Penurunan insidensi Leishmaniasis visceral pada anjing dan manusia setelah pemberian vaksinasi anjing menggunakan Leishmune di Area-area

endemi di Brazil

Intisari

Leishmune, vaksin profilaktik berlisensi pertama untuk melawan Leismaniasis visceral pada anjing (CVL), telah digunakan di Brazil sejak tahun 2004, dimana anjing dengan seropositif akan dimusnahkan dengan tujuan untuk mengontrol Leishmaniasis visceral pada manusia (VL). Kami disini

memperlihatkan bahwa vaksinasi menggunakan Leishmune tidak berlawanan dengan kampanye kontrol serologis (110.000 anjing). Hanya 1,3 % dari yang positif (76 diantara 5860) yang terdeteksi diantara vaksin-vaksin Leishmune uninfected (yang tidak terkontaminasi). Kami juga menganalisa efek tambahan yang mungkin dari vaksinasi Leishmune selama pemusnahan anjing, pada penurunan insidensi dari CVL dan VL di dua area endemik Brazil dari tahun 2004 sampai 2006. Di Arac, atuba, penurunan sebesar 25% terlihat di CVL dengan penurunan sebesar 61% pada kasus-kasus pada manusia yang mengindikasikan efek tambahan dari vaksinasi Leishmune terhadap 5,7% anjing yang sehat (1419), pada pemusnahan anjing yang dilakukan berkala. Di Belo Horizontale (BH), peningkatan kurva insidensi pada anjing dan manusia dipelajari di kawasan Barreiso, Venda Nova dan Noroeste, sementara insidensi pada anjing dan

manusia di Centro Sul, Leste, Nordeste, Norte, Pampulha dan Oeste, mulai menurun atau mempertahankan level yang stabil setelah pemberian vaksinasi dengan Leishmune. Diantara kawasan-kawasan itu memperlihatkan prosentase penurunan dari insidensi pada manusia (36.5%), Centro Sul dan Pampulha memperlihatkan prosentase vaksinasi anjing yang tertinggi (63.27% dan 27.27%, berturut-turut) dan insidensi pada anjing yang terendah (3.36% dan 1.89%, berturtu-turut). Telah ditelusuri oleh Oeste, bahwa vaksinasi sebanyak 25,30% dari hewan-hewan memperlihatkan peningkatan hanya sebesar 12,86% dari

insidensi pada anjing, dan oleh Leste dan Nordaste, dengan proporsi vaksin yang lebih rendah (11,72% dan 10,76%, berturut-turut) dan kemungkinan karenanya, menyebabkan insidensi pada anjing yang sedikit lebih tinggi (42,77% dan 35,73%). Pengecualian satu-satunya ditemuan di kawasan Norte dimana penurunan insidensi pada manusia dan anjing tidak berkolerasi dengan vaksinasi Leishmune. Proporsi yang lebih rendah dari anjing divaksinasi di kawasan Venda Nova (4,35%), Noroeste (10,27%) dan Barreiro (0,09%), menurutnya memperlihatkan insidensi pada anjing yang sangat meningkat (24,48%, 21,85% dan 328,57%, berturut-turut), serta peningkatan insidensi pada manusia yang jelas (14%, 4% and 17%, berturut-turut). Penurunan pada anjing (p = -0,008) dan insidensi pada manusia (p = -0,048) secara langsung berkorelasi terhadap peningkatan dari jumlah anjing yang divaksinasi, menegaskan efek kontrol tambahan dari vaksinasi Leishmune pada seluruh anjing yang dimusnahkan, mengurangi reservoir parasit, melindungi anjing dan, dalam hal ini, mengurangi resiko transmisi VL ke manusia dan menjadi alat kontrol baru yang efektif. 1. Pendahuluan Human visceral leishmaniasis (VL) atau kala-azhar merupakan canid zoonoses yang muncul kembali di Mediterranean dan dunia baru [1]. Parasit terpapar pada kulit anjing dan spesies canidae lainnya serta ditransfer ke manusia melalui gigitan serangga penghisap darah (sand flies). Kontrol epidemiologi terkini, seperti yang telah direkomendasikan oleh World Health Organization, termasuk terapi pada kasus-kasus manusia, insektisida untuk kontrol vektor dan pemusnahan anjing yang seropositif-Leishmania [1]. Di Brazil, dampak dari kampanye kontrol telah didukung[2-5] maupun diperlombakan [6,7], terutama karena terlalu sulit dan terdapat efikasi yang meragukan, kemungkinan akibat rendahnya sensitifitas metode-metode diagnostik [4,5,8,9] dan keterlambatan dalam melenyapkan anjing-anjing yang terinfeksi [8]. Sebuah model matematika untuk transmisi zoonotic visceral leishmaniasis (ZVL) dikembangkan oleh Dye [10] yang sebelumnya memaparkan bahwa pemusnahan anjing tidak akan berpengaruh terhadap panurunan dari populasi anjing yang terinfeksi. Analisis selanjutnya dari beberapa model yang telah terbukti, secara kontras, bahwa

