BAB III Metodologi Kerja

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan mulai bulan Januari 2008 hingga Juni 2008 di Laboratorium Analisis Ekosistem Akuatik, Departemen Biologi, Institut Teknologi Bandung. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Organisme Uji Organisme uji yaitu Daphnia magna didapat dari laboratorium kultur perairan PT. Sumber Daya Air (PUSAIR) yang bertempat di Jl.Ir.H. Juanda no. 193. D. magna yang digunakan ukuran dewasa, yaitu ukuran antara 2 5 mm, dengan usia kurang lebih 7 hari. 3.2.2 Alat Berikut adalah alat yang digunakan selama penelitian :
Tabel 1. Alat penelitian

Alat Akuarium Gelas beker pH meter DO meter Counter Spektrofotometer Pipet Gelas ukur Jala plankton Aerator dan selang aerator Batu aerasi Thermostat Gelas beker

Ukuran 30 x 20 x40 cm 1L 10 ml 20 ml

Jumlah 3 9 1 1 1 1 set 3 1 3 1 set 9 3 3

Pengatur aerasi 9 Akuarium dan gelas beker disusun untuk membuat wadah kultur. Aerator, selang aerator, pengatur aerasi, dan batu aerasi digunakan sebagai suplai oksigen untuk kultur. Thermostat dipasang di akuarium sebagai penstabil suhu kultur (Gambar 3). Beberapa alat lainnya seperti pH meter, DO meter, dan spektrofotometer digunakan untuk mengukur kualitas air. Untuk kegunaan alat-alat selain itu, digunakan sebagai alat untuk mencuplik air dan Daphnia. 3.2.3 Bahan
Tabel 1. Bahan penelitian

Bahan Air sumur sterilisasi Ragi instan Akuades Strain B.subtilis NB Instan Kultur bakteri nitrifikasi alkohol 70% Strain Bakteri Nitrifikasi Larutan garam seignette Pereaksi Nessler Daphnia magna

Ukuran 1L 1L

Jumlah 9

1 tabung 8 gr 100 ml 1L 100 ml 100 ml 100 ml Dewasa (ukuran 2 mm)

Air yang digunakan dalam percobaan ada dua jenis, yaitu air sumur dan air akuades. Air sumur digunakan sebagai medium kultur Daphnia , sedangkan akuades digunakan sebagai bahan pelarut dalam membuat medium tumbuh bakteri, membuat reagen, serta keperluan pengukuran kualitas air. Alkohol digunakan untuk bahan sterilisasi beberapa alat. Larutan garam seignette dan pereaksi nessler digunakan sebagai indikator warna untuk pengukuran kadar ammonia. Untuk kultur bakteri B. subtilis dan nitrifikasi didapatkan dari laboratorium mikrobiologi ITB. Penggunaan bakteri B. subtilis perlu diaktivasi dulu dengan cara menumbuhkannya dalam medium cair NB (Nutrient Broth) selama 24 jam. Kondisi kultur B. subtilis ditempatkan pada suhu kamar. Cara mengaktivasinya adalah dengan cara mengkultur

bakteri dalam larutan NB yang terbuat dari 8 gr yang dilarutkan dalam 1 liter akuades steril, kemudian didiamkan selama 24 jam dalam suhu kamar, serta ditempatkan pada shaker. Untuk bakteri nitrifikasi tersedia dalam bentuk cair yang sudah siap untuk langsung digunakan. sedangkan bakteri nitrifikasi sudah ditumbuhkan dalam medium winogradsky. Medium winogradsky adalah medium khusus untuk bakteri nitrifikasi. Medium inorganik ini tersusun dari : KH2PO4 1 g; MgS04 0,5 g; NaCl 0,5 g; FeS04 0,01 g; MnSO 4 0,01 g; dan dilarutkan dalam akuades 200 ml (Gundersen, 1953). Jadi dalam tahap ini tidak dilakukan isolasi bakteri nitrifikasi. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Tahap Persiapan Sehari sebelum digunakan, air yang akan digunakan sebagai medium kultur Daphnia sp. dan batu aerasi disterilisasi dengan menggunakan suhu dan tekanan tinggi. Setelah itu tempat kultur berupa gelas beaker ukuran 1 L sebanyak 9 buah dicuci bersih dan dikeringanginkan selama satu hari, kemudian dilakukan sterilisasi seperti metode sebelumnya. 3.3.2 Rancangan Eksperimen
Aerato r Selang aerator Gelas beker Air
Pengatur laju aerasi

Akuariu m Batu aerasi

Thermost at

Gambar 3. Skema rancangan eksperimen kultur Daphnia sp.

