkan pewarna yang larut dalam air lainnya dengan memilih fase gerak yang tepat. Gambar
μPAD sebelum dan sesudah pemisahan kromatografi dari masing-masing anlyte dan campurannya diberikan pada
Gambar. 2. Kromatogram yang dihasilkan juga diberikan dalam Gambar ini. Seperti yang ditunjukkan, Indigo carmine
(pewarna biru) berhenti setelah melewati beberapa lapisan pertama, sedangkan Tartrazine (pewarna kuning) lebih
terkonsentrasi di tengah jalur kolom. Intensitas warna pada lapisan kedua dan kedelapan masing-masing dapat
digunakan untuk kuantitasi Indigo carmine dan Tartrazine. Perlu dicatat bahwa gambar dan plot yang ditunjukkan
pada Gambar. 2 diperoleh setelah pengoptimalan.
Optimasi kondisi eksperimental

Biasanya, jumlah fasa gerak serta waktu pemisahan berhubungan dengan

diameter saluran. Kami mencoba menggunakan diameter saluran sekecil
mungkin. Dengan demikian, saluran dengan diameter 1, 3, 5, 7, dan 9 mm
diperiksa. Seperti yang diharapkan, dengan mengurangi lebar saluran, jumlah
fase gerak untuk mengisi seluruh volume saluran berkurang dan pada saat yang
sama waktu yang dibutuhkan untuk mengisi saluran juga berkurang. Namun
untuk diameter 1 mm membutuhkan injeksi fasa gerak dan larutan sampel yang
sangat presisi agar tidak keluar dari bagian hidrofilik. Untuk menurunkan
ketidaktepatan dalam percobaan, diameter saluran 3 mm digunakan untuk
penelitian selanjutnya. ΜPAD dengan ukuran ini membutuhkan fase gerak 12,0
μL dan dibutuhkan waktu 35 detik untuk fase gerak dari lapisan pertama ke
lapisan terakhir.
 Analisis kuantitatif pewarna makanan

Reproduksibilitas dan ketepatan metode yang diusulkan

dinilai dengan menganalisis hasil larutan standar dalam
sehari dan antar hari untuk tiga konsentrasi E132 (1.0, 3.0,
dan 10.0 g L − 1) dan E102 (0.70, 5.0, dan 15,0 g L − 1).
Untuk menentukan pengulangan intra hari dilakukan lima
kali pengukuran berturut-turut (n = 5) selama sehari,
sedangkan pengukuran penentuan pengulangan antar hari
dilakukan dalam lima hari berturut-turut (n = 5). Nilai
deviasi standar relatif (RSD) yang diperoleh ditunjukkan
pada Tabel 1.
 KESIMPULAN

Metode kromatografi kertas yang menerapkan teknik mikrofluida berbasis kertas origami ini melakukan pemisahan
melintasi lebar kertas. Dalam hal ini, ketinggian kolom kromatografi dapat dengan mudah diatur dengan mengubah
jumlah lapisan kertas. Penggabungan perangkat dengan analisis gambar digital memungkinkan penghitungan analit
setelah pemisahan. Metode ini berhasil digunakan untuk pemisahan campuran E132 dan E102 dalam berbagai
produk makanan termasuk air berkarbonasi, minuman berkarbonasi, dan minuman Lemonade-Aloe Vera, jeli, jus
apel dan permen dengan perolehan dalam kisaran ~ 85-110%.

Reproduksibilitas perangkat kami tidak sebaik metode analisis yang canggih. Namun, ini lebih unggul daripada
banyak metode analitik mengenai konsumsi reagen dan pelarut, kecepatan, biaya, kesederhanaan, keterampilan
personel, dan operasi.