pemusnahan anjing bagaimanapun mungkin akan berhasil apabila sensitivitas dari metode-metode diagnosis ditingkatkan [5,11] dan apabila waktu antara diagnosis dan pemusnahan anjing dipersingkat [11]. Dengan kata lain, salah satu kesimpulan dari model Dye ini yang diterima secara luas adalah bahwa vaksinasi profilaktik manusia maupun anjing akan bermanfaat dan merupakan alat yang poten untuk mengurangi insidensi penyakit. Generasi pertama vaksin Leishmania menggunakan BCG [12] atau muramyldipeptide [13] gagal untuk mencegah canine visceral leishmaniasis (CVL) di Brazil dan Perancis, berturut-turut, sementara penggunaan Alum+ BCG menghasilkan efikasi vaksin sebesar 69,3% dalam melawan penyakit ini di Iran [14]. Vaksin generasi kedua yang tersusun dari antigen Leishmania infantum dikombinasi dengan muramyldipeptide (LiESAp) menginduksi efikasi vaksin sebesar 92%, terekam dalam diagnosa molekuler yang sensitif di area endemik dimana tidak terdapat kematian atau terjadi kasus-kasus CVL yang berat mengindikasikan rendahnya tekanan infektif [15]. Vaksin profilaktik untuk melawan canine visceral leishmaniasis baru-baru ini telah diberikan lisensi di Brasil dibawah nama dagang Leishmune [16]. Ini merupakan lisensi dunia pertama dari vaksin generasi kedua yang melawan Leishmaniasis [17,18], terdiri dari formulasi industri dari FML-saponin vaccine yang bersifat immunoprofilaktik dan immunoterapeutik pada tikus, hamster, dan anjing [19,25] dan memperlihatkan keamanan [26], dengan 92-95% efek protektif dalam vaksinasi anjing dan dengan efikasi vaksin (vaccine efficacy/ VE) sebesar 76-80% dalam uji lapangan di Brazil [19,20]. Anjing yang divaksin dengan Leishmune memperlihatkan penurunan eksposur parasit dari serangga penghisap darah [16] dan Leishmune bertindak sebagai vaksin pemblokade transmisi (transmission blocking vaccine), meningkatkan antibodi pada anjing yang diproteksi yang akan menghalangi ikatan Leishmania dengan pertengahan saluran pencernaan (midgut) dari serangga penghisap darah dan memangkas transmisi infeksi di alam [27]. Pendahuluan hasil serodiagnosis juga mendukung temuan ini [18]. Uji terbaru dengan preparasi komersial dari Leishmune dalam 550 buah seronegatif anjing dari area endemik menyingkapkan 98,8% anjing yang

asimptomatik (pada akhir tahun) dan 99% yang bertahan dengan sehat (pada akhir tahun kedua) diantara anjing-anjing yang divaksin, dibandingkan dengan kejadian tanpa gejala sebesar 79,4% dan yang selamat yaitu sebesar 61% (p< 0,001) yang dipantau melalui untreated exposed cohort [28]. Meskipun perlindungan melalui vaksin di Brasil rendah, merupakan hal yang mungkin saat ini untuk mendeteksi reduksi dari insidensi CVL diantara anjing-anjing yang telah divaksin sebesar 66,1% (p < 0,005) dan 80,2% (p < 0,005) di Belo Horizonte dan Arac atuba, berturut-turut, ketika dibandingkan dengan insidensi global di tiap-tiap kota [28]. Pada studi yang terbaru, kami menjelaskan efek dari penggunaan Leishmune sebagai profilaksis pada anjing terhadap penurunan insidensi penyakit anjing dan manusia, setelah tiga tahun vaksinasi (2004-2006), di dua area endemik Brazil: Arac atuba, So Paulo state dan Belo Horizonte, Minas Gerais state. Kami juga menganalisis pengaruh dari vaksinasi terhadap reduksi/ penurunan proporsi anjing yang perlu dikorbankan dalam kampanye kontrol, yang bertujuan untuk mencegah epidemik. Kami juga melaporkan bahwa anjing yang divaksin dengan Leishmune, sementara sebagian seropositif dalam uji FML ELISA [19,28,29], memperlihatkan hasil yang negatif pada uji anti-Leishmania ELISA yang direkomendasikan oleh Menteri Kesehatan Brazil sebagai panitia uji kontrol, yang berarti bahwa vaksinasi Leishmune tidak mencampuri kampanye kontrol serologis.

2. Materi dan metode Dalam siklus epidemiologi VL di dunia, hanya anjing yang mampu menginfeksi serangga penghisap darah. Kontribusi manusia terhadap transmisi dianggap tidak penting [10]. Seleksi terhadap serologis anjing untuk keberadaan dari antibodi anti-Leishmania chagasi secara berkala dilakukan oleh Public Heath organs, di daerah Brazil tempat CVL dan VL endemik. Disini kami memproduksi kembali sejumlah kasus yang tercatat secara resmi di kota-kota Arac atuba (dari tahun 2002 sampai 2006), Sao Paulo state (SP), dan Belo Horizonte (BH), Minas Gerais state (MG) (dari tahun 1999 sampai 2006) [30], melalui pusat kontrol Zoonosis masing-masing. Di kedua kota ini, insektisida kontrol vektor

diaplikasikan secara berkala, bagaimanapun tidak memberantas penyakit sementara alat kontrol lainnya seperti kalung insektisida untuk anjing (insecticide impregnated dogs collars) atau kemoterapi anjing tidak sistematis tetapi hanya kadang-kadang digunakan. Daerah ini dianggap area epidemik VL dan CL yang baru di Brazil. Seperti di area endemik lainnya di Brazil [31], dan seperti yang telah direkomendasikan oleh WHO [1], kontrol epidemiologi di Arac, atuba dan Belo Horizonte adalah berdasarkan terapi dari pasien-pasien manusia, terapi insektisida dari tempat-tempat tinggal dan pemusnahan anjing-anjing yang ditemukan seropositif terhadap antigen total leishmania dari spesies Leishmania major-like ataupun Leishmania braziliensis, pada uji ELISA terhadap elusi darah menurut kebijakan Departemen Kesehatan [31], dengan menggunakan uji Biomanguinhos (Fundac o Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil) dan diteguhkan melalui uji immunofluoresensi tidak langsung (Indirect Immunofluorescency) [9,32]. Reaksi dianggap positif apabila fluorescent berada pada pengenceran 1:40. Ini merupakan nilai limit yang umum untuk diagnosis leishmaniasisis pada uji

