TEKNOLOGI DNA

REKOMBINAN
 Pendahuluan
• Dalam bioteknologi, manusia berusaha menanipulasi atau
memodifikasi organisme atau komponen organisme untuk
untuk menghasilkan produk yang diinginkan/bermanfaat.
• Salah satu bentuk manipulasi tersebut terjadi melalui
perubahan informasi genetik (DNA) suatu organisme
melalui Rekayasa Genetik.
– Rekayasa genetik menggunakan teknologi DNA rekombinan
• Teknologi DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik
atau metode yang menggabungkan atau
mengkombinasikan gen-gen yang berasal dari sumber-
sumber yang berbeda
 Pendahuluan
• Teknologi DNA rekombinan meliputi:
– Teknik pemotongan DNA (donor dan vektor)
– Teknik pembentukan DNA rekombinan
– Teknik Kloning DNA rekombinan
– Teknik penapisan hasil kloning DNA
 Apakah teknologi DNA Rekombinan?

Pembentukan kombinasi materi

genetik yang baru dengan
penyisipan molekul DNA ke
dalam suatu vektor sehingga
terintegrasi dan mengalami
perbanyakan di dalam sel
organisme (sel inang).
 Pengertian
• Rekombinasi sering diartikan sebagai
pengaturan kembali komposisi molekul
DNA.
• Dalam bentuk nyatanya rekombinasi
adalah sebuah proses yang berakibat
sebuah segmen DNA terputus dari segmen
DNA yang biasanya menjadi lanjutannya,
dan bersambung dengan segmen DNA
yang lainnya.
 Rekombinan DNA
• Sebagai hasil akhirnya adalah komposisi dan
urutan nukleotida menjadi berubah.

• Lain dengan mutasi, rekombinasi dapat

menyebabkan perubahan urutan nukleotida DNA
yang signifikan dan meliputi locus yang panjang
• .
• Hal ini terjadi karena dengan rekombinasi
perubahan urutan nukleotida di dalam genome
dapat berubah secara drastis dan dalam jumlah
yang besar.
 Teknologi DNA Rekombinan
• Restriksi Endonuklease
• Ligasi & Ligasi DNA
• Vektor
• Kloning & Rekombinan DNA
• Isolasi DNA & RNA
Pemanfaatan Manipulasi Gen dalam Pengobatan
Tahapan Teknologi DNA Rekombinan
DNA yang
akan di’klon’
+
Plasmid DNA
(vektor) rekombinan

Penumbuhan
Sel inang
Membawa klon

Sel Inang
DNA Rekombinan
 Nucleases

Phospodiester
Nukleotida

IK. Hidrogen
Exonuclease VS Endonuclease
• Nuclease dapat memotong/degradasi
molekul DNA dengan membelah ikatan
Phosfodiester yang menghubungkan
nukleotida
• Exonuclease menghilangkan nukleotida
pada posisi ujung molekul DNA
• Endonuclease memotong ikatan dalam
phosfodiester molekul DNA
Restriction Endonuclease (RE)
 Enzim Restriksi
• Enzim restriksi adalah Enzim yang dapat mengkatalisasi
pembelahan / pemotongan DNA dibeberapa tempat /
lokasi spesifik dengan jumlah yang terbatas & dapat
direproduksi. Enzim ini disebut juga dengan nama
endonuklease restriksi ( Russell, 1980).

• Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester

asam nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan
target umumnya sering muncul berkali kali.

• fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda dengan

sedikitnya satu ujung untai tunggal.
 Sejarah penemuan enzim restriksi
• Stewart Linn & Werner Arber (1960)
Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim
nuklease “restriksi” dalam bakteri E.coli galur B yang
dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan.
• Hamilton Smith (1970)
Pertama kali menemukan enzim nuklease restriksi
spesifik yang memutus DNA pada tempat- tempat
tertentu dan dapat diidentifikasikan, dari Haemophilus
influenzae yang dikenal dengan nama HindII,
• Watson dkk, (1983)
Menemukan nuklease restriksi & metilase modifikasi
dalam dua galur E.coli lain yang membuka
kemungkinan adanya banyak nuklease yang spesifik
untuk suatu tempat.
 Gambar Pemotongan molekul DNA dengan
enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III
 Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim
restriksi endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky.
(B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama
dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda.
Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi
 
 Teknik pemotongan DNA (1)
• Pemotongan DNA (sumber dan vektor)
dilakukan dengan bantuan enzim restriksi
endonuklease.
• Enzim restriksi:
– Berperan sebagai gunting molekuler yang
memotong pada titik tertentu (situs pengenalan/
recognition site):
• Berupa 4-8 pb dan bersifat palindom (Urutan basa yang
identik ketika dibaca dari arah 5-3 dan 3-5)
– Memutuskan ikatan fosfodiester melalui hidrolisis
Urutan Basa Palindom
 Teknik pemotongan DNA (2)
• Penamaan Enzim Restriksi:
– EcoRI
• E = genus • co = species (coli)
(Escherichia)
• R = strain • I = # of enzyme
• Enzim restriksi akan menghasilkan dua pola
potongan:
– Ujung tumpul (blunt)
– Ujung lengket (overhang atau sticky)
• Enzim restriksi yang berbeda akan
menghasilkan pola potongan yang berbeda
pula
Jenis-jenis Enzim Restriksi
 Teknik pemotongan DNA (3)
• DNA sumber (donor) dan vektor dipotong
dengan enzim restriksi yang sama
– DNA Sumber (donor)
• DNA kromosom
• DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR
• cDNA (complementary DNA) yang disintesis
menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)
Teknik pemotongan DNA (4)
– Vektor:
• Merupakan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan
suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut
• Memiliki situs pengenalan bagi enzim restriksi; dapat
bereplikasi/memperbanyak diri pada sel inang; dapat
memuat gen yang akan dimasukan; mengandung pananda
selektif (selectable marker)
• Berupa:
– plasmid (umum);
– bakteriofage;
– kosmid;
– BACs (Bacterial Artificial Chromosome); dan YACs (Yeast Artificial
Chromosome)
 Ligasi
• Ligase : Enzim yang mensintesis
pembentukan ikatan phosfodiester yang
menghubungkan nukleotida satu dengan
yang lainnya
Teknik pembentukan DNA rekombinan
• DNA donor maupun vektor yang telah
dipotong dengan enzim restriksi yang sama
akan saling berhibridisasi (perpasangan
basa-basa komplementer) melalui
pembentukan ikatan-H pada ujung-
ujungnya (sticky ends)
• Enzim Ligase membentuk ikatan
fosfodiester antar DNA donor dan vektor
– Terbentuk DNA rekombinan
Hibridisasi dan Ligasi DNA
rekombinan
Teknik pembentukan DNA rekombinan
Ligasi
Restriksi
& Ligasi
 Teknik Kloning DNA rekombinan

• DNA rekombinan yang telah terbentuk

selanjutnya diintroduksikan ke dalam sel
inang melalui proses transformasi
• Sel inang yang digunakan umumnya
berupa sel bakteri (E.coli):
– Informasi genetiknya sudah sangat dipahami
– Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan
– Dapat menerima berbagai vektor, mudah
ditransformasi
 Teknik penapisan hasil kloning DNA

