Kelompok 4

metodepemisahan
Here is where your presentation begins!
 elektroforesis
• elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke arah
elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan listrik.
Laju migrasi molekul bermuatan tersebut menuju elektrode yang bermuatan
negatif disebut elektromobilitas.

•  Molekul-molekul dapat bermuatan positif/negatif misal protein

dan turunannya
•  Molekul yang tidak bermuatan : lemak dan karbohidrat
•  Dalam hal ini molekul2 yg bermuatan juga bergerak ke arah
kutub-kutubnya dg kecepatan tertentu yg dapat berbeda-beda
 A. PENDAHULUAN
1. DEFINISI
  Migrasi dari solut yang bermuatan dalam media
cair/padat dan berada dalam medan listrik

  Banyak senyawa dalam bentuk molekul yang

mudah terionkan seperti amino acids, proteins,
nucleotides, nucleic acids

  Senyawa (partikel) bermuatan dalam medan

 listrik yang bermuatan negatif (-) bergerak ke
 anode (+), yang bermuatan (+) akan bergerak
 katode (-)
 TEKNIK ELEKTROFORESIS
01 02
IMUNOELEKTROFORESIS ISATOCHOPORESIS
untuk mendeterminasi untuk memisahkan molekul-molekul
konsentrasi antigen hanya berdasarkan jumlah muatan
bukan berdasarkan ukuran
03 molekul

ELEKTRODENTASI
untuk memurnikan koloida. Prinsip : jika
larutan koloidal dialiri arus listrik, maka tjd pemisahan mjd 2
bagian
satu di antaranya koloida. Dua lapisan dpt terpisah dibedakan dr
warna atau refraksi indeknya. Aplikasi : utk memurnikan
hemoglobin dan serum albumin
 KEGUNAAN
Elektroforesis untuk pemisahan campuran senyawa yang berbeda dengan
teknik analisis serta pemisahan yang pernah didiskusikan.
 Pemisahan tergantung pada ;
1) Struktur kimia
2). pH,
3). Gugus fungsional
4).Dan bobot molekulnya.
 Analisis ini sangat informatif tentang data:
1) Senyawa metabolit maupun senyawa biokimia dengan BM besar
2) Tidak diperlukan jumlah besar, dan pemurnian yang tinggi.
3). Dapat digunakan sampel langsung tanpa pemisahan, misalnya urin dan
cairan limpa.
4). Senyawa yang bersifat polar, bermuatan atau bersifat zwitter ione here if
you need it
 Elektroforesis sangat bermanfaat untuk mengetahui
:
●  a). Nasib dari obat yang diberikan kepada pasien atau binatang
percobaan.
●  b). Dengan analisis elektroforesis perjalanan obat dapat dilacak
●  c).Alat yang menggunakan tenaga 100 volt/cm secara bertingkat,
● dapat memisahkan beberapa senyawa hanya dalam 15 menit.
●  d). Pemisahan tersebut dilakukan dengan mengatur pH yang
berkisar antara 2 sampai dengan 12.
●  e).Untuk analisis kualitatif, maupun kuantitatif asal ada detektor
● (densito meter)
 Jenis jenis elektrofosis
1. Elektroforesis kapiler

Elektroforesis kapiler adalah teknik elektroforesis yang memisahkan

ion-ion bergantung pada mobilitas elektroforesisnya dalam medan
listrik. Yang dimaksud dengan mobilitas elektroforesis adalah
muatan molekul, viskositas atau kekentalan, juga jari-jari atomnya.
Elektroforesis kapiler dapat dilakukan dengan cepat sesuai dengan
besar kekuatan medan listriknya. Teknik ini adalah teknik penelitian
dasar yang sangat penting untuk memahami fungsi gen dan protein
serta diagnose klinis dan juga forensik.
 2.Elektroforesis gel
Elektroforesis gel adalah teknik elektroforesis yang
pemisahan molekul dengan media gel berpori yang
dialiri medan listrik. Dilansir dari National Human
Genome Research Institute, pori-pori dalam gel
bekerja seperti saringan, memungkinkan molekul yang
lebih kecil bergerak lebih cepat darpada molekul yang
lebih besar. Gel yang digunakan bisa berupa gel
agarosa dan gel poliakrilamida.
 3.Immunoelectrophoresi
● Immunoelectrophoresis adalah teknik
elektroforesis yang memisahkan molekul
berdasarkan reaksinya terhadap antibodi. Dilansir
dari Microbe Notes, antigen direaksikan dengan
antiserum spesifik yang ditempatkan di palung
sejajar dengan migrasi elektroforesis dan difusi
dibiarkan terjadi. Kemudian molekul akan terpisah
setelah 18 hingga 24 jam karena reaksi antara
protein dan antibodinya.
 4.Electroblotting Elektroblotting
● adalah teknik pemisahan asam nukleat dengan menggunakan
membran padat untuk mendeteksi protein tertentu. Dalam
elektroblotting digunakan antibodi spesifik untuk memunculkan
protein tertentu yang berguna dalam proteomik dan genomik.

