MICROBIAL ANALYSIS

METHOD IN
ENVIRONMENT
Anastasya Audrelia Deu
CULTURAL METHOD
Mikrobiologi Industri
CULTURAL METHOD
Secara historis, informasi tentang spesies mikroba
diperoleh dengan menumbuhkannya dalam media kultur
di laboratorium. Metode kultur melibatkan pengambilan
sampel dari lapangan dan mendeteksi keberadaan
mikroba dengan membiakkannya. Dari jumlah spesies
mikroba pengaruhnya terhadap korosi diperkirakan.
TUJUAN
CULTURAL
• Untuk mengisolasi bakteri dalam kultur murni.
• Menunjukkan sifat mikroorganisme.
• Mendapatkan pertumbuhan yang cukup untukpersiapan antigen
dan untuktes lainnya.
• Ketik isolat dengan metode seperti bacteriopha dan bacteriocin
kerawanan.
• Menentukan kepekaan terhadap antibiotik.
• Memperkirakan jumlah yang layak dan
• Mempertahankan kultur stok.
CULTURAL METHOD
 • Streak culture.

• Lawn culture.

CULTURAL • Stroke culture.

METHOD • Stab culture.

• Pour plate culture.

• Liquid culture.
 STREAK CULTURE
Metode yang biasa digunakan untuk mengisolasi bakteri.
Satu loop penuh kultur dibuat sebagai inokulum primer
dan kemudian didistribusikan tipis di atas pelat dengan
menggoresnya dengan loop dalam serangkaian garis
paralel di segmen pelat yang berbeda. Loop dinyalakan
dan didinginkan di antara set coretan yang berbeda. Pada
inkubasi, pertumbuhan mungkin menyatu di tempat
inokulasi asli tetapi menjadi semakin tipis dan koloni
yang terpisah dengan baik diperoleh pada rangkaian
garis akhir.
LAWN CULTURE

Juga disebut sebagai budaya karpet. Memberikan

pertumbuhan bakteri yang seragam. Berguna untuk
pengetikan bakteriofag dan pengujian sensitivitas antibiotik.
Juga digunakan dalam persiapan antigen bakteri dan vaksin.
Disiapkan dengan membanjiri permukaan pelat dengan
biakan cair atau suspensi bakteri, pemipetan kelebihan
inokulum dan inkubasi piring. Sebagai alternatif, permukaan
pelat dapat diinokulasi dengan menerapkan swab yang
direndam dalam kultur bakteri atau suspensi.
STROKE CULTURE

• Dibuat dalam tabung berisi agar-agar

miring (slant).

• Dipekerjakan untuk memberikan

pertumbuhan murni bakteri untuk
aglutinasi slide dan tes diagnostik lainnya.
STAB
CULTURE

• Dibuat dengan menusuk dengan kawat lurus panjang yang

diisi dalam media yang sesuai seperti gelatin nutrisi atau
agar glukosa.

• Medium dibiarkan diatur dengan tabung dalam posisi

tegak, memberikan permukaan datar di bagian atas
medium.

• Digunakan terutama untuk demonstrasi pencairan gelatin

dan kebutuhan oksigen bakteri yang diteliti.

• Juga digunakan dalam pemeliharaan kultur stok.

POUR PLATE
CUKTURE
Tabung berisi 15 ml media agar dilelehkan dan dibiarkan dingin
dalam penangas air pada suhu 45 °C-50 °C.

Pengenceran inokulum ditambahkan dalam volume 1 ml untuk

agar cair, aduk rata. Isi dituangkan dalam cawan petri steril dan
dibiarkan mengeras.
Setelah inkubasi koloni akan terlihat terdistribusi dengan baik
sepanjang kedalaman media.

Dihitung menggunakan penghitung koloni.

Memberikan perkiraan jumlah bakteri yang hidup dalam suspensi

dan merupakan metode yang direkomendasikan untuk kultur urin
kuantitatif.
LIAQUID
CULTURES
• Diinokulasi dengan menyentuh dengan loop bermuatan
atau dengan menambahkan inokulum dengan pipet atau
jarum suntik.

• Metode yang digunakan untuk kultur darah & untuk tes

sterilitas.

• Lebih disukai untuk inokula yang mengandung

antibiotik dan antibakteri lainnya

• lebih disukai ketika hasil besar diinginkan.

IMUNOLOGYCAL METHOD
 Berbagai metode imunologis, memanfaatkan antibodi-antipen.

interaksi, tersedia, di antaranya enzim immuncassays (EIA). Metode AMDAL menggabungkan spesifisitas
molekul antibodi dengan amplifikasi interaksi antibodi-antigen dengan katalisis enzim Metode AMDAL yang
berbeda ada. Banyak pengujian dilakukan di sumur pelat mikrotiter di mana reaktan diimobilisasi. Antigen dalam
sampel mungkin atau mungkin tidak terikat oleh antibodi spesifik yang diimobilisasi di permukaan (antibodi
pelapis). Tes langsung, menggunakan antibodi spesifik terkonjugasi ke enzim (enzyme linked immunosorbent
assay ELISA), sedangkan dalam tes tidak langsung (double antibodi sandwich DAS-ELISA) antibodi pendeteksi
antigen spesifik dideteksi oleh konjugat enzim anti-imunoglobuin. Sejumlah pendekatan DAS-ELISA
memanfaatkan interaksi yang kuat antara biotin dan avidin (atau streplavidin). Antibodi terbiotinilasi mudah
dideteksi dengan menggunakan konjugat enzim streptavidin. Konjugat yang sama dapat digunakan untuk
mendeteksi sejumlah antibodi yang berbeda.