immunofluorescence dalam kontrol lapangan di Brazil dianggap sebagai referensi oleh Brazilian National Foundation for Health (FUNASA). Metode-metode yang digunakan untuk kontrol serologis adalah kemudian identik dengan di Arac atuba dan Belo Horizonte, menentukan hasil yang bermanfaat sebagai perbandingan. Di Belo Horizonte, seleksi serologis pada anjing dikerjakan oleh Pusat Kontrol Zoonosis BH, dengan menggunakan uji ELISA terhadap eluates* darah, sejak tahun 1997. Sampel-sampel yang berasal dari Arac, atuba didiagnosis menggunakan Adolfo Lutz Institute, SP, dengan metode rekomendasi yang sama sejak tahun 2002. Data dari Arac, atuba dan Belo Horizonte [30] sesuai terhadap seleksi dari seluruh populasi anjing di kota. Tidak terdapat perubahan pada praktek-praktek pemusnahan yang terjadi selama periode studi. Data tentang jumlah total dari anjing sehat dengan seronegatif yang divaksin dengan Leishmune yang didapatkan dari perusahaan vaksin, Fort Dodge Animal Health, Campinas, SP, Brazil. Ringkasnya, vaksinasi anjing dilakukan dengan 3 dosis Leishmune (Fort Dodge Animal Health, Campinas,

SP, Brazil), dalam interval 21-hari, melalui rute subkutan (sc) [26,28] dan diberikan booster sekali pada bulan ke-12. Sebelum vaksinasi, seluruh anjing adalah seronegatif terhadap antigen FML, tidak terdapat gejala (asimptomatik) dan memperlihatkan kondisi fisik yang baik. Leishmune hanya diaplikasikan oleh dokter hewan yang terdaftar pada Fort Dodge, yang melaksanakan semua tindakan, menjaga hewan-hewan dari rasa sakit seminimal mungkin. Kami melakukan sebuah perbandingan awal diantara jumlah anjing yang menjalankan vaksinasi lengkap (termasuk booster tahunan) yang diperkirakan baik melalui jumlah dosis yang didistribusikan oleh perusahaan kepada dokter-dokter hewan (50.917) atau melalui jumlah sebenarnya dari vaksinasi anjing seperti dilaporkan oleh 26/207 klinik hewan BH dan menemukan bahwa baik kedua variabel memiliki korelasi yang tinggi (p = 0,000) juga pada jumlah prosentase kumulatifnya (p = 0,001) (hasil tidak diperlihatkan). Dengan tujuan untuk memfasilitasi analisis hasil, kami hanya memperlihatkan jumlah total dari anjinganjing yang divaksin menurut informasi perusahaan yang mana lebih mewakili. Dengan bertujuan untuk mengevaluasi reaktivitas yang mungkin dari serum anjing yang divaksin dengan Leishmune pada uji ELISA yang digunakan oleh panitia kampenye kontrol serologi untuk visceral leishmaniasis, data dari kampanye kontrol serologi pada tahun 2007 di Campo Grande, Mato Grosso state, Brazil juga diikutsertakan. Ini merupakan data resmi yang berasal dari Pusat Kontrol Zoonosis (CCZ) di Campo Grande. Sampel serum diuji antibodinya pada uji ELISA dan IF Biomanguinhos (Fundac o Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil) dan pada uji ELISA rekombinan Leishmania chagasi HSP70 (fragmen s7 dari heat shock protein HSP70-Biogene, Recife, Brazil). Untuk menguji infeksi, keberadaan amastigote** dari Leishmania diuji pada ulasan pengecatan Giemza dari sampel limfonodus maupun sumsum tulang.

2.2. Analisis Statistik

Untuk analisis korelasi koefisien kami menggunakan uji Pearsons bivariate test, two-tailed test of significance (SPSS). Untuk menguji signifikansi perbedaan diantara grup-grup, kami menggunakan rata-rata interval konfidensi sebesar 95%.

3. Hasil 3.1. Pengaruh vaksinasi Leishmune terhadap penurunan insidensi visceral leishmaniasis pada anjing dan manusia di lapangan. Kami menyelidiki apakah vaksinasi preventif dengan Leishmune memiliki efek tambahan terhadap pemusnahan anjing pada penurunan epidemik. Kami disini memperbanyak jumlah kasus-kasus ZVL resmi pada anjing dan manusia di Arac, atuba (2002-2006) (Gambar 1) dan Belo Horizonte (1999-2006) (Gambar 2). Di Arac, atuba (Gambar 1A dan B), pemusnahan anjing berdasarkan pada seropositif dimulai pada tahun 2002, mencapai maksimum pada tahun 2003 (10.527 anjing, 30,01% dari populasi total) dan mulai menurun secara signifikan selama tahun 2004. Hal ini adalah bukti baik apabila diekspresikan sebagai jumlah total dari seropositif anjing yang dimusnahkan (Gambar 2B). Jumlah dari kasus-kasus visceral leishmaniasis pada manusia

memperlihatkan kurva yang serupa dengan sebuah puncak pada tahun 2002 (52 kasus) dan sebuah penurunan yang ringan menuju akhir tahun 2003 (Gambar 1C), kemungkinan sebagai hasil dari permulaan pemusnahan anjing yang terinfeksi pada tahun sebelumnya (Gambar 1A dan B). Tetapi, meskipun hanya terdapat 25% penurunan jumlah anjing yang dimusnahkan yang diperhatikan dari tahun 2004 sampai 2005 (92686909, berturut-turut) (Gambar 1B), sebuah penurunan yang tajam sebesar 61% terlihat pada kasus-kasus di manusia selama periode yang sama (36 sampai 14 kasus). Sejak diketahui tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada populasi total anjing (30.000 ekor anjing pada tahun 2004 sampai 28.000 ekor anjing pada tahun 2005), atau alat kontrol leishmaniasis yang ditemukan selama periode ini, kami menghubungkan penurunan yang nyata pada kasus-kasus di manusia dengan permulaan vaksinasi terhadap anjing-anjing sehat

seronegatif, dengan vaksin preventif Leishmune setelah pemberian lisensinya pada bulan agustus 2004.

