LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI Ciri-Ciri Fisiologis Bakteri

KELOMPOK 1 Senin, 14 Maret 2011

Josi Meika M Aldila Indah R Natur Yasinka Silviana Dewi A Dianti N

260110090028 260110090029 260110090030 260110090031 260110090032

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 20011

Ciri-ciri Fisiologis Bakteri

I.

TUJUAN Mengamati secara langsung atau tidak langsung produk kegiatan enzimatik bakteri

II.

PRINSIP 1. Aseptis Teknik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Kerja aseptic dilakukan dengan bekerja diantara dua nyala api Bunsen dengan jarak +/- 20 cm. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kontaminasi. 2. Inokulasi Inokulasi adalah suatu usaha menumbuhkan mikroorganisme dari satu sumber ke media pertumbuhan steril. Biakan yang tumbuh disebut dengan kultur. Isolat adalah biakan murni dari mikroorgansime yang diharapkan berasal dari satu jenis, sedangkan isolasi adalah usaha untuk mendapatkan isolat. Sumber isolasi Inokulasi Kultur/biakan Isolasi Isolat 3. Uji Enzimatis Merupakan uji yang dilakukan untuk mengetahui respon mikroorganisme terhadap berbagai media biakan. - Uji fermentasi karbohidrat Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis gula, yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa - Uji MR Uji MR bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroorganisme untuk mengoksidasi glukosa dan menstabilkan konsentrasi asam yang tinggi sebagai produk akhir

- Uji VP Uji VP bertujuan untuk membedakan kemampuan mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir non-asam atau netral seperti asetilmetilkarbonil dari asam organik yang dihasilkan dari metabolisme glukosa - Uji Nitrit Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau merah muda setelah penambahan reagen uji, yang menunjukkan nitrat telah tereduksi menjadi nitrit. Dan jika terbentuk gelembung gas pada tabung Durham, hal ini menunjukkan nitrit tereduksi menjadi gas nitrogen. Sedangkan uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak terjadi perubahan warna dan tidak terbentuk gas - Uji Oksidase Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna hitam pada koloni bakteri setelah penambahan reagen uji oksidase. Hal ini menunjukkan bakteri memiliki enzim sitokrom oksidase yang dapat mengoksidasi reagen uji. Sedangkan uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak terbentuk warna hitam pada koloni bakteri - Uji Indol Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari asam amino esential triptofan - Uji Hidrolisis urea Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis urea dengan menggunakan enzim urease dan mengubah pH media dari pH netral menjadi basa. - Uji Hidrogen Sulfide Uji ini menggunakan medium TSIA yang mengandung glukosa, laktosa dan ferosulfat. - Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. 4. Uji Motilitas

Uji untuk mengetahui apakah bakteri tersebut bergerak atau tidak. Uji positif terlihat jika ada kekeruhan pada medium agar dan berada tidak hanya di daerah yang diinokulasikan secara vertikal.

III. TEORI Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas dibandingkan mahluk hidup yang lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Salah satu ciri bakteri adalah melakukan metabolisme pada dirinya sendiri, metabolisme pada suatu bakteri bertujuan memperoleh suatu energi atau untuk kebutuhan hidupnya (Campbell, 2005). Metabolisme adalah semua reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi dan yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan-kegiatan selular, seperti pergerakan. Reaksi kimiawi yang membebaskan energi melalui perombakan nutrient disebut reaksi disimilasi atau penguraian; jadi merupakan kegiatan katabolik sel. Sedangkan reaksi kimiawi yang menggunakan energi untuk sintesis dan fungsi-fungsi sel lainnya disebut reaksi asimilasi atau anabolik. Jadi, reaksi disimilasi menghasilkan energi, dan reaksi asimilasi menggunakan energi.

Bila sel merombak ikatan-ikatan kimiawi tertentu selama metabolisme, energi yang dilepaskan menjadi tersedia untuk melangsungkan kerja biologis. Selama masa hidup sel, kerja ini bersifat ekstensif dan beragam. Mikroorganisme heterotrofik nonfotosintesik memperoleh energinya dari oksidasi (pengusiran electron atau atom hydrogen) senyawasenyawa anorganik (Pelczar dan Chan, 1986). Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem endoenzim selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik.sedangkan eksoenzim yaitu enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Sebagian besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel (Waluyo, 2004).

Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor nonprotein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger, 1995). Setiap bakteri memiliki kemampuan dalam menggunakan enzim yang dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino. Metabolisme atau penggunaan dari molekul organik ini biasanya menghasilkan produk yang dapat digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri (Maisyah, 2009). Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang menghasilkan warna reagen. Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk menghidrolisis lemak (Pelczar dan Chan, 1986). Penggunaan zat hara tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba. Metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan

mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana seperti amino dan monosakarida (Maisyah, 2009).

Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Oleh karena itu percobaan ini penting dilakukan, karena dengan melakukan uji biokimia kita dapat mengidentifikasi organisme tak dikenal (Hadieotomo, 1993). Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005). Uji biokimia dapat digunakan untuk menentukan sifat metabolisme bakteri dilihat melalui interaksi reagen - reagen kimia dengan metabolit - metabolit yang dihasilkan. Selain itu juga dapat dilihat dari kemampuan bakteri dalam pemakaian suatu senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi. Metode Uji Biokimia dapat digunakan sebagai upaya untuk proses identifikasi bakteri (Backmann,2006). Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji antara lain uji dalam

melakukan fermentasi, reduksi terhadap nitrat, uji oksidase, produksi katalase, hidrolisis protein, uji sitart simmons, hidrolisis urea, hidrolisis H2S dan uji motilitas (Funke, 2004). Uji kebutuhan oksigen dengan medium NB Uji kebutuhan oksigen dilakukan untuk mengetahui sifat pertumbuhan bakteri dengan menggunakan medium NB. Sifat pertumbuhan yang diamati adalah aerob, anaerob, fakultatif atau mikroaerofil (Dwi, 2010). Uji Katalase Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau

anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut : 2 H2O2 2 H2O + O2

(Volk & Wheeler, 1993). Uji fermentasi karbohidrat Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis gula, yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa (Lay, 1994). Uji hidrolisis pati Uji hidrolisis pati untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati dengan cara menghasilkan enzim amilase. Pati merupakan polisakarida yang memiliki berat molekul yang tinggi, karena ukurannya yang besar, polisakarida tidak mampu diserap oleh membran sel (Cappuccino dan Sherman, 1992). Uji indol Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari asam amino esential triptofan (Lay, 1994). Uji fermentasi gula, H2S, dan gas dengan TSIA Uji ini menggunakan medium TSIA yang mengandung glukosa, laktosa dan ferosulfat (Dwi, 2010). Uji MR-VR Uji MR bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroorganisme untuk mengoksidasi glukosa dan menstabilkan konsentrasi asam yang tinngi sebagai produk

akhir. Sedangkan uji VR untuk membedakan kemampuan mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir non-asam atau netral seperti asetilmetilkarbonil dari asam organik yang dihasilkan dari metabolisme glukosa (Lay, 1994). Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme untuk

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi (Capuccino dan Sherman, 1992). Uji hidrolisis urea Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis urea dengan menggunakan enzim urease dan mengubah pH media dari pH netral menjadi basa (Lay, 1994). Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dengan karakter tertentu, yang mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup disekitarnya (Dwidjoseputro, 1994). Komposisi media yang digunakan dalam uji uji tersebut antara lain (Strohl, 2001): 1. Medium Skim Milk: Susu skim Agar 2. Medium