BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Sintetis hormon pertumbuhan manusia diproduksi oleh teknologi rekombinasi DNA.

Rekombinasi DNA merupakan 191 asam amino polipeptida (MW 22 kDa) yang terdiri dari urutan asam amino dan dua jembatan disulfida internal yang identik dengan komponen utama hormon pertumbuhan hipofisis atau kelenjar di bawah otak manusia. Dalam terapi, hormon pertumbuhan digunakan pada anakanak untuk mengobati gangguan pertumbuhan, misalnya postur tubuh pendek karena tidak cukup sekresi hormon pertumbuhan, sindrom Turner atau insufisiensi ginjal kronis. Pada orang dewasa digunakan sebagai pengobatan untuk kekurangan hormon pertumbuhan, HIV dan kaceksia (Yilmaz, et. a. 2012). Kaceksia (cachexia) atau sindrome wasting merupakan keadaan malnutrisi yang ditandai dengan anorexia, penurunan berat badan, atrofi otot, asthenia, depresi, nausea kronik dan anemia yang menyebabkan distress psikologis, perubahan dalam komposisi tubuh, gangguan dalam metabolisme karbohidrat, lemak dan protein, cairan dalam jaringan, keseimbangan asam basa, kadar vitamin dan elektrolit (Trujillo, et. al 2005). Beberapa metode analisis untuk penentuan kualitatif dan kuantitatif hormon pertumbuhan diantaranya seperti elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE) yang dikombinasikan dengan imunoblotting, elektroforesis zona kapiler, kromatografi eksklusi, interaksi hidrofobik, kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (HPLC), kromatografi cairspektrometri massa (LC-MS) dan enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Farmakokinetik dan kuantisasi hormon pertumbuhan telah dilakukan pada domba, kelinci, plasma manusia dan serum anjing oleh uji immunometri chemiluminescen, ELISA, radioimmunoassay dan uji immunoradiometri (Yilmaz, et. a. 2012). Penelitian dalam sebuah literatur mengungkapkan bahwa terdapat metode HPLC untuk penentuan pertumbuhan hormon. Metode HPLC untuk penentuan hormon pertumbuhan menggunakan kolom TSKG3000SW dan fase gerak natrium borat (pH 7.3)-EDTA. Penelitian lain yaitu metode HPLC fase terbalik menggunakan buffer fosfat salin (0,12 M NaCl, 0,025 M fosfat, pH 7,0) sebagai fase gerak untuk menentukan hormon pertumbuhan. Selama 10 tahun terakhir, metode HPLC menggunakan detektor UV untuk penentuan hormon pertumbuhan (Yilmaz, et. a. 2012). Makalah ini menjelaskan tentang metode HPLC untuk penentuan hormon pertumbuhan menggunakan kolom C18 fase terbalik dengan campuran fase gerak air yang terdiri dari 0,1% H3PO4 dan detektor UV. Metode HPLC ini menunjukkan kemampuan detektor UV untuk penentuan hormon pertumbuhan dengan menggunakan fase gerak sederhana dan ekonomis serta waktu analisis yang cepat dengan presisi tinggi. Metode tersebut tidak perlu dilakukan ekstraksi obat dari

matriks formulai eksipien sehingga akan mengurangi kesalahan dalam kuantisasi. Formulasi sampel dapat langsung digunakan setelah pelarutan dan penyaringan. Metode yang dikembangkan digunakan untuk menentukan kandungan obat total dalam sediaan farmasetik hormon pertumbuhan komersial yang tersedia. 1.2 Perumusan Masalah Adapun yang menjadi permasalahan dalam penelitian ini adalah : 1. Berapakah perbandingan dan laju alir fase gerak buffer (H3PO4 dalam air) untuk menentukan sampel hormon pertumbuhan? 2. Apakah kondisi optimum fase gerak H3PO4 dalam air dapat digunakan dalam penentuan hormon pertumbuhan? 3. Apakah metode HPLC dapat divalidasi untuk penentuan hormon pertumbuhan? 4. Parameter apa yang dapat digunakan untuk validas metode HPLC untuk penentuan hormon pertumbuhan? 1.3 Hipotesis Hipotesis penelitian ini adalah : 1. Perbandingan dan laju alir fase gerak buffer H3PO4 dalam air dapat menentukan hormon pertumbuhan. 2. Kondisi optimum fase gerak H3PO4 dalam air dapat digunakan untuk menentukan hormon pertumbuhan. 3. Metode HPLC dapat divalidasi dan digunakan untuk menentukan hormon pertumbuhan. 4. Parameter yang digunakan untuk validasi metode HPLC untuk penentuan hormon pertumbuhan yaitu selektivitas, linearitas, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ), preisisi, akurasi dan recovery. 1.4 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan memperoleh dan mengembangkan kondisi analisis hormon pertumbuhan secara optimal dengan metode HPLC. Validasi terhadap metode analisis penentuan hormon pertumbuhan yang diperoleh dari kondisi optimum HPLC. Penelitian ini juga bertujuan membuktikan bahwa metode HPLC memenuhi persyaratan untuk digunakan pada analisis yang berhubungan dengan hormon pertumbuhan. 1.5 Manfaat Penelitian Penelitian ini bermanfaat dalam mengembangkan metode alternatif untuk menciptakan kondisi HPLC yang lebih optimum pada penentuan hormon pertumbuhan.

BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Alat Alat-alat yang digunakan ialah seperangkat instrumen HPLC terdiri dari Thermoseparations Spectra Seri P 4000 pompa gradien digabungkan dengan Sistem Spectra deteksi UV 6000 dan auto sampler Thermoseparations AS 3000, vakum membran degasser SCM 1000, sistem pengendali SN 4000 dan kolom C18 fase terbalik dengan ukuran partikel 5 m (250 mm x 4,6 mm id), serta syringe, seperangkat alat destilasi, labu takar dan neraca analitik. 3.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan ialah hormon pertumbuhan manusia diperoleh dari Eli Lilly dan perusahaan (Indianapolis, Amerika Serikat), humatrope dari Eli Lilly (Istanbul, Turki), larutan buffer (KH2PO4), H3PO4 3.3 Prosedur Percobaan 1. Sistem kromatografi Sistem HPLC terdiri dari Thermoseparations Spectra Seri P 4000 pompa gradien digabungkan dengan Sistem Spectra deteksi UV 6000 dan auto sampler Thermoseparations AS 3000, vakum membran degasser SCM 1000, sistem pengendali SN 4000. Detektor UV diatur pada panjang gelombang 220 nm, yang merupakan panjang gelombang yang digunakan untuk kuantifikasi. Pemisahan dioperasikan kolom C18 fase terbalik dengan ukuran partikel 5 m (250 mm x 4,6 mm id) menggunakan fase gerak air yang terdiri dari 0,1% H3PO4 pada laju alir 0,5 ml/menit. Detektor UV dioperasikan pada panjang gelombang 220 nm dan suhu kolom telah disesuaikan pada 55 C. Sebanyak 50 uL sampel diinjeksikan ke sistem HPLC. 2. Preparasi larutan standar dan larutan kualitas kontrol (quality control atau QC) Larutan stok hormon pertumbuhan disiapkan dalam larutan buffer 25 mM menjadi konsentrasi 650 mg/mL. Buffer fosfat disiapkan dalam destilasi ganda dengan saringan air dan pH diatur pada 7,4 0,02 dengan cara ditambahkan larutan natrium hidroksida (NaOH). Larutan standar disiapkan dengan konsentrasi 10 sampai 75 mg/mL dengan deret standar yaitu 10, 20, 30, 40, 50 dan 75 mg/mL untuk metode HPLC. Sampel kontrol kualitas (QC) disiapkan dengan cara larutan ditambahkan aliquot atau deret larutan standar hormon pertumbuhan sampai konsentai akhir menjadi 15, 35 dan 60 mg/mL untuk metode HPLC. 3. Prosedur untuk sediaan farmasi

Injeksi Humatrope yang mengandung hormon pertumbuhan (1,33 mg) secara akurat ditimbang dan dimasukkan ke dalam 10 mL labu ukur dan ditambahkan 2 mL larutan buffer fosfat 25 mM. Pengenceran lebih lanjut dilakukan sesuai dengan grafik kalibrasi untuk metode HPLC (15 dan 50 mg/mL).