Gambar 1. Efek tambahan dari vaksinasi anjing dengan Leishmune pada pemusnahan anjing-anjing yang terinfeksi pada penurunan insidensi human

visceral leishmaniasis di Arac, atuba. (A) Evolusi dari jumlah seropositifleishmania pada anjing yang dikorbankan dalam kempanye kontrol dari tahun 2002 sampai 2006; (B) evolusi dari seroprevalensi anjing ( persen dari jumlah anjing dengan seropositif-leishmania diantara populasi anjing total) yang dimusnahkan oleh kempanye kontrol dari tahun 2002 sampai 2006; dan (C) evolusi dari jumlah kasus VL pada manusia dan manusia yang meninggal dari tahun 1999 sampai 2006.

Gambar 2. Efek tambahan dari vaksinasi anjing dengan Leishmune pada pemusnahan anjing yang terinfeksi terhadap penurunan insidensi human visceral leishmaniasis di Belo Horisonte. Evolusi dari prosentase anjing dengan seropositif yang dimusnahkan oleh kempanye kontrol sepanjang waktu (dari tahun 1999 sampai tahun 2006) di wilayah dengan peningkatan (A) dan pengulangan atau penurunan insidensi pada manusia setelah dimulainya pemberian vaksin Leishmune (C). Peningkatan jumlah kasus-kasus VL pada manusia sepanjang waktu (dari tahun 1999 sampai 2006) (B) dan penurunan atau jumlah yang diulang dari insidensi kasus-kasus pada manusia di wilayah dengan tingginya perlindungan vaksin Leishmune (D).

Penurunan yang terdeteksi pada insidensi penyakit dari manusia dan anjing menjadi hasil dari efek tambahan dari vaksinasi Leishmune terhadap 5,7% anjing sehat (1419 ekor anjing) pada pemusnahan anjing secara berkala, yang ditnjukkan dengan penurunan sebesar 29%, dari tahun 2004 (30,89%) sampai tahun 2006 (21,77%). Gambaran yang berbeda didapatkan melalui analisis data dari area endemik lainnya: kota Belo Horizonte, yang dibagi ke dalam 9 wilayah. Pada

Gambar 2, kami menyajikan distribusi kasus-kasus CVL (Gambar 2A dan C) dan kasus-kasus humanVL (Gambar 2B dan D), selama periode 1999-2006. Istilah seroprevalensi anjing atau canine seropositivity mengindikasikan persentase dari total seropositif anjing pada uji ELISA. Ini adalah pada anjing dengan CVL, yang selanjutnya dikorbankan untuk dimusnahkan, oleh karena itu kami juga mengacu pada penghitungan ini, sebagai kasus-kasus dari CVL atau penyakit insidensi pada anjing. Menurut catatan, peningkatan insidensi pada anjing dan manusia berkorelasi secara signifikan (p = 0,000), menegaskan pentingnya anjing sebagai infeksius reservoir dari penyakit ini. Data yang ada sangatlah impresif, sejak diketahui jumlah total anjing di kota lebih tinggi dibandingkan dengan Arac, atuba (149.470 ekor, pada tahun 2005) dan perbedaannya didapakan melalui ko-evaluasi dari kasus-kasus pada anjing dan manusia, dimulai dari bulan Agustus 2004, ketika vaksin mulai digunakan. Pada Gambar 2 kami mendapatkan kurva yang meningkat (naik) pada anjing (Gambar 2A) dan insidensi pada manusia (Gambar 2B) di wilayah Barreiro, Venda Nova dan Noroeste, serta kurva dari insidensi anjing (Gambar 2C) dan manusia (Gambar 2D) di wilayah Centro Sul, Leste, Nordeste, Norte, Pampulha and Oeste, yang mulai menurun atau mempertahankan kondisi yang stabil setelah vaksinasi Leishmune yang dimulai pada tahun 2004. Pada tabel 1, kami kemudian memisahkan wilayah menurut variasi persentual dari insidensi pada manusia dari tahun 2004 sampai 2006. Sementara wilayah Oeste memperlihatkan tidak adanya variasi dan Centro Sul, Leste, Nordeste, Norte dan Pampulha memperlihatkan nilai persen yang menurun dari insidensi pada manusia (Tabel 1 kolom 10), Barreiro, Venda Nova dan Noroeste memperlihatkan peningkatan insidensi pada manusia untuk periode waktu yang sama. Diantara wilayah-wilayah memperlihatkan penurunan insidensi pada manusia, Centro sul, yang mana memperlihatkan persen vaksinasi yang tertinggi (63,27% dari anjing-anjingnya) juga penurunan sebesar 3,36% pada insidensi anjing dan Pampulha,yang memvaksin 27,27% anjing-anjingnya, memperlihatkan hanya peningkatan sebesar 1,89% pada insidensi anjing (Ttabel 1, kolom 8 dan 6). Kemudian diikuti oleh Oeste, yang memvaksin 25,30% hewan-hewannya dan mengalami peningkatan hanya sebesar 12,86% dari insidensi anjing dan oleh

