Peranan Bakteri Penghasil Bakteriosin Dalam Fermentasi Urutan*)

Oleh Dr. Ir. Nyoman Semadi Antara, MP. Pusat Kajian Keamanan Pangan, Universitas Udayana Laboratorium Mikrobiologi Industri, P.S. Teknologi Pertanian, Universitas Udayana Laboratorium Terpadu Biosain dan Bioteknologi, Universitas Udayana Pendahuluan Bakteri asam laktat merupakan jenis bakteri yang umumnya menguntungkan. Bakteri asam laktat banyak memberikan keuntungan sehingga banyak industri makanan terfermentasi memanfaatkannya, khususnya digunakan sebagai kultur starter dikombinasikan dengan jenis bakteri lain, khamir dan kapang. Secara umum, Bakteri asam laktat merupakan food-grade organisms. Bakteri tersebut dapat memberikan citarasa pada makanan, menghambat bakteri pembusuk pada makanan maupun pakan, dan juga dapat menghambat bakteri pathogen. Manfaatnya di dalam saluran pencernaan juga telah banyak diteliti dan juga keberadaannya di dalam saluran pencernaan bayi yang sehat. Keuntungan lain terhadap kesehatan seperti hubungannya dengan tingkat kolesterol darah, kangker, dan produksi anti-mikroba juga telah banyak diteliti dan mendapat perhatian yang terus meningkat. Pada makanan tertentu, bakteri asam laktat juga dapat meningkatkan mutu gizinya. Urutan merupakan jenis sosis yang diproduksi oleh masyarakat Bali dan merupakan produk asli Bali. Jenis sosis ini biasanya dibuat pada saat masyarakat Bali merayakan hari raya Galungan. Urutan segar dikeringkan untuk memperpanjang masa simpannya. Istilah urutan digunakan untuk yang segar maupun yang kering. Selama pengeringan terjadi fermentasi secara spontan oleh mikrooragnisme yang berasal dari daging dan bahan lain yang digunakan dalam pembuatan urutan, dan proses fermentasi ini menghasilkan rasa dan aroma yang khas. Mutu urutan sangat tergantung pada jumlah mikroba awal yang diinginkan. *)Disampaikan pada Seminar Nasional Probiotik dan Prebiotik Sebagai Makanan Fungsional, Denpasar,
30 Agustus 2004

Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang dominant tumbuh selama fermentasi 1

urutan. Spesies bakteri asam laktat yang teridentifikasi selama proses fermentasi adalah Lb. plantarum, Lb. farciminis, Lb. fermentum, Lb. hilgardii, P. acidilactici dan P. pentosaceus. Spesies yang signifikan keberadaannya di dalam urutan adalah Lb. plantarum, P. acidilactici dan Lb. farciminis dengan suksesi pertumbuhan tertentu. Keberadaan dari strain bakteri asam laktat (P. acidilactici U318) yang dapat menghasilkan bakteriosin berperan dalam suksesi pertumbuhan bakteri asam laktat tersebut. Pediococcus acidilactici U318
2.0

Growth of P. acidilactici U318

Salah satu spesies bakteri asam laktat yang signifikan keberadaannya selama
1.5 proses fermentasi urutan secara tradisional adalah P. acidilacti, dan salah satu strain (P. 1.0 acidilactici U318) dapat memproduksi bakteriosin. Peran strain ini juga menentukan
OD660

suksesi yang terjadi selama0.5 fermentasi urutan. P. acidilactici dapat tumbuh dengan baik pada urutan karena suhu fermentasi yang relative tinggi. 0.0
24 Produksi bakteriosin 0 3 6 9acidilactici21 U318 dipengaruhi oleh pH awal oleh P. 12 15 18

Incubation time (h) pertumbuhan dan suhu pertumbuhan. Bakteriosin dapat diproduksi dengan lebih baik

pada pH 6,0 7,0 dibandingkan dengan pH medium 5,0. Bakteriosin diproduksi secara maksimal setelah 18 jam pada pH awal 6,0 7,0. Pediococcus acidilactici U318 mulai
6.5 memproduksi bakteriosin pada saat akhir fase logaritmik pertumbuhan. Pediococcus

Changes in pH

acidilactici U318 memproduksi bakeriosin pada kondisi suhu 30oC, 35oC, dan 40oC. Bakteriosin tidak diproduksi pada suhu 45oC walaupun dapat tumbuh dengan baik pada 5.0 suhu tersebut (Gambar 2).
4.5 0 3 6 9 12 15 18 21 24 4.0 Karakteristik bakteriosin yang dihasilkan oleh P. acidilactici U318 dapat dilihat

6.0 5.5

pada Tabel 1, dan spektrum penghambatannya dapat dilihat pada Tabel 2. Semua bakteri asam laktat yang diuji dihambat oleh bakteriosin, kecuali Leu. mesenteroides, Lb. farciminis, dan P. acidilactici U318. Listeria inocua dihambat oleh bakteriosin, dan juga terjadi terhadap Staph. aureus dan Strep. faecalis, namun tidak menghambat B. subtilis,
Bacteriocin activity (AU/ml)

pH

Incubation time (h)

Bacteriocin production

E.coli, dan Sal. typhi.

