Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram

sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop.[1] Disisi lain, bakteri gram-positif akan berwarna ungu.[1] Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram.[2]. Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri.[3] Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteripatogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal [2] berupa peptidoglikan . Sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun [1] atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernamaasam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luarpermeabel. [2] Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. [2] Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang.[4]Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).[4] Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan metoda pewarnaan gram menjadi 2 kelompok besar, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarnaan ini membedakan bakteri berdasarkan karakteristik fisik dan kimia dinding sel-nya. Pewarnaan Gram meliputi 3 proses utama, yaitu pengecatan dengan kristal violet, dekolorisasi (penghapusan warna)dengan etil alkohol atau aseton, kemudian counterstaining atau pemberian pewarna kontras menggunaan air fukhsin.

bakteri gram positif

bakteri gram negatif

Pada awal pengecatan, semua bakteri akan berwarna ungu, proses dekolorisasi dan pemberian warna kontraslah yang membedakan antara kedua jenis bakteri ini. Bakteri gram positif akan menunjukkan warna ungu karena memiliki lapisan peptidoglikan tebal yang menahan kristal violet selama pengecatan gram.Sedangkan pada bakteri gram negatif akan berwarna merah akibat tipisnya dinding peptidoglikan sehingga kristal violet terbuang selama proses dekolorisasi dan pemberian air fukhsin akan mengecat bakteri gram negatif menjadi merah.

Pewarnaan Gram

Reagen
o o o o o

Kristal violet (pewarnaan primer) Larutan lugol (untuk memfiksasi kristal violet di dinding sel) Etil alcohol,aseton, alcohol 96% (untuk dekolorisasi) Air fukhsin atau Safranin (pewarnaan kontras) Air Suspensi kuman ( biakan kuman dalam tetesan garam fisiologis) disebarkan setipis mungkin dan melingkar diatas glass deck. Biarkan mengering atau dapat dihangatkan di atas api.

Langkah kerja
o

o o o

Fiksasi suspensi dengan dilewatkan diatas api 3 kali. Warnai kuman dengan kristal violet selama 5 menit. Bersihkan kristal violet yang tidak terikat dengan bilasan air yang lembut (jangan melebihi 5 detik). Beri larutan lugol, biarkan selama 1 menit untuk memfiksasi kristal violet). Buang larutan lugol, bilas dengan etil alcohol atau alkohol 96% secara lembut hingga tidak ada zat warna yang mengalir lagi.Pada tahap ini bakteri gram negative akan tampak tidak berwarna ungu lagi.Sedangkan bakteri gram positif tetap berwarna ungu.

o o

Bilas sampel dengan air, dan beri pewarnaan kontras dengan air fukhsin selama 1-2 menit. Bakteri gram positif tetap berwarna ungu dan bakteri gram negative akan menjadi merah akibat pewarnaan kontras.

Cuci sampel dan periksa dengan mikroskop.

Karakteristik bakteri gram positif :

Memiliki cytoplasmic lipid membrane Memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal

o

Terdapat asam teichoic dan lipoid yang membentuk lapisan asam lipoteichoic yang berguna untuk chelating agen dan untuk adhesi tipe tertentu.

Beberapa spesies memiliki kapsul polisakarida Beberapa spesies memiliki flagellum

o

Jika terdapat akan diperkuat oleh 2 cincin, berbeda dengan bakteri gram negative yang flagellumnya diperkuat oleh 4 cincin.

Karakteristik bakteri gram negative :

Memiliki Cytoplasmic membrane Lapisan peptidoglikan tipis Memiliki membran tambahan diluar lapisan peptidoglikan yang dipisahakan oleh spasium periplasmik. Membran luar terdiri atas Lipopolisakarida (LPS) yang tersusun oleh lipid A, inti polisakarida, antigen O Terdapat porin di membran luar sebagai pori-pori untuk molekul tertentu. Memiliki S-layer (Surface layer) yang melekat langsung pada membran luar. Jika memiliki flagella, maka akan disokong oleh 4 buah cincin. Tidak memiliki asam teichoic ataupun asam lipoteichoic. Lipoprotein merekat pada polisakarida. Kebanyakan tidak mengalami sporulasi.

Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri gram positif dan bakteri gram negative adalah sebagai berikut : Pembeda Dinding sel : Lapisan peptidoglikan Kadar lipid (1% KOH) Kepekaan terhadap Iodium Toksin yang dibentuk Resistensi terhadap tellurit Sifat tahan asam kepekaan terhadap penisilin kepekaan lebih peka eksotoksin lebih tahan ada yang tahan asam lebih peka terhadap tidak peka kurang peka endotoksin lebih peka tidak ada yang tahan asam kurang peka peka lebih tebal 1-4 % lebih tipis 11-22% larut Bakteri gram positif Bakteri gram negatif

Resistensi terhadap alkali tidak larut

streptomisin

Bakteri gram positif memiliki lapisan petidoglikan yang tebal tetapi tidak memiliki membranluar. Sedangkan pada bakteri gram negative, lapisan peptidoglikan tipis dan memilki membran luar yang tersusun atas Lipopolisakarisa (LPS) dan protein.

Bakteri Gram Positif Berdasarkan klasifikasi phyla bakteri yang asli, bakteri gram positif termasuk dalam filum Firmicutes. Didalamnya terdapat kelompok- kelompok bakteri yang sudah banyak dikenal, yaitu : Staphylococcus Streptococcus Enterococcus Bacillus

Corynebacterium Nocardia Clostridium Actinobacteria Listeria

Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negatif termasuk dalam divisi Gracillicutes. Proteobacteria adalah grup mayor dalam kelompok bakteri gram negatif.Jenis-jenisnya yaitu : o o o Enterobacteriaceae Escherichia Coli Salmonella Sigella Pseudomonas Moraxella Helicobacter Stenotrophomonas Bdellovibrio Bakteri asam asetat Legionella Alpha-proteobacteria

Wolbachia Cyanobacteria Spirochaeta green sulfur & green non-sulfur bacteria.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkoholmemungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisipeptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (13nm).S i f a t G r a m p o s i t i f G r a m N e g a t i f K o m p o s i s i d i n d i n g s e l K a n d u n g a n l i p i d r e n d a h L i p i d t i n g g i Ke tahanan terhadappenisilinL e b i h s e n s i t i f L e b i h t a h a n Penghambatan warnabasaL e b i h d i h a m b a t K u r a n g d i h a m b a t K e b u t u h a n n u t r i e n K o m p l e k s R e l a t i f s e d e r h a

n a Ketahanan terhadapperlakuan fisikL e b i h t a h a n K u r a n g t a h a n Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella spp, Shigellaspp, E. Coli, Yersinia enterolitica . Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci, Streptococci,Enterococci, Clostridium, Bacillus .Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama3. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan catutama4. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warnacat utamanyaP a d a s a a t p e m b e r i a n l a r u t a n c a t k r i s t a l v i o l e t , b a k t e r i g r a m p o s i t i f d a n n e g a t i f s a m a - s a m a berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehinggasel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna unguyang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Pada gramnegatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodinkeluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendahs e h i n g g a k o m p l e k s v i o l e t k r i s t a l i o d i n t e r p e r a n g k a p a n t a r a d i n d i n g s e l d a n m e m b r a n s i t o p l a s m sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkangram negatif melewatkannya.Bakteri gram-positif adalahbakteriyang mempertahankanzat warna metil ungusewaktu prosespewarnaan Gram. B a k t e r i j e n i s ini akan berwarna b i r u a t a u u n g u d i b a w a h mikroskop, sedangkanbakterigram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenisbakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan strukturdinding selbakteri.Bakteri gram-negatif adalahbakteriyang tidak mempertahankanzat warnametil ungupadametodepewarnaan Gram. Bakterigram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicucidenganalkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatupewarna penimbal( counterstain ) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipebakteri ini berdasarkan perbedaan strukturdinding selmereka.Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifatpatogen, yang berarti mereka berbahaya bagiorganismeinang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding selgram-negatif, terutama lapisanlipopolisakarida(dikenal juga dengan LPS atauendotoksin).