Leste dan Nordeste, dengan proporsi vaksin yang lebih rendah (11,27% dan 10,76%, berturut-turut) dan mungkin karenanya, insidensi pada anjing yang sedikit lebih tinggi (42.77% dan 35.73%), tetapi masih memperlihatkan jumlah yang menurun terhadap kasus-kasus pada manusia. Proporsi lebih rendah yaitu pada anjing yang divaksin di wilayah-wilayah Venda nova (4,35%) dan Noroeste (10,27%) , yang mana menurut peningkatan insidensi pada anjing (24.48% dan 21.85%, berturut-turut), dan peningkatan insidensi pada manusia secara nyata (Tabel 1, kolom 8,6 dan 10). Akhirnya, proporsi terendah dari anjing yang divaksin (0,09%) didapatkan di Barreiro yang, menurut hal tersebut, menampilkan peningkatan yang paling jelas pada insidensi anjing (328,57%) dan manusia (17%) (Tabel 1). Sejumlah total 12.113 anjing kemudian divaksin di Belo Horizente mulai tahun 2004 sampai 2006 menyebabkan populasi anjing total menjadi 8,1% (149.470). Hasil ini mengindikasikan bahwa, pada saat proporsi vaksinasi anjing dengan Leishmune meningkat, insidensi dari penyakit anjing, proporsi anjing yangdikorbankan, dan insidensi pada manusia menurun bersamaan,

mengindikasikan adanya efek tambahan dari vaksinasi selama pemberantasan hewan dalam kontrol CVL di lapangan, dan pengaruhnya yang mungkin terjadi terhadap insidensi manusia pada VL. Mendukung kesimpulan kami, penurunan dari insidensi pada anjing (p = -0,008) dan manusia (p = -0,048) secara langsung berkorelasi terhadap peningkatan jumlah dari anjing yang diaksin, menegaskan pengaaruh penggunaan vaksin Leishmune sebagai perlindungan pada anjing, penurunan reservoir penyakit, dan dalam hal ini mengurangi resiko transmisi visceral leishmaniasis ke manusia. Masih dalam rangka mendukung intepretasi kami, nilai rata-rata dari kelompok wilayah, jumlah total dan jumlah seropositif anjing (Tabel 1, kolom 3 dan 4), seperti halnya dengan insidensi pada anjing (Tabel 1, kolom 5) dari wilayah yang paling banyak divaksin tidaklah berbeda dengan wilayah-wilayah yang lebih sedikit vaksinasi atau dengan wilayah yang tidak terawat, sejak didapatkan nilai rata-ratanya jatuh di dalam CI 95% dari masing-masing wilayah yang tidak di terawat (Tabel 1). Hal ini mengindikasikan bahwa kekuatan infeksius atau endemisitas dari kedua grup wilayah bersifat heterogenous dan kompatible (cocok). Dengan kata lain, lebih banyak anjing yang

mendapatkan vaksinasi di Centro Sul, Leste, Nordeste, Norte, Pampulha dan Oeste districts (rata-rata 1271,89 ekor anjing/tahun) (Tabel 1, kolom 7) daripada di Barreiro, Venda Nova dan Noroeste (388,11 ekor anjing/tahun; CI 95% 82.35 693.87). Tentu saja, persen dari dosis total yang digunakan di wilayah dengan vaksinasi tinggi adalah sebesar 85,7% (43.643 dari 50.917) sementara area dengan vaksinasi rendah hanya menggunakan 14,3 % dari dosis (7274 dari 50.917), dan persen kumulatif dari vaksinasi anjing lebih tinggi di Centro Sul,

Leste,Nordeste,Norte, Pampulha dan Oeste (23,12%), daripada di wilayah Barreiro, Venda Nova dan Noroeste (4,90; CI95%2,18 to 11,98) (Tabel 1, kolom 8). Secara simultan dan dalam catatan, pada enam wilayah yang memperlihakan vaksinasi tinggi, jumlah dari kasus-kasus pada manusia memperlihatkan rata-rata penurunan sebesar 36,5% dari tahun 2004 sampai 2006, jatuh diluar nilai CI 95% pada wilayah dengan vaksinasi yang rendah (CI 95% 2,2321,11) yang malah memperlihatkan rata-rata peningkatan sebesar 11,67% (Tabel 1, kolom 10) Distribusi dari VL di wilayah Norte mendasari satu-satunya pengecualian yang memperlihatkan penuruna insidensi pada manusia (-41%)) (Tabel 1) dan rendahnya peningkatan insidensi pada anjing 912,42%), bagaimanapun tidak berhubungan dengan vaksinasi Leishmune yang mana sangat rendah (0,4 % dari anjing-anjing) (Tabel1). Hasil ini mungin berhubungan dengan faktor-faktor lainnya (terapi insektisida pada tempat-tempat tinggal, dengan status sosioekonomi), yang mana tidak dianalisis pada penelitian kali ini, sejak diketaui belum terdapat data komparatif kuatitatif dari variabel-variabel lain yang tersedia bagi kami. Meskipun seluruh variabel sudah ada sebelum dimulainya terapi vaksin, dinamika epidemiologi komplek dari CVL dan VL pada BH, termasuk seluruh alat yang digunakan sebagai kontrol menyediakan studi lebih lanjut yang terintegrasi. Sampai akhir tahun 2007, sebanyak 7,513% (1713/22.800) ekor anjing di Arac, atuba dan 11,03% (17.165/155.643) anjing di Belo Horizonte divaksin dengan Leishmune. Meskipun dalam perlindungan vaksin yang rendah, jumlah anjing infeksius perlu yang perlu dikorbankan oleh kampanye kontrol menglami penurunan di Arac, atuba dan di wilayah yang paling sering vaksinasi seperti Belo