Imunilogycal method
NUCLEIC ACID-BASED METHOD
EKSTRAKSI
ASAM
NUKLEAT

Ekstraksi asam nukleat (DNA dan RNA) dari berbagai

bahan biologis untuk digunakan dalam analisis
molekuler berikutnya merupakan langkah paling
penting dalam biologi molekuler. Metode isolasi asam
nukleat dapat dikategorikan menjadi 3 metode:
ekstraksi organik (fenol/kloroform), metode ekstraksi
anorganik (penggaraman) dan metode ekstraksi fase
padat (matriks padat).
 NUCLEIC ACID-BASED METHOD
Dalam mencapai proses isolasi asam nukleat yang benar, terdapat 4 langkah yang umumnya
diperlukan untuk purifikasi asam nukleat tersebut:

1 LISIS SEL MELALUI PROSES

DISRUPSI MEMBRAN
2 DEHIDRASI DAN PRESIPITASI
PROTEIN SELULER
DAN/ATAU SEL (ATAU (DENATURASI PROTEIN)

KISTA)

3 PEMISAHAN PROTEIN DAN

KOMPONEN SELULER
4 PRESIPITASI DAN PELARUTAN
ASAM NUKLEAT
LAINNYA DARI ASAM
NUKLEAT
 NUCLEIC ACID-BASED METHOD

1 EKSTRAKSI FENOL-
KLOROFORM
Ekstraksi fenol-kloroform adalah metode lain yang telah banyak digunakan. Prosesnya terdiri dari pencampuran larutan fenol-
kloroform dengan sampel dilanjutkan dengan sentrifugasi. Proses ini memungkinkan isolasi asam nukleat yang larut dalam
campuran kloroform dan fenol. Fenol tidak sepenuhnya menghambat aktivitas RNase. Setelah sentrifugasi, fase air (bagian
atas) yang mengandung DNA dapat dipisahkan dari fase organi (bagian bawah) yang mengandung protein terdenaturasi dan
DNA yang dapat dipresipitasi dengan menambahkan etanol atau isopropanol dengan konsentrasi garam yang tinggi. Setelah
pencucian dengan etanol 70% untuk menghilangkan sisa etanol atau isopropanol, DNA target akhir dikumpulkan dengan
melarutkan dalam buffer TE atau aquabidest. Metode ini juga digunakan untuk ekstraksi RNA dengan menggunakan
guanidinium isothiocyanate secara bersamaan. Keterbatasan metode ini adalah fenol yang bersifat toksik, kaustik, dan mudah
terbakar terlebih lagi digunakan dalam laboratorium diagnostik.
 NUCLEIC ACID-BASED METHOD

2 EKSTRAKSI FASE PADAT

Metode ini menggunakan partikel silika yang tidak larut dibandingkan fenol cair. Partikel inti silika memiliki peran
serupa seperti fenol namun dengan keunggulan utama yaitu lebih aman, dan cross-contamination dapat dikurangi.
Presipitasi DNA dapat meminimalisir DNA yang hilang akibat presipitasi dengan fenol/kloroform. Kit komersial juga
beberapa menggunakan partikel silika tersebut, meskipun juga telah digantikan oleh bahan lain seperti matriks silika,
partikel kaca, tanah diatom, dan anion-exchange carrier.Ekstraksi fase padat menggunakan kolom spin yang
dioperasikan dengan sentrifugasi, memungkinkan DNA dipurifikasi dengan cepat, efisien, dan kuantitatif. Sentrifugasi
dengan fase padat tidak mempunyai batasan ekstraksi cair sekaligus memperkecil probabilitas pemisahan yang tidak
sempurna. Ekstraksi fase padat menggunakan silika sekarang adalah salah satu metode yang paling umum untuk
ekstraksi asam nukleat. Silika yang bermuatan positif berikatan kuat dengan DNA yang bermuatan negatif.
 NUCLEIC ACID-BASED METHOD

2 EKSTRAKSI DENGAN MAGNETIC

BEAD
Modifikasi ekstraksi fase padat yang paling terbaru yaitu penggunaan magnetic bead. Bead yang bermuatan
negatif di permukaannya akan mengikat protein dan debris seluler secara selektif. Setelah itu, DNA dapat
diisolasi dengan mudah dari spesimen. Keuntungan penggunaan teknik ini yaitu mengurangi sentrifugasi,
filtrasi vakum, dan pemisahan kolom berulang untuk proses pencucian dan elusi serta pelarut organik. Metode
magnetic bead sangat sederhana dan nyaman sehingga banyak kit komersial yang menggunakan metode ini
Selain metode ini, metode enzimatik adalah contoh dari metode ekstraksi yang paling baru yang membantu
peneliti dengan memberikan kemudahan dengan volume spesimen kecil sekaligus mampu meningkatkan
recovery DNA.
TERIMAKASIH!