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pengembangan metode dan optimasi Metode HPLC difokuskan pada optimasi deteksi kolom, persiapan sampel dan pemisahan kromatografi. Kolom fase terbalik (C18) dapat digunakan untuk pemisahan non-ionik seperti ion pembentuk non-polar menjadi medium zat polar sedangkan kromatografi fase normal dapat digunakan untuk pemisahan zat non ionik dan / atau non-polar. Mayoritas senyawa dalam bidang farmasi akan terionisasi dan dipisahkan dalam kolom C18. Oleh karena itu, pemisahan hormon pertumbuhan menggunakan kromatografi fase terbalik (Yilmaz, et. a. 2012). Beberapa uji dilakukan untuk mengoptimalkan komponen fase gerak untuk mencapai bentuk puncak kromatografi dan resolusi yang baik. Hasil uji menunjukkan bahwa sistem pelarut air dapat meningkatkan bentuk puncak hormon pertumbuhan. Pemisahan yang baik untuk pemisahan senyawa target dan waktu analisis pendek diperoleh dengan menggunakan sistem fase gerak air yang terdiri dari 0,1% H3PO4. Waktu retensi hormon pertumbuhan yaitu 4,7 menit. Di sisi lain, fase gerak dalam metode yang diusulkan adalah air yang terdiri dari 0,1% H3PO4 bukan sistem buffer, seperti yang digunakan dalam metode HPLC dilaporkan sebelumnya. Evaluasi terhadap validasi metode ini, parameter yang digunakan diantaranya spesifisitas, linearitas, presisi, akurasi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ), pemulihan dan stabilitas diselidiki sesuai dengan pedoman validasi ICH (Yilmaz, et. a. 2012). Menurut ICH (International Conference on Harmonization) (1995), metode analisis dapat memberikan data yang dipercaya jika memenuhi beberapa parameter yang telah disyaratkan, yaitu spesifisitas, ketelitian (presisi), ketepatan (akurasi), linearitas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. 4.2 Selektivitas Selektivitas metode HPLC dilakukan dengan mengamati interferensi antara hormon pertumbuhan dan eksipien. Waktu retensi hormon pertumbuhan dalam metode HPLC adalah sekitar 4,7 menit dengan puncak kondisi yang baik (Gambar 1). Suatu penelitian dari beberapa zat campuran dalam penentuan hormon pertumbuhan dengan HPLC dilakukan dengan memilih zat campuran tersebut sebagai eksipien sering digunakan dalam sediaan farmasi. Sampel yang mengandung jumlah yang tetap dari hormon pertumbuhan (50 mg/mL) dan konsentrasi variabel eksipien (laktosa, pati, povidon, natrium dodesilsulfat, aerosil dan magnesium stearat) diukur. Semua hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode yang dijelaskan di atas dibandingkan satu sama lain dan tidak ada perbedaan yang nyata antara jumlah obat yang ditemukan sebagai nilai-nilai teoritis untuk uji t pada P = 0,05 untuk formulasi komersial.

Gambar 1 Hasil penentuan hormon pertumbuhan dengan HPLC 4.3 Linearitas Pengukuran HPLC untuk penentuan linearitas, larutan disiapkan dengan pengenceran larutan stok hormon pertumbuhan untuk membuat larutan dengan berbagai konsentrasi 10-75 mg/mL (10, 20, 30, 40, 50 dan 75 mg/mL). Kurva kalibrasi ditentukan untuk standar hormon pertumbuhan dengan memplot konsentrasi hormon pertumbuhan dengan spektrum emisi dan respon daerah puncak. Koefisien korelasi (r) dari semua kurva kalibrasi secara konsisten lebih besar dari 0.99. Persamaan regresi dihitung dari kurva kalibrasi bersama dengan standar deviasi dari kemiringan atau slope dan intersep, hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1 di bawah ini. Tabel 1 Hasil analisis hormon pertumbuhan dengan metode HPLC Parameter HPLC Linearitas (g/mL) 10-75 y = 4862,6x + 151561 Persamaan regresia 1033,6 Standar deviasi dari kemiringan Standar deviasi dari intersep 12667,5 Koefisien korelasi (r2) 0,9924 Standar deviai dari koefisien korelasi 2,9710-3 Limit deteksi (LOD) (g/mL) 2,5 Limit kuantitasi (LOQ) (g/mL) 7,5 Keterangan : a = Berdasarkan tiga kurva kalibrasi y = luas puncak (metode HPLC) x = konsentrasi (mg/mL)