Horizonte, dan jumlah dari kasus-kasus pada manusia juga secara segnifikan menurun baik di kedua kota mengindikasikan bahwa vaksinasi profilaktik dengan Leishmune mulai digunakan sebagai alat kontrol. Sejak diketahui bahwa vaksin FML-saponin-Leishmune dikenal dalam kapasitasnya yang kuat dalam menggerakkan antibodi anti-FML, terdapat perhatian utama mngenai kemungkinan campur tangan dari antibodi vaccinial pada kampanye kontrol serologi untuk VL. Data kami yang didapatkan pada tahun 2007 mengecualikan kemungkinan ini (Tabel 2). Di kota Campo Grande-Mato Grosso, suatu area endemik dan epidemik yang penting baik untuk visceral leishmaniasis pada manisua maupun anjing, sampel-sampel darih dari 110.000 anjing (seluruh populasi anjing) dikoleksi pada tahun 2007. Sejumalah total 5680 ekor anjing divaksin dengan Leishmune dilibatkan dalam seleksi ini. Sampel serum dari seluruh 110.000 ekor anjing didapatkan dan diuji menggunakan ELISA. Hanya sebanyak 76 ekor dari 5860 ekor anjing yang divaksin yang memperlihatkan seropositivity pada uji ELISA yang selanjutnya dapat ditegaskan melalui hasil dari uji IF, menggabungkan 1,3% dari seluruh populasi yang divaksin. Anjing yang sama menunjukkan tidak terdapat antibodi untuk antigen heat shock protein recombinant dan tidak terdapat parasit baik pada limfonodus maupun sumsum tulang, menegaskan anjing-anjing tersebut tidak membawa infeksi leishmania (Tabel 2). Hasil kami membuktikan bahwa meskipun terdapat perhatian sebelumnya, vaksinasi Leishmune tidak bertentangan dengan kontrol serologis dari CVL.

4. Pembahasan Profilaktik [19,28], immunoterapeutik [24,25] dan transmisi blocking effect pada vaksin Leishmune [16,18,27] menunjukkan kegunaan potensialnya terhadap penurunan populasi anjing dan manusia yang terinfeksi dan untuk mencegah epidemik. Anjing yang terpapar oleh vaksin Leishmune

memperlihatkan bukti tidak adanya parasit dalam darah, limfonodus dan kulit [16]. Antibodi yang digerakkan oleh vaksin akan menghalangi perkembangan parasit pada serangga penghisap darah, seperti yang diperlihatkan melalui uji membran in

vivo [18,27] dan melalui pendahuluan hasil xenodiagnosis [18], menyebabkan penghalangan transmisi parasit di alam. Sebelum lisensi vaksin diberikan, sebuah uji keamanan dan immunogenesitas memperlihatkan bahwa 98,8% dari 550 anjing yang divaksin pertama kali telah terproteksi dan sehat selama dua tahun setelah vaksinasi [28]. Baru-baru ini, klinik hewan dari berbagai daerah di Brazil melaporkan bahwa diantara 8393 anjing yang terpapar, yang divaksin mulai dari bulan Agustus 2004 sampai Agustus 2008, hanya sebanyak 229 ekor yang mengembangkan penyakit, mewakili 97,3% proteksi yang dicapai (absennya gejala maupun tanda-tanda CVL yang lengkap). Data ini menggabungkan 67 dari 228 klinik yang berasal dari kota-kota yang berbeda di bagian barat Sao Paulo state yang melaporkan proteksi pada 4626/4752 anjing yang divaksin, 15 di antara 207 klinik d Belo Horizonte, pada 1817/1864 anjing dan 7 diantara 59 klinik di Campo Grande (Mato Grosso do Sul state) pada 1721/1777 anjing yang divaksin, membuatnya 97% protektif di tiap area masing-masing. Lebih jauh lagi, total dari 65.000 ekor anjing yang sehat telah divaksin dengan Leishmune di Brazil sampai Oktober 2008. Sebagai vaksin yang berperan melawan zoonosis pada anjing, generasi dari proteksi terhadap anjing diharapkan menghasilkan penurunan reservoir parasit, jumlah anjing yang menginfeksi serangga penghisap darah dan selanjutnya, terhadap penurunan kasus-kasus pada manusia [10]. Kasus-kasus VL pada manusia tentu saja menurun dari 15 sampai 0 pada area tempat formulasi pre-komersial dari Leishmune (the FML saponin vaccine) pertama kali diuji, dilapangan Fase III memperlihatkan proteksi sebesar 92-95% dan efikasi vaksin sebesar 76-80% terhadap anjing [19,20]. Model matematika untuk kontrol leishmaniasis dikembangkan oleh Dye [10], telah menunjukkan bahwa vaksin anjing dapat menjadi alat yang sempurna dan potensial untuk menurunkan insidensi penyakit baik pada manusia maupun anjing. Pengembangan vaksin anti-zoonotik untuk reservoir hewan, bertujuan terhadap penurunan selanjutnya dari kasus-kasus di manusia pada penyakit yang secara kuat mendukung [1,10,33]. Meskipun sejumlah kecil vaksin CVL dipelajari pada uji lapangan fase III [1215,34], dan dua diantaranya memperlihatkan