5. Pemfokusan isoelektrik
● Pemfokusan isoelektrik adalah teknik elektroforesis dengan
resolusi yang tinggi melalui penciptaan gradient pH. Pemfokusan
isoelektrik dilakukan dalam tegangan listrik yang tinggi agar
molekul bisa bergerak hingga titik nol muatannya.
 6. Elektroforesis gel medan berdenyut
Elektroforesis
● gel medan berdenyut digunakan untuk pemisahan molekul
yang lebih besar (tidak bisa melewatipori gel)
Elektroforesis gel medan berdenyut dilakukan dengan cara
menerapkan medan listrik yang berubah secara konstan sehingga
protein terpaksa melakukan reorientasi dan kemudian terpecah
dari makromolekul. Elektroforesis gel medan berdenyut sangat
efektif untuk analisis DNA yang besar, namun memerlukan waktu
yang cukup lama
 MOVING BOUNDARY ELECTROPHORESIS

● Media pemisahan komponen : larutan bufer tanpa media penyangg a padat

●  untuk memisahkan protein dalam larutan dapar yang ditempatkan dalam

tabung berbentuk u.

●  Pada kedua ujung diberikan elektrode negatif dan positif yang kemudian
diberi arus searah. Dengan pengaruh medan listrik tersebut, protein akan
bergerak secara bebas menuju kutub yang belawanan dengan muatannya.

 Gerakan tersebut garis (baundery), sehingga disebut moving baundery,

karena terjadinya peristiwa itu dalam larutan dinamakan free solution.
Gerakan tersebut dipengaruhi pula oleh bobot jenis molekul yang tentu saja
sesuai dengan bobot molekul dan pH larutan dapar

 Lebih sesuai utk keperluan analisis drpd utk preparatif (produksi)

 Faktor yg mempengaruhi kecepatan
migrasielektroforesis
● Kekuatan medan listrik ( berbanding lurus dengankecepatan
migrasi)

● Muatan ionik dari molekul yang dipisahkan(berbanding lurus

dengan kecepatan migrasi)

● koefisien gesekan/hambatan dari matrik penyangga(berbanding

terbalik dengan tftkecepatan migrasi)

● ukuran molekul yang dipisahkan

● bentuk molekul yang dipisahkan

 Elektroforesis: Analisis Elektronika Terhadap Biokimia
Genetika
● Abstrak

● Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang

memanfaatkan medan listrik yang dihasilkan dari elektroda-
elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa yang memiliki
muatan berupa kation ataupun anion. Elektroforesis membutuhkan
media pemisah berupa fase diam seperti sel Agarosa yang
tercampur larutan buffer untuk menjaga kondisi keasaman sampel
saat proses pemisahan. Alat ini sangat mendukung keterbaruan
penelitian khususnya dibidang teknologi rekayasa genetika.
Hasilnya
akan memberikan rekam jejak berupa pita-pita pemisahan senyawa.
Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan
terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
 ● 2. Prinsip Kerja Elektroforesis

● Menurut George Stokes besarnya gaya gesek pada fluida disebabkan

viskositas fluida. Semakin besar viskositas (kekentalan) fluida maka akan
semakin sulit suatu fluida untuk mengalir dan juga menunjukkan semakin
sulit suatu benda bergerak dalam fluida tersebut. Di dalam zat cair
viskositas dihasilkan oleh gaya kohesi antara molekul zat cair. Gaya ini
disebut gaya Stoke. Suatu molekul bermuatan Q dalam medan listrik
berkekuatan x akan bergerak dengan kecepatan v karena mengalami gaya
sebesar qx. Jika f merupakan koefisien gesekan (friksi), maka molekul
tersebut akan mengalami gaya hambat sebesar vf, sehingga qx = vf. Maka
koefisien gesekan (f) adalah sebagai berikut:
.
 Pada elektroforesis media pemisahnya berupa gel Agarosa atau lainnya yang memiliki tingkat
viskositas tinggi. Dengan demikian dapat dihitung laju molekulnya adalah sebagai berikut:

Laju dalam elektroforesis sangat bergantung pada kekentalan medium (n), ukuran atau bentuk (r),
dan muatan molekul (q). Kekuatan asam pada medium juga mempengaruhi besar muatan pada saat
ionisasi berlangsung sehingga diperlukan larutan buffer untuk mengatasi masalah ini. Dan juga perlu
dilakukan analisis terhadap kemampuan media untuk memisahkan molekul- molekul agar lebih
efektif dan maksimal.
 3. Komponen Elektroforesis

Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama dalam penggunaanya. Yang

pertama adalah larutan elektrolit yang berfungsi sebagai pembawa komponen.
Umumnya berupa larutan
buffer dengan pH tertentu sesuai dengan karakteristik senyawa yang akan
dipisahkan. Berikutnya media pemisah merupakan tempat proses pemisahan terjadi.
Media pemisah ini berupa kertas (selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel
polikrilamid, busa poliuretan atau
agar-agar. Selanjutnya yang paling penting adalah elektroda yang berfungsi sebagai
penghubung arus listrik dengan media pemisah dan baterai atau arus listrik sebagai
sumber energi (source) pada rangkaian alat.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi Elektroforesis

Proses pemisahan dengan elektroforesis sangat dipengaruhi oleh teknik pengerjaan dalam
pengoperasian alat tersebut. Disamping medium pemisah yang sudah dielaskan diatas, ada
beberapa faktor penentu lainnya yang dapat mempengaruhi proses pemisahan yaitu :

a. Sampel
Sampel yang akan dipisahkan sangat memungkinkan memberi pengaruh laju
perpindahan ditinjau dari muatan, ukuran, dan bentuk molekul. Jumlah muatan total
akan berbanding lurus dengan laju perpindahan, konsentrasi muatan yang bermigrasi
tergantung pada pH.

b. Larutan Buffer
Larutan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam medium pemisah, dan
berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik.
Larutan buffer harus memiliki interkasi dengan molekul yang dipisahkan, dan pH yang
digunakan menjadi perhatian sehingga kumpulan molekul dapat dipisahkan satu sama
lain tetapi tidak mengalami perubahan struktur.
 c. Medan listrik

Sumber suatu listik yang stabil sangat diperlukan untuk menghasilkan aliran listrik
dengan tegangan yang konstan. Kekuatan ionik medan listrik pada kisaran 2-8
V/cm sesuai pada suhu ruang. Kekuatan medan magnet yang dihasilkan jika lebih
besar dari 10 V/cm, maka dapat memberikan efek pemanasan yang dapat
menyebabkan pada
media penyangga terjadi kehilangan air yang diakibatkan proses penguapan. Hal
tersebut juga mengakibatkan pergeseran hasil fragmen-fragmen. Pemanasan
merupakan salah satu faktor yang mengakibatkan senyawa-senyawa terdenaturasi.
 4. Penelitian penggunaan Elektroforesis

Purwadi (2010) melakukan penelitian tentang penggunaan elektroforesis terhadap protein whey dan air
pemulur pada pembuatan keju Mozzarella yang dipengaruhi oleh suhu koagulasi dan pemuluran.
Elektroforesis yang digunakan tipe SDS-Page, menggunakan media pemisah gabungan poliakrilamida-
natrium dodesil sulfat. Elektroforesis jenis ini memiliki sifat lebih sensitif dan lebih akurat, hanya saja
membutuhkan proses yang lebih lama. Diperoleh hasil bahwa bahwa suhu koagulasi yang baik ialah 30
atau 35 oC,karena kedua suhu tersebut tidak berbeda nyata, maka agar lebih efisien sebaiknya digunakan
suhu 30 oC. Suhu pemuluran semuanya tidak berbeda nyata, sehingga agar lebih efisien digunakan suhu
terendah, namun dengan suhu 70 oC keju yang dihasilkan kurang mulur, sehingga sebaiknya digunakan
suhu 75oC
 Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui profil berat molekul enzim Bromelin dari kulit
buah Nanas (Ananas comosus L. Merr) dan Pepaya (Carica papaya L.) dari getah dengan
variaetas berbeda menggunakan metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly
Acrylamide Gel Electrophoresis). Presipitasi dilakukan dengan penambahan amonium sulfat ((NH4)2SO4)
60 % dan dialisis enzim menggunakan tabung selofan dengan ukuran pori 12.000 Dalton. Selanjutnya,
berat molekul larutan enzim hasil dialisis ditentukan dengan metode SDS- PAGE. Hasil yang diperoleh dari
analisis berat molekul enzim Bromelin varietas Bogor dan Subang tidak berbeda yaitu berkisar 30,654 kDa,
begitu juga dengan enzim papain varietas California dan Sukma tidak berbeda yaitu berkisar 23,485 kDa.
Kesimpulan dari penelitian tersebut bahwa varietas buah yang berbeda pada nanas dan pepaya tidak
berpengaruh
terhadap berat molekul enzim bromelin dan papain.
Terimakasih