• Penapisan dilakukan dengan

menumbuhkan bakteri inang pada media
selektif
– Mengandung antibiotik:
– Mengandung senyawa tertentu: X-gal
• Bakteri inang yang membawa plasmid
rekombinan akan resisten terhadap
antibiotik dan tidak mampu mengubah
memecah X-gal (koloni berwarna putih)
Teknik penapisan hasil kloning DNA (2)
 DNA VEKTOR
• Vektor kloning berfungsi untuk
memperbanyak fragmen DNA yang
disisipkan, sehingga fragmen DNA hanya
di replikasi, tidak di transkripsi.
• Vektor ekspresi digunakan untuk produksi
protein.
 Vektor (Biotranspor)
• Plasmid
• Virus lambda bacteriophaga
• Cosmid
 Plasmid
• DNA untai ganda
• Berbentuk lingkaran
• Bersalinan tinggi (high copy number)
• Berukuran kecil (mudah dimanipulasi)
• Dapat bereplikasi sendiri
• Dapat disisipi DNA asing
• Memiliki 2 gen marker : untuk mendeteksi
adanya vektor dan DNA sisipan
 Tahapan kloning
• Isolasi/preparasi DNA sisipan dan DNA
Vektor
• Pemotongan molekul DNA
• Penggabungan fragmen DNA sisipan ke
DNA vektor
• Transformasi
• Identifikasi
• Isolasi DNA rekombinan
 Aplikasi teknologi DNA Rekombinan

• Teknologi DNA rekombinan telah

memberikan manfaat di bidang ilmu
pengetahuan dan terapan
– Dalam Bidang Kedokteran:
• Produksi Insulin
– Dalam bidang pertanian:
• Tanaman transgenik
– Dalam bidang hukum:
• Analisis sidik jari DNA
Aplikasi teknologi DNA Rekombinan
Bacterium Cell containing gene
of interest

Bacterial Plasmid Gene of

chromosome interest
Recombinant DNA of
DNA (plasmid) chromosome

Recombinate
bacterium
3

Gene of
Protein expressed
interest
by gene of interest
Copies of gene Protein harvested

Basic Basic
research research
on gene on protein

Gene for pest Gene used to alter Protein dissolves Human growth
resistance inserted bacteria for cleaning blood clots in heart hormone treats
into plants up toxic waste attack therapy stunted growth
Produksi Insulin
 APPLICATION
Tanaman Transgenik
Genes conferring useful traits, such as pest resistance, herbicide resistance, delayed ripening,
Agrobacterium tumefaciens

and increased nutritional value, can be transferred from one plant variety or species to another
using the Ti plasmid as a vector.
Ti
plasmid
TECHNIQUE
Site where
restriction
enzyme cuts
1 The Ti plasmid is isolated from the bacterium Agrobacterium
tumefaciens. The segment of the plasmid that integrates into
the genome of host cells is called T DNA. T DNA
DNA with
the gene
of interest

Recombinant
2 Isolated plasmids and foreign DNA containing a gene of Ti plasmid
interest are incubated with a restriction enzyme that cuts in
the middle of T DNA. After base pairing occurs between
the sticky ends of the plasmids and foreign DNA
fragments, DNA ligase is added. Some of the resulting
stable recombinant plasmids contain the gene of interest.

3 Recombinant plasmids can be introduced into cultured plant

cells by electroporation. Or plasmids can be returned to
Agrobacterium, which is then applied as a liquid suspension
to the leaves of susceptible plants, infecting them. Once a
plasmid is taken into a plant cell, its T DNA integrates into
the cell‘s chromosomal DNA.

RESULTS Transformed cells carrying the transgene of interest can regenerate complete plants that Plant with
exhibit the new trait conferred by the transgene. new trait
 Sidik jari atau Forensik DNA
• Dilakukan dengan menganalisis Variable
Number Tandem Repeats ( VNTRs), yaitu
intron (daerah bukan pengkode) yang
tersusun atas utasan berulang 20-100 bp
pada DNA
– Pola ulangan yang bersifat unik antar indidividu
sehingga dapat menjadi “sidik jari”
– Memanfaatkan teknik Elektroforesis gel dan
Southern blotting of DNA fragments.
– VNTRs seseorang berasal dari informasi genetik
yang diwariskan oleh kedua orang tuanya ( ibu