efikasi [14,15], tidak terdapat data mengenai manfaat dari uji ini terhadap penurunan penyakit pada manusia yang pernah dilaporkan. Kami memilih, untuk studi ini, kota-kota di Arac atuba dan Belo Horizonte, karena disamping vaksinasi Leishmune tidak terdapat alat kontrol resmi lainnya yang digunakan disana, kecuali untuk pemusnahan anjing dan terapi insektisida di tempat-tempat tinggal. Waspada terhadap kemungkinan dari campur tangan pada sensitifitas dalam berbagai uji serologi yang bebeda pada sejumlah anjing yang terdeteksi seropositif [5,6,9,19,35,36] kami memilih, untuk studi kami, kota Arac atuba dan BH yang berbagi metode dan posedur yang sama pada kampanye kontrol epidemiologi. Karenanya, sensitivitas bukan merupakan suatu variabel. Informasi yang detail mengenai terapi insektisida berkala pada tempattempat kediaman di wilayah yang berbeda di Belo Horizonte tidak tersedia untuk kami [30]. Oleh sebab itu, bukannya tidak mungkin untuk melakukan analisis korelasi yang bertujuan untuk mengeluarkan faktor-faktor ini sebagai variabel yang mungkin yang dapat mempengaruhi insidensi. Hal yang sama yang terjadi dengan sejumlah anjing yang diberikan kemoterapi, yang mana masih tidak direkomendasikan oleh WHO dan Menteri kesehatan Brazil, serta oleh Social Vulnerabilty index [37], yang mewakili status sosio-ekonomi yang berbeda dari wilayah yang berbeda pula [30]. Studi terintegrasi dengan data numerik dari seluruh variabel yang mungkin ini harus dilakukan untuk mengevaluasi kontribusi yang mungkin dari tiap terapi. Bagaimanapun, sejak diketahui tidak terdapat perubahan pada alat diagnostik serologis, kebijakan pemerintah atau terapi insektisida di Arac atuba dan BH selama dan sebelum periode studi (sejak tahun 2002 di Arac, atuba dan sejak tahun 1997 di BH), pad saat insidensi meningkat, dan penurunan pada kasus-kasus di manusia dan anjing hanya dimulai setelah pemberian vaksinasi Leishmune, hasilnya menunjukkan bahwa variabel yang hanya mempengaruhi insidensi adalah vaksin. Selama periode yang sama, penurunan dari kasus-kasus pada anjing juga telah tercatat (Dr. Aziz Abdelnour, Centro de Controle de Zoonoses of Andradina, komunikasi personal) di Andrandina, suatu kota lain di So Paulo state yang menggunakan vaksinasi Leishmune dan tempat kalung insektisida anjing diperkenalkan sebagai alat

kontrol tambahan yang resmi untuk penyakit ini. Untuk alasan ini kami tidak memasukkan data dari Andriana dalam studi kami, disamping hasil yang signifikan yang didapatkan sebelumnya mengindikasikan bahwa pada anjing yang tidak terawat tetap bersifat infeksius pada saat tidak dilakukan vaksinasi Leishmune, tidak peduli apakah anjing-anjing tersebut menggunakan kalung insektisida delta-methrin atau tidak [16]. Sementara, penurunan penyakit pada manusia dan anjing di Arac, atuba sangatlah jelas seluruhnya, sejak diketahui populasi total anjing dan manusia ini kecil, maka distribusi penyakit di Belo Horizonte akan lebih kompleks. Kami sebelumnya memisahkan wilayah menurut variasa insidensinya pada manusia sepanjang waktu. Kami mendeteksi bahwa variasi insidensi pada anjing mengikuti variasi insidensi pada manusi pada wilayahnya masing-masing, dan akhirnya didapatkan bahwa penurunan kasus-kasus insidensi pada manusia dan anjing memiliki korelasi yang tinggi terhadap penggunaan vaksin Leishmune. Tentu saja, vaksin memiliki efek tambahan pada anjing yang dimusnahkan pada kontrol dari VL. Wilayah yang memperlihatkan vaksinasi yang intens hanya perlu mengorbankan sedikit anjing dalam rangka menjaga jumlah kasus-kasus pada manusia tetap rendah. Wilayah yang memiliki proporsi vaksinasi anjing yang lebih rendah, perlu mengorbankan anjing-anjing yang terinfeksi lebih banyak. Vaksinasi dengan Leishmune kemudian bertindak sebagai alat kontrol dengan efek penambahn pada pemusnahan anjing dan hasil dari kami mengindikasikan bahwa peningkatan di masa yang akan datang terhadap vaksinasi anjing mungkin menggantikan pemusnahan anjing dalam kontrol epidemiologi VL. Menurut model matematika pada kontrol leishmaniasis yang

dikembangkan oleh Dye [10], efikasi yang diharapkan terhadap vaksin dalam menurunkan insidensi penyakit pada anjing diungkapkan dengan menempatkan insidensi pada anjing setelah vaksinassi pada axis y setelah vaksinasi dibagi oleh insidensi anjing sebelum vaksinasi dan diekspresikan dalam persen, serta fraksi dari anjing yang peka yang dikonversi ke resistensi oleh terapi vaksin pada axis x. Di Arac, atuba insidensi anjing setelah vaksinasi menurun dari 30,01% (2003) sampai 21,77% (2006) memberikan rasio dalam persen sebesar 72,54% yang

cocok dengan perubahan sebesar 25% dari populasi anjing dari yang rentan/ peka ke resisten ateu terproteksi. Perlindungan dari vaksin yang lebih ekstensif pastinya akan memvantu dalam mencegah epidemik. Di Belo Horizonte, di sisi lain, penurunan insidensi pada manusia didapatkan setelah vaksinasi anjing di beberapa wilayah. Di wilayah Nordeste, kasus-kasus pada manusia menurun dari 24 menjadi 18, memberikan rasio dalam persen sebesar 72% yang mana cocok dengan 28% persen populasi manusia yan bergerak ke kelas resisten. Di wilayah Leste, kasus-kasus pada manusia menurun dari 16 manjadi 6, memberikan rasio dalam persen sebesar 37,5% yang sesuai dengan 62% populasi manusia yang menjadi resisten atau secara tidak langsung terproteksi. Hal ini dicapai dengan vaksinasi hanya sebesar 11,03% dari seluruh populasi anjing. Peningkatan dari perlindungan vaksin tentunya akan mendekatkan kepada pencegahan dari epidemik. Terdapat perhatian bahwa vaksin Leishmune dapat mengakibatkan serokonversi yang dapat dideteksi melalui metode diagnostik yang digunakan oleh panitia kampanye survey kontrol [29]. Telah dibantah bahwa vaksinasi anjing dapat membingungkan dengan anjing yang terinfeksi. Apabila seropositivitas yang diinduksi dengan vaksin dapat begitu signifikan, salah satu akan mengharapkan adanya peningkatan seroprevalensi anjing di area-area yang lebih banyak divaksin. Temuan-temuan yang diungkapkan oleh penelitian ini mendukung efek yang berlawanan, sejak diketahui wilayah BH yang mengalami banyak vaksinasi memperlihatkan seroprevalensi yang paling rendah. Oleh karenanya, perhatian ini tidaklah dijustifikasi. Tentu saja, hanya sebesar 1,3% dari vaksin-vaksin Leishmune yang seropositif dalam uji yang resmi dan sejak mereka meperlihatkan tidak adanya parasit dan antibodi dalam melawan protein heat shock dari L. Chagasi, mereka dianggap tidak terinfeksi dan kemudian tidak dikorbankan. Hasil ini sangat signifikan, menganggap bahwa analisis dilakukan pada sampel serum, sebagai ganti dari elusi darah, mengubah sensitivitas menjadi lebih tinggi [5]. Anjing yang divaksin dengan Leishmune memperlihatkan 50-98% seropositivitas-FML setelah vaksinasi lengkap [19,28]. Pada penelitian kali ini, FML, suatu glikoprotein antigen spesifik murni yang berglikosilasi tinggi [38] dari Leishmania donovani, adalah baik sebagai antigen vaksin maupun antigen

