Nama:MESI INGGRIT NUBATONIS

Nim :1701060083
Teknik PCR
Macam-macam tipe metode PCR dan modifikasinya:

PCR Konvensional
Polymerase chain reaction(PCR) konvesional adalah
proses dimana tahap perbanyakan materi genetik an
tahap deteksi produk dilakukan secara berturut –
turut, yaitu tahap deteksinya dilakukan bila tahap
perbanyakan materi genetik telah selesai.
Reaksi PCR konvensional biasanya menggunakan satu
pasang primer oligonukleotida untuk mengamplifikasi
bagian tertentu dari genom agen infeksi serta
dilakuakan pada suatu tabung. Primer PCR adalah
oligoddeoksiribonukleotida pendek,atau oligemer
yang dirancang untuk melengkapi urutan akhir
sekuen dari amplikon target PCR dan digunakan
untuk mengawali sintesis rantai DNA.
Real - timePCR
Real-Time PCR merupakan suatu metode analisa yang
dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga
dikenal sebagai quantitative real time polymerase
chain reaction atau q-PCR. Teknik ini dapat digunakan
untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah
target molekul hasil DNA amplifikasi tersebut.
Reverse Transcriptase-polymerase chain
reaction (RT-PCR)
Teknik dasar yang digunakan dalam reverse-
transcriptase PCR (RT-PCR) adalah modifikasi dari
PCR konvensional. Molekul RNA sebagai tamplate
dikonvermasi menjadi DNA komplementer(cDNA)
sebelum diperbanyak (amplifikasi). Konversi RNA
menjadi cDNA digenerasi menggunakan enzim
reverse transcriptase,sehingga dapat menjadi template
reaksi.
Nested PCR
Neste PCR adalah suatu teknik perbanyakan
(replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan enzim
DNA polimerase yang menggunakan dua pasang
primer untuk mengamplifikasi fragmen dengan
menngunakan Nested Polymerase Chain Reaction,jika
ada fragmen yang salah diamplifikasi,maka
kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk
kedua kalinya oleh primer yang kedua.Dengan
demikian,metode ini sangat spesifik dalam melakukan
amplifikasi.
Multiplex - PCR
Jenis ini digunakan untuk mengamplifikasi target
fragmen DNA dalam satu kali reaksi PCR. Kuncinya
adalah penggunaan primer dalam jumlah banyak yang
telah dioptimasi berdasarkan suhu terbaik dari
masing-maasing primer. Metode ini biasanya
diaplikasikan dalam banyak studi
genotiping,mutasi,dan analisis polimorfisme,analisis
STR(Short Tandem Repeat),mikrosatelit,deteksi
patogen dan GMO.
PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk
menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari
Enzyme Linked Immunosorbant Assay(ELISA)yang
terkait. Didalam suatu pengajuan hibridisasi hasil
produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini.
Dengan metode ini dapat dilakukan pengukuran
sekuen internal pada produk PCR.
Teknik Kloning Gen
 Kloning cDNA
Sebagian besar,metode-metode yang digunakan pengklonan
gen untuk memperoleh DNA rekombinan yang terdiri dari
gen yang diinginkan dalam vektor ekspresi adalah sama yang
digunakan dalam laboratorium penelitian.Karna banyak
protein yang bernilai komersial hanya terdapat dalam jumlah
kecil dalam sel-sel dan jaringan hewan,dan karna ekspresi gen
flon itu sangat penting. Maka banyak pekerjaan komersial itu
terpusat pada pengklonan cDNA dari mRNA yang terdapat
dalam jumlah sangat kecil didalam sel. Pendekatan lain yang
digunakan untuk memperoleh insulin manusia adalah sintesis
kimia dari suatu gen.
Hampir setiap molekul mRNA eukariot pada ujung
3’nya mempunyai rangkaian residu nukleotida adenin
yang disebut ekor poli-A. Adapun fungsinya poli-A
memberikan jalan yang mudah untuk mensintesis
sutau untaian DNA yang komplemeter terhadap
mRNA. Jika ranta-rantai pendek dari oligo-dt
dicampur dengan mRNA ,rantai tersebut berhibridisasi
ke ekor poli-A untuk diisolasikan dari virus-virus
tumor RNA tertentu dapat menggunakan RNA sebagai
cetakan untuk mensintesis suatu untaian DNA.
 Molekul cDNA beruntaian ganda diperoleh dengan cara tersebut. Lalu
disiapkan untuk disisipkan kedalam pBR 322,dengan jalan pemberi
ekor terminal transferase atau dengan menambahkan tempat-tempat
enzim restriksi buatan pad ujung cDNA-nya. Tempat-tempat restriksi
ini disebut ‘’penyambung’’(linker) adalah oligunekloitida dari 8-10
pasangn basa yang dibuat secara kimia. Penyambung-penyambung itu
ditambahkan pada pada cDNA beruntaian ganda dengan
menggunakan DNA ligase,lalu penyambung-penyambung itu
digunting hingga terbuka dengan enzim resrika dan cDNA-nya yang
sekarang mengandung ujung-ujung lekat yang dihasilkan oleh enzim
tadi,dimasukan dalam pBR 322 yang dibelah dengan enzim yang
sama.Kemudian plasmid rekombinan yang mengandung cDNA yang
dihasilkan itu dimasukan kedalam strain E coli yang sesuai dan
dikembangbiakan.
Gen Pengklonan:DNA rekombinan
Bakteri merupakan mesin-mesin efisien untuk
menciptakan turunan identik DNA bacteri dalam jumlah.