Pada tiga buah akuarium yang telah diletakkan di atas meja masing-masing diletakkan tiga buah gelas beaker 1 L, dan kemudian air dimasukkan ke dalam akuarium sampai ketinggian yang sama dengan ketinggian pada gelas beaker agar seluruh gelas mencapai suhu stabil yang sama dengan bantuan thermostat. Pada setiap gelas beaker dipasang selang aerasi berukuran kecil yang dihubungkan dengan aerator yang berfungsi menghasilkan gelembung udara (Gambar 3). Laju aerasi diatur pada ukuran terkecil. 3.3.3 Pelaksanaan Penelitian Penelitian dilakukan dengan perlakuan bertingkat, dimana suatu perlakuan akan mendasari perlakuan yang akan dilakukan selanjutnya. Teknik kultur yang akan digunakan pada penelitian ini adalah teknik kultur statik (batch), dengan jumlah awal D. magna sebanyak 10 ekor dalam gelas beaker 1 L. Gelas beaker tersebut kemudian diletakkan dalam akuarium yang telah berisi air. Metode ini dilakukan untuk seluruh tahap perlakuan, yaitu perlakuan pemilihan inokulan bakteri dan waktu inokulasi bakteri. a. Perlakuan pemilihan inokulan bakteri Terdapat tiga perlakuan pemilihan inokulan bakteri : 1). Penggunaan inokulan bakteri B. subtilis, 2). Penggunaan inokulan bakteri nitrifikasi, dan 3). Tanpa penggunaan inokulan apapun (kontrol). Konsentrasi bakteri pada setiap perlakuan adalah sama yaitu 0,1% dari total medium atau 1 mL. Setiap perlakuan dilakukan secara triplo, dan percobaan diulangu sebanyak tiga kali. Pada percobaan ini tidak dilakukan pengukuran OD (Optical Density) dan penghitungan cell density. Pertumbuhan Daphnia sp. diamati setiap hari dan faktor fisika-kimia yang diukur adalah suhu, DO, pH dan kadar amonium. Pengamatan diakhiri saat pertumbuhan kultur telah melewati fase stasioner dan mengalami penurunan sebanyak dua kali berturutan pada masa pengamatan. Hasil perlakuan yang memberikan hasil pertumbuhan optimum akan digunakan untuk tahap penelitian selanjutnya.

b. Perlakuan waktu inokulasi bakteri Setelah didapatkan jenis bakteri yang tepat untuk diinokulasi pada sistem kultur, kemudian dengan menggunakan inokulan tersebut dilakukan tiga perlakuan yang berbeda. Perlakuan waktu inokulasi 24 jam sebelum Daphnia sp. dikultur; perlakuan waktu inokulasi bersamaan dengan waktu Daphnia sp. dikultur; dan perlakuan 24 jam waktu inokulasi setelah Daphnia sp. dikultur. Parameter yang diukur dalam perlakuan ini sama dengan parameter pengukuran perlakuan sebelumnya. Kedua perlakuan di atas diberikan pakan ragi instan dengan waktu pemberian pakan setiap hari disesuaikan dengan jumlah D. magna yang terdapat dalam kultur dengan konsentrasi 106 partikel/individu sesuai dengan hasil penelitian optimasi konsentrasi pakan sebelumnya (Noerdjito, 2003) 3.4 Pengamatan Kultur a. Penghitungan Kepadatan Daphnia sp. Kepadatan Daphnia sp. dihitung setiap hari dengan menggunakan counter sebagai alat bantu hitung. Alat sampling yang digunakan adalah jala plankton dan kemudian dihitung dalam gelas beker 20 ml. Sampling penghitungan dilakukan pada setiap gelas kultur. b. Pengamatan Kualitas Air Pengukuran nilai pH kultur dilakukan secara langsung dengan menggunakan pH meter merk Oakton seri 10, dan kadar oksigen terlarut diukur setiap hari dengan menggunakan DOmeter YSI model 51B. Kadar amonium (NH4+) diukur dengan menggunakan metode Nessler-spektrofotometri. Metode ini menggunakan reagen Nessler dan larutan garam seignette. Kadar amonium pada kultur diukur setiap hari dengan mengambil 25 ml air sampel kultur, diberi 1-2 tetes pereaksi garam seignette dan 0,5 ml pereaksi nessler, dikocok, dibiarkan selama 10 menit, kemudian ditera intensitasnya pada panjang gelombang 420 nm dengan menggunakan spektrofotometer merk Spektronic 20 dari Milton Ray Company. Absorbansi yang didapat dihubungkan dengan

persamaan pada kurva standar amonium untuk mengetahui konsentrasi amonium pada sampel air kultur. 3.5 Analisa Data Analisa data penelitian dilakukan dengan menggunakan analisa statistik. Untuk setiap data kelompok perlakuan digunakan statistik deskriptif (rata-rata dan standar deviasi). Untuk melihat keragaman data antar kelompok perlakuan digunakan analisa One Way ANNOVA dengan menggunakan software SPSS versi 12.