PENGANTAR KROMATOGRAFI

Oleh:
Purwadi, M.Si.

UNIVERSITAS TULANG BAWANG, 2009

Purwadi, S.Si. M.Si.

abuaidhan@yahoo.com

Graduated from: Master of Science with Cume Laude, School of Pharmacy - Institut Tecnology of Bandung, 2007 Bachelor of Science in Chemistry, University of Lampung, 1999 Office:

NQCLDF in Bandar Lampung, Deputy of Technical Manager Testing Laboratoria for Therapeutics, Narcotics, Traditional Drugs, and Complement Product
Supervisor for Cosmetic and Forensic testing Laboratory

Competence for:

Gas Chromatography High Performance Liquid Chromatograpy UV/Vis Spectrophotometry Spectrophotodensitometry Spectrofluorometry

Validation of Analysis Method

ISO/IEC 17025-2005: Management & Technical Prerequirement for Testing Labotorium

Materi Ujian Total

: 14 kali : 2 kali (UTS & UAS) : 16 kali

Metode Belajar: Ceramah Diskusi

Tugas
Kehadiran mahasiswa minimum 75% Keterlambatan maximum 15 menit Mahasiwa diharap aktif mencari literatur,bertanya dan diskusi

Metode Pemisahan
Ilmu Pemisahan (Sparation Science): Ilmu yang mempelajari gejala fisika dan kimia yang terlibat dalam proses /pencapaian pemisahan, pengembangan & penggunaan berbagai proses pemisahan.

Definisi Pemisahan menurut Karger:

Cara kerja / pengerjaan sehingga suatu campuran dibagi menjadi sekurang-kurangnya 2 fraksi yang berbeda susunannya.

Definisi Pemisahan menurut Rony:

Kondisi hipotetik di mana setiap komponen kimia terisolasi sempurna dalam daerah makroskopik yang terpisah

Hipotetik karena tidak mungkin mengisolasi komponen suatu campuran secara sempurna.

Teknik Pemisahan
a. Ekstraksi Pelarut b. Pengendapan c. Kopresipitasi d. Elektrodeposisi e. Pertukaran ion f. Adsorbsi/desorbsi g. Volatilisasi (destilasi, sublimasi, dll)

h. Absorbsi

i. Kromatografi, mekanisme: > adsorbsi > Partisi > pertukaran ion > eksklusi > pengayakan molekul > afinitas j. Dialisis 10000 15000 20000

k. Elektroforesis
l. ultrasentrifugasi

Cara memilih Teknik pemisahan

1. Pilih langkah terbesar pada step pertama jika mungkin termurah. Misal ekstraksi pelarut 2. Pilih proses pemisahan yang didasarkan pada perbedaan sifat fisika. Misal muatan (pertukaran ion), ukuran (filtrasi gel, sentrifugasi) 3. Pilih proses dimana mengeksploitasi perbedaan terbesar sifat fisika antara analit/produk dengan matriks/pengotor 4. Pilih langkah termahal pada saat terakhir, misal hplc

Tujuan Pemisahan kimia:

1. Telaah Fitokimia -struktur Bahan alam simplisia Ekstraksi Penapisan fitokimia

Ekstrak Fraksinasi
Fraksi Pemisahan/ pemurnian Isolat Karakterisasi & Identifikasi Struktur kimia

2. Isolasi Senyawa Model /Lead Compound - biasanya punya efek - tidak harus dominan

3. Bahan Baku sediaan

Hasil ekstrak dapat digunakan untuk membuat sediaan 4. Uji farmakologi pada hewan coba

Bahan alam
Simplisia Ekstrak Uji efek

Fraksi
Sub-fraksi Sub-fraksi

Fraksi
Sub-fraksi Sub-fraksi Uji efek

Isolat

Isolat

Isolat

Isolat

Uji efek

Dalam teknik pemisahan, selalu terdapat fase-fase : Fase 1 Fase 2

Kecuali : elektroforesis dan ultrasentrifugasi hanya melibatkan satu fase.