dalam uji diagnostik. Karenanya, dapat dikenali dengan antibodi anti-FML dengan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Dengan kata lain, total promastigote lysate dari Leishmania major dan Leishmania brasiliensis, yang merupakan antigen-antigen dari uji ELISA resmi yang digunakan untuk seleksi, dapat bereaksi dengan seluruh antibodi yang digerakkan selama multiplikasi parasit pada hospes yang terinfeksi. Pada saat antigen FML yang dimurnikan berinteraksi dengan fraksi yang tergambar dari serum antibodi, total lysate berinteraksi dengan seluruh plethora/ kelebihan antibodi yang secara langsung melawan seluruh parasit, membungkus atau mengencerkan respon dalam melawan antigen FML yang dipurifikasi, yang mana bukan merupakan antigen utama Leishmania. Perbedaan pada hasil kemudian disebabkan karena perbedaan afinitas dari antigen-antigen. Hasil kami memperlihatkan bahwa, seropositivitas yang diinduksi oleh vaksin Leishmune tidak mencampuri kampanye kontrol. Suatu perbedaan yang serupa dilaporkan dalam hubungannya dengan predominan antibodi subtipe IgG [17]. Pada anjing, vaksinasi dengan CPa dan CPb cystein proteinases, kerja dari Rafati et al. (2005) [39] memperlihatkan bahwa titer IgG2 dan IgG1 yang lebih tinggi terdeteksi dalam melawan antigen vaksin rekombinan tetapi tidak dalam melawan lysate dari Leishmania infantum [17,39]. Dalam mendukung temuan kami, studi komparatif baru-baru ini yang dikembangkan oleh Grecco F dan Allegretti (komunikasi personal) pada anjing-anjing yang divaksin Leishmune yang berasal dari area endemik, mengungkap 73% hasil yang positif pada uji FML ELISA (19 sampel diantara jumlah total 26), reaktifitas sebesar 0% pada uji anti-leishmania yang resmi (24 negatif dan 3 sampel tidak terdefinisi) dan reaktivitas 0% (28 sampel, seluruhnya negatif) di laboratorium yang dipersiapkan sebagai tempat untuk uji ELISA anti- Leishmania chagasi. Data analisis epidemiologi pada penelitian ini merupakan data terbaik yang digabungkan dari lapangan sehubungan dengan pengaruh dari vaksin antiLeishmania. Suatu uji pada fase IV, telah direkomendasikan oleh WHO sebagai vaksin yang langsung memperlihatka efikasi sebesar 50% dalam sebuah uji kontrol random double-blind fase III [40]. Pada uji fase IV, vaksinasi dilakukan pada populasi yang besar (10.000 sampai 100.000 individu) dan pengaruh dari

vaksin diukur melalui perbedaan insidensi sebelum dan sesudah pemberian vaksin. WHO merekomendasikan trail fase IV untuk digunakan dalam pada kontrol yang tidak diberi vaksin pada saat efikasi dari vaksin telah dibuktikan pada uji fase III dan vaksin tersebut dipasarkan [40]. Sejak diketahui belum terdapat uji tertentu yang dilakukan oleh pemerintah Brazil dengan menggunakan Leishmune, data yang diperlihatkan disini merupakan perkiraan terbaik dari pengaruh penggunaan Leishmune, terutama yang menganggap bahwa di Belo Horizonte, eksistensi dari wilayah dengan sedikit perlakuan vaksinasi menyediakan kontrol tanpa perlakuan yang potensial. Diantara berbagai formulasi yang diuji sebagai vaksin anti-Leishmania, Leishmune merupakan salah satu dari ketiga vaksin yang berlisensi dan dikomersialkan diseluruh dunia, merupakan satu-satunya macam dari degenerasi kedua dan satu-satunya yang dapat melawan penyakit pada anjing [17,18]. Menurut pengetahuan kami, Leishmune merupakan vaksin anti-Leishmania pertama yang digunakan dalam skala besar di lapangan dan untuk menginduksi penurunan kasus-kasus penyakit pada manusia dan anjing dalam studi ini, dan meskipun perlindungan vaksin Leishmune sejauh ini dianggap rendah, kami memperlihatkan bahwa vaksinasi terhadap anjing sebesar 11,3 % (17.165 dari 155.643) di Belo Horizonte dan sebesar 1,513% pada anjing-anjing di Arac, atuba (1713 dari 22.800) telah mulai menjadi alat kontrol, vaksin proteksi, mengurangi reservoir parasit terhadap anjing yang terinfeksi dan populasi manusia dan juga menurunkan jumlah anjing-anjing yang dikorbankan. Penggunaan luas dari Leishmune tentunya akan membantu eradikasi penyakit.

*eluate: a liquid solution that results from elution **Amastigote: Suatu sel yang tidak memiliki flagela apapun