2000 1600 1200 800 400 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24

Fermentation time (h)

Growth temperature at: 30oC; 35oC; 40oC; 45oC 2 Gambar 2. Pengaruh suhu inkubasi terhadap pertumbuhan P. acidilactici U318, perubahan pH, dan produksi bakteriosin.

30oC

35oC

40oC

45oC

Dengan menggunakan spectrometer massa dapat ditentukan berat molekul bakteriosin yang dihasilkan oleh P. acidilactici U318, yaitu 4611,32 Da. Dari komposisi 3

asam amino diperkirakan bahwa bakteriosin ini terkomposisi dari 42-44 asam amino dengan sequen N-terminal 20 asam amino yang dihasilkan adalah KYYGNGVTYGKHSYSVDWGK--. Sequen ini memperlihatkan kesamaan sebesar 90% terhadap pediocin PA-1 (accession number P29430, SwissProt Database) (Gambar 3). Dua dari 20 sequen asam amino berbeda, yaitu tirosin (residu asam amino nomor 9 dan 14) pada bakteriosin yang diproduksi P. acidilactici U318 disubstitusi dengan sistein pada pediosin PA-1. Dari homologi tersebut kemungkinan pediosin yang dihasilkan oleh P. acidilactici U318 merupakan bakteriosin yang baru. P. acidilactici U318 KYYGNGVTYGKHSYSVDWGKPediocin PA-1
KYYGNGVTCGKHSCSVDWGK-

GAMBAR 3. Homologi sequenN-terminal bacteriosin yang diproduksi oleh P. acidilactici U318 dan pediocin PA-1 Suksesi Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Peranan bakteri asam laktat selama proses fermentasi sangat menentukan mutu urutan yang dihasilkan. Secara tradisional proses fermentasi terjadi selama proses pengeringan dengan fluktuasi suhu yang tinggi berkisar dari 25oC pada malam hari sampai 50oC di bawah sinar matahari, dengan kelembaban berkisar antara 70% 90%. Demikian pula keberadaan bumbu, gula, dan garam menentukan jenis bakteri asam laktat yang tumbuh selama proses fermentasi. Lactobacillus plantarum merupakan spesies yang dominant tumbuh pada awal fermentasi (pada hari pertama dan kedua fermentasi). Strain P. acidilactici mulai menggantikan pertumbuhan Lb. plantarum pada hari kedua dan menurun sampai akhir fermentasi. Sementara Lb. farciminis mulai tumbuh pada hari kedua dan terus meningkat sampai akhir fermentasi. Heterofermentative lactobacilli (Lb. fermentum and Lb. hilgardii) keberadaannya tidak signifikan selama proses fermentasi. Keberadaan spesies heterofermentatif tersebut hanya pada hari ketiga dan kelima dengan jumlah yang sangat kecil. Suksesi pertumbuhan bakteri asam laktat selama proses fermentasi urutan dapat dilihat pada Gambar 1. Keberadaan P. acidilactici sebagai penghasil bakteriosin sangat penting perannya 4

dalam proses suksesi pertumbuhan bakteri asam laktat pada urutan yang difermentasi secara tradisional. Bacteriocin yang diproduksi oleh strain P. acidilactici U318 dapat menghambat pertumbuhan Lb. plantarum and P. pentosaceus, tetapi tidak menghambat Lb. farciminis. Pertumbuhan Lb. farciminis distimulasi oleh kondisi intrinsic urutan setelah fermentasi selama tiga hari sampai akhir fermentasi. Heterofermentatif lactobacilli hanya terlihat pada akhir fermentasi dan peranannya tidak signifikan selama fermentasi.

18 15 Number of isolates 12 9 6 3

Table 2. Inhibition spectrum of bacteriocin produced by P. acidilactici U318

Lb. plantarum P. acidilactici BacteriaInhibitionP.pentosaceus B P. pentosaceus AHU1677+P. farciminis pentosaceus U-208+P. Lb. pentosaceus hilgardii U-306+P. acidilactici Lb.

AHU1670+P. entum Lb. ferm acidilactici AHU1654+P. 5 acidilactici U-504+P. acidilactici U-318aLb. plantarum U-201+Lb. plantarum U309+Lb. casei AHU1696+Lb. brevis TreatmentsActivity AHU1508+Lb. farciminis U-209-Lb. (AU/ml)Control6400100oC for 5 o o farciminis U-315-Lb. farciminis U-501-Lb. min6400100 C for 10 min6400100 C Gambar 1. Suksesi pertumbuhan bakteri asam laktat U-310-Leu. fermentasi fermentum selama proses mesenteroides for 15 min6400100oC for 20 AHU1673-Strep. faecalis AHU1058+B. A min3200121oC for 15 min0Trypsin0subtilis AHU1035--E. coli ATCC12435-A A chymotrypsin0Proteinase K0Papain0Pediococcus acidilactici U318 Sebagai Kultur Starter b Sal. typhi SL-3770b--Staph. aureus amilase6400Lipase6400pH 26400pH c Pada fermentasi urutan, produksi A AHU1142+List. + inocuac+aBacteriocin 36400pH 46400pH 56400pH 66400pH asam yang cepat pada awal fermentasi sangat b producer; From Kyowahakko Culture 76400pH 96400pH dibutuhkan untuk 86400pH pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan. Keasaman yang menekan Collection; cFrom Dr. B. Ray, Animal 101600pH 11800pH 120 tinggi juga dapat mendenaturasi protein daging yang selanjutnya memacu terlepasnya air Science Department, Wyoming University; dari produk. Hal ini menyebabkan aktivitas airAHU:produk menurun selama fermentasi. (aW) Applied Microbiology Hokkaido University; U: indigenous strain isolated Kondisi ini sangat penting untuk menghambat from urutan;Enterobacteriaceae, dan Type pertumbuhan ATCC: American juga Culture Collection. berperan untuk mengawetkan produk dan keamanannya.