Nama fase dalam beberapa metode pemisahan

Metode
Kromatografi Eksraksi Cair-Cair

Fase 1
Diam Rafinat

Fase 2
Gerak Ekstraktan

(yang sudah ada)

Dialisis Retentat (di tabung)

(yang ditambahkan)
Difusat/dialisat (yang didialisa)

Penggolongan Metode Pemisahan

A. Berdasarkan Wujud Fase Fase 1 Fase 2 keterangan

Gas Gas Cair Padat Gas Cair Padat Difusi termal Krom. Gas-Cair Krom. Gas-Padat Destilasi Krom. Cair-Cair, Ekstraksi, dialisis, ultrasentrifugasi. Krom. Cair-Padat, pengendapan, elektrodeposisi, kristalisasi, pemebrntukan senyawa, inklusi Sublimasi Leaching

Cair

Padat

Gas Cair

dengan Fase 1: fase awal /mengandung cuplikan sendiri Fase 2: fase yang ditambahkan / yang terbentuk

B. Berdasarkan asal Fase 2

Fase 2 ditambah Fase 2 terbentuk Kromatografi Destilasi ECC Pengendapan Dialisis kristalisasi Elektroforesis Penghabluran zona Pengendapan

C. Berdasarkan lama fase berkontak

Kontak sinambung Kromatografi ECC (Craig) SOKLETASI

Kontak bertahap ECC (corong pisah)

D. Berdasarkan arah fase berkontak

Lintas arus (Cross Current) ECC (corong pisah)

Lawan Arus (Counter Current) ECC (Craig)

diam

Lawan arus: pada kenyataannya fase yang satu tidak bergerak, fase yang lain bergerak lebih tepat disebut lawan arus semu (Pseudo counter current)

E. Berdasarkan jenis proses

Proses mekanis

Proses fisis

Proses Kimia

Pengayakan Filtrasi/pengayakan Sentrifugasi Krom. Gas-Cair Krom. Gas-Padat Krom Cair-Cair ECC Destilasi, Sublimasi Pengendapan Krom. Pertukaran ion

Kromatografi 1. Merupakan salah satu teknik pemisahan kimia 2. Berkembang pesat => penemuan perangkat alat baru dan aplikasi baru 3. Dikembangkan untuk analisis kualitatif, kuantitatif, dan preparatif

Definisi Kromatografi Menurut STAHL: Metode fisikokimia untuk memisahkan campuran zat berdasarkan perbedaan waktu huni (residence time) masingmasing zat dalam fase gerak-fase diam Senyawa A lebih dulu keluar karena waktu huni < senyawa B

Menurut Martin:
Metode Fisikokimia yang memisahkan suatu campuran berdasarkan perbedaan perpindahan linarut dalam fase gerakfase diam => Senyawa A lebih dulu keluar karena bergerak lebih cepat dari senyawa B

Sejarah kromatografi

Pemakaian Kromatografi:
Analitik:
= Kualitatif: Mengetahui identitatas suatu analit = kuantitatif : menentukan kadar analit Preparatif: = untuk mendapatkan komponen murni

Penggolongan kromatografi: a. Berdasarkan fase gerak => kromatografi cair: KLT, KK, KKt, KCKT => Kromatografi gas: KGC, KGP

b. Berdasarkan fase diam

=> kromatografi Cair-Cair: KKt, KCKT => Kromatografi Cair-Padat: KLT, KK, KCKT

c. Berdasarkan penampang fase diam: => kromatografi datar / planar: KLT, KKt => kromatografi kolom: KK, KGC, KGP, KCKT

d. Kromatografi berdasarkan proses/mekanisme yang terjadi => Partisi => Adsorbsi => Pasangan Ion => Kromatografi Penukar Ion => size eksklusi => Permeasi gel => Filtrasi gel => afinitas biologi

Teori Kromatografi
Pemisahan dalam kromatografi terjadi karena Perbedaan kecepatan migrasi dari berbagai komponen dalam campuran Dengan kata lain, pemisahan terjadi karena perbedaan waktu tambat masing-masing analit dalam fase diam

Penyebaran komponen campuran sepanjang fase diam

Sampel campuran
Arah aliran fase gerak

Kolom / fase diam

Analit dengan migrasi paling cepat

Mengapa terjadi Perbedaan kecepatan migrasi ?

Dalam sistem kromatografi masing-masing analit akan terdistribusi antara fase diam dan fase gerak sehingga membentuk kesetimbangan. Jumlah distribusi analit di antara 2 fase ditentukan oleh konsntanta distribusi (Kd): Kd A = [A]d / [A]g [A]d = konsentrasi analit A dalam fase diam

[A]g = konsentrasi analit A dalam fase gerak

Jika Kd besar konsentrasi analit dalam fase diam lebih besar dari pada dalam fase gerak Senyawa A lebih lama tinggal dalam fase diam

KD besar

KD kecil