4.4 Presisi dan akurasi Presisi metode spektrofluorometri dan HPLC ditentukan oleh keterulangan (intra-day) dan presisi menengah (inter-day). Keterulangan dievaluasi dengan menganalisis sampel kualitas kontrol (QC) sebanyak enam kali per hari, pada tiga konsentrasi yang berbeda yang sampel kualitas kontrol (QC). Presisi menengah dievaluasi dengan menganalisis sampel yang sama dengan sekali sehari selama dua hari. RSD merupakan perkiraan konsentrasi dari persamaan regresi diambil sebagai presisi. Keakuratan metode analisis ini dinilai sebagai persentase kesalahan relatif. Nilai standar deviasi relatif intra dan inter-day adalah 8,46% dan untuk semua konsentrasi hormon pertumbuhan kesalahan relatif adalah 6,80%. Hasil ini diberikan pada Tabel 2. Tabel 2 Presisi dan akurasi penentuan hormon pertumbuhan metode HPLC
Intra-day Konsentrasi Konsentrasi Presisib (g/mL) SDa (g/mL) (RSD, %) 15 14,560,333 2,29 35 34,480,548 1,59 60 59,411,052 1,75 Inter-day Presisib c Konsentrasi Akurasi SDa (g/mL) (RSD, %) -2,93 14,720,880 5,98 -1,49 34,531,471 4,26 -0,98 61,392,204 3,59 Akurasic -1,87 -1,34 2,32

Keterangan : a = Standar deviasi dari enam kali penentuan b = standar deviasi relatif c = kesalahan relative (%) 4.5 Batas deteksi (LOD) dan batas kuantisasi (LOQ) Batas deteksi (limits of detection, LOD) dan batas kuantisasi (limits of detection, LOQ) hormon pertumbuhan pada metode HPLC ditentukan dengan menginjeksikan larutan standar dengan konsentrasi yang semakin rendah di bawah kondisi kromatografi. Konsentrasi terendah diuji dan didapatkan sinyal: rasio noise yaitu 10:01, konsentrasi ini dianggap sebagai LOQ. LOD dinyataka sebagai sinyal sinyal: rasio noise sebesar 3:1. LOD dan LOQ untuk untuk HPLC ialah 2,5 g/mL dan 7,5 g/mL (Tabel 1). 4.6 Recovery Recorvery dinyatakan berdasarkan perbandingan antara jumlah senyawa dengan berat senyawa yang dianalisis sebagai persentase untuk jumlah teoritis yang ada di dalam media. Penentuan recovery metode HPLC untuk mempelajari gangguan formulasi aditi, recovery diperiksa sebagai tiga tingkat konsentrasi yang berbeda (rendah, sedang, tinggi). Recovery analisis pada percobaan dilakukan dengan menambahkan jumlah yang diketahui dari obat murni untuk sampel praanalisis dalam bentuk sediaan komersial. Larutan Humatrope 10 g/mL yang

mengandung hormon pertumbuhan disiapkan. Pengukuran HPLC digunakan larutan standar dengan konsentrasi 25, 45 dan 65 g/mL ditambahkan ke dalam larutan Humatrope 10 g/mL. Pengukuran dilakukan dan nilai recovery dihitung dengan membandingkan konsentrasi yang diperoleh dari sampel yang dispike dengan konsentrasi yang ditambahkan sebenarnya. Nilai-nilai ini juga tercantum dalam Tabel 3. Tabel 3 Recovery hormon pertumbuhan dalam sediaan farmasi komersial (humatrope 10 g/mL)

Keterangan : a = standar deviasi dari enam kali penentuan b = standar deviasi relatif Validitas metode HPLC yang diusulkan disajikan dalam studi recovery menggunakan metode standar adisi. Untuk tujuan ini, sejumlah dikenal obat referensi berduri untuk persiapan suntik dirumuskan dengan nilai nominal obat diperkirakan dengan metode yang diusulkan. Setiap tingkat diulang enam kali. Hasilnya direproduksi rendah SD dan RSD dengan. Tidak ada gangguan dari eksipien umum diamati. The RSD untuk variasi intra dan inter-hari adalah kurang dari 3,46% untuk metode HPLC. 4.7 v 4.8 v