Begitu masuk dalam sel inangnya DNA fag tersebut
berlipat ganda,turunan dikemas kedalam partikel-parikel
baru dilepas dari sel inangnya sehingga siap mengulangi
daur infeksi tersebut. Jika kita dapat menempelkan gen
eukariotik kepada molekul DNA maka dapat direflikasi
dngan cara yang sama endonukliase restriksi
memungkinkan. Ekori adalah endonuklease restriksi
yang dihasiilkan oleh E.koli. Enzim ini membelah DNA
hanya ditempat yang meliputi rangkaiannya.
 Setiap utusan pilihan ganda itu dipotong diantara buagin dan
adenin. Setiap kali hal ini terjadi ujung-ujung belahan ganda itu
membawa panjang tambahan empat nukleotida DNA yang
berpasangan(berhelai tunggal) yang dinamai ujung ‘’lengket’’ karna
mampu berpasangan basa dengan molekul DNA yang mengadung
ujung lengket pelenkap. Gagasanya adalah memperlakukan kedua
DNA eukariotik dan DNA bakteriopang dengan endonuklease
retriksi yang sama sehingga tercipta ujung-ujung pelengkap
masing-masing. Dalam keadaan yang sesuai,secara bercampur
molekul-molekul eukariotik akan menempel pada molekul-molekul
DNA dengan ujung-ujung lengketnya masing-masing. Kemudian
DNA ligase dapat di pakai untuk dapat mengaitkan secara kovalen
molekul-molekul itu bersama.
Pengklonan individu kromosom
Karna sekarang terdapat kemungkinan untuk menyortir
kromosom.Kromosom manusia secara fisik kedalam klas
ukuran yang terpisah dengan suatu prosedur yang
dikenal sebagai sortasi sel yang teraktifitasi
fluoresens(FACS:fluoresende-actived celsorting). Maka
terbukti kemungkinan untuk mengklon DNA dari
individu kromosom. Misal mulai dengan suatu sel galur
manusia dengan kariotip abnormal (empat kromosom)
terdapat kemungkinan mensortir cukup banyak
kromosom x manusia yang bebas dari autosom untuk
dapat membuat suatu fag x dari DNA kromosom itu.
Pengklonan onkogen Manusia
Sekarang ini 3 onkogen manusia yang di duga telah diklon dengan
menggunakan teknik penyaringan dan teknik bantuan tRNA. Sudah
empat laboratorium yang berlainan yang secara sendiri-sendiri telah
mengklon gen-gen kanker kandung kemih. Semua gen ini tampak
sama(berukuran mendekati 5,4 kb),tetapi kesamaan ini mungkin
mencerminkan kenyataan bahwa galur-galur sel sekarang juga telah
diklon secara lengkap dengan menggunakan metode bantuan tRNA
yang memperlihatkan gen mendekati 13,5 kb mengklon gen kangker
kolom(paru-paru) terbukti lebih sukar mencapai,karna ia terlaluh
besar untuk diklon dalam sepotong fag 35 macam fag yang masing-
masing mengandung rangkaian varsail yang tumpang tindih,mula-
mula diisolasi lalu dianalisis dengan menggunakan tekhnik-tekhnik
penyaring alu dan homologi pada rangkaian gen.
Pengklonan hewan
Klon-klon yang ditangani oleh para ahli biologimolekuler biasanya
klon-klon dari bakteri atau organisme lain,sel-sel dalam kultur jaringan
dan molekul-molekul DNA. Para ahli dan pemulia tanaman sebaiknya
secara teratur menangani dan memproduksi organisme tingkat lebih
tinggi yang diklon,
Tumbuhan tinggi memberi kemungkinana untuk reproduksi aseksual
dan klon untuk banyak spesies liar,pembiakan aseksual lebih penting
daripada pembiakan seksual.Sebaiknya hewan-hewan alami tidak
berproduksi secara aseksual. Untuk mengklon binatang perlu untuk
mngambil nukleus dalam telur yang dibuahi,baik melalui
pembedahan,maupun menonakfikan secara total denga radiasi dan
menggantikannya dengan nukleus yang diambil dari individu lain ini
memerlukan transplasi suatu nukleus utuh yang tidak rusak dan
mampu untuk berkembang.
Pengklonan hormon pertumbuhan Manusia
Produksi hormon pertumbuhan manusia dalam E coli
menarik perhatian orang pada beberapa perilaku
rekayasa genetika.Hormon pertumbuhan manusia
(HGH= Human Growth Hormone) adalah suatu rantai
polipetida tunggal yang mempunyai 191 asam amino
dan diproduksi dalam kelenjar pituteria(kelenjar pada
infudibulum otak) seperti insulin,ia tidak
terglirosilasi. Hormon pertumbuhan mengendalikan
pertumbuhan tubuh kita.
Dengan menggunakan kombinasi dari sintesis kimia
DNA dan sintesis enzimatik cDNA telah diproduksi
suatu rangkaian yang mengkode asam-asam amino 1-14
telah disintesis secara kimia lansung didepan kodon
pertama,ditambahkan suatu trio(tiplet) basa (ATG)
yang menspesifikasikan asam amino metionin bila yang
tepat dari proteinnya,maka diperoleh suatu rangkaian
DNA yang mengkode sisa dari rantai poliptida yaitu
residu asam amino 25-19 dengan membuat cDNA dari
preparat-preparat nRNA dari sel-sel manusia.
Teknik Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari
tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan
dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau
buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada sel eukariotik
termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA
berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari
sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 %
keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain
seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat
pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel
sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan
bagian  dari metode isolasi DNA.
 Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma,
termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena
itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk
mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel
eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-
komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang
terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat
untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan
akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan
dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet
pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk
mengendapkan suatu komponen dari campuran .
 DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana.
Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti
baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh
DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat
dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan
mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan
dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam
dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk
mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
 Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara
lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel
dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau
bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal
ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian
DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka
kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi
hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka
sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.