Table 1. Effect of some treatments on 1 2 3 the activity of bacteriocin produced by F erme 4 ntati on tim e (d P. acidilactici U318 ay)

Penggunaan strain tertentu sebagai kultur starter untuk memperbaiki mutu produk telah diimplementasikan oleh industri-industri makanan terfermentasi. Studi yang dilakukan terhadap urutan dapat menghasilkan strain yang potensial untuk memperbaiki mutu urutan. Salah satu strain yang diisolasi dari urutan, P. acidilactici U318, mempunyai 6

potensi untuk dijadikan kultur starter dalam pembuatan urutan, karena strain ini dapat menghasilkan bakteriosin. Kemampuan P. acidilactici U318 memproduksi bacteriosin, yang menghambat semua bakteri asam laktat yang ada dan ingnues di dalam urutan kecuali Lb. farciminis, merupakan dasar yang baik untuk menentukan penggunaan strain ini sebagai kultur starter. Telah dilakukan percobaan penggunaan P. acidilactici U318 sebagai starter tunggal maupun ganda. Bahan baku sosis, utamanya daging, mengandung beranekaragam bakteri, seperti spesies dari Staphylococcus, Micrococcus, and Pseudomonas. Pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan ini harus diturunkan sampai pada batas yang diperbolehkan atau dihilangkan. Kondisi ini harus tercapai selama proses fermentasi. Pada fermentasi alami keberadaan bakteri asam laktat tidak dapat menekan pertumbuhan Enterobacteriaceae dan micrococci, yang pada akhir fermentasi masih terkandung dalam jumlah yang cukup tinggi, yaitu berturut-turut 1.4x105 cfu/g dan 1.9x107 cfu/g. Dengan menggunakan kultur starter pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan tersebut dapat diturunkan sampai pada batas aman. Pertumbuhan bakteri asam laktat yang cepat pada awal fermentasi akan menurunkan pH produk secara cepat juga yang memberikan pengaruh terhadap terhadap menurunnya atau menghilangnya bakteri yang tidak diinginkan seperti Enterobacteriaceae. Penurunan pH sampai kurang dari 4.8 sangat penting untuk menghindari pertumbuhan C. botulinum, dan ini harus dirancang untuk produksi urutan. Laju penurunan pH dapat ditingkatkan dengan menggunakan kultur starter. pH urutan 4,8 dapat tercapai dalam waktu lebih dari 72 jam pada fermentasi alami. Hal ini dapat dipercepat menjadi 24 jam dengan menggunakan kultur starter P. acidilactici U318 dan kurang dari 24 jam dengan Lb. plantarum U201.atau campuran P. acidilactici U318 dan Lb. plantarum U201. Lb. plantarum U201 sebgai kultur tunggal dapat menekan pertumbuhan Enterobacteriaceae dengan cepat. Strain ini tidak dapat menghambat bakteri dari kelompok micrococci secara total. P. acidilactici U318 sebagai kultur tunggal dapat menekan pertumbuhan micrococci secara total, tetapi pH urutan tidak dapat menurun dalam waktu singkat yang memberikan peluang tumbuhnya Enterobacteriaceae pada awal fermentasi. Campuran Lb. plantarum U201 dan P. acidilactici U318 sebagai kultur starter gandamemperlihatkan bahwa pertumbuhan Enterobacteriaceae dihilangkan 7

segeradan micrococci dihambat secara total. Hal ini menujukan penggunaan kultur starter ganda lebih baik untuk diimplementasikan dalam produksi urutan. Kesimpulan Secara umum fermentasi urutan didasarkan pada fermentasi laktat, dimana bakteri asam laktat merupakan bakteri yang dominant selama fermentasi. Diantara bakteri asam laktat yang terlibat dalam proses fermentasi tersebut, P. acidilactici U318 memproduksi bakteriosin yang tahan panas yang aktif pada kisaran pH yang lebar, dapat didegradasi oleh protese, dan dapat menghambat bakteri pathogen. Penggunaan Lb. plantarum U201 yang dikombinasikan dengan P. acidilactici U318 merupakan kultur starter ganda yang menjanjikan untuk digunakan dalam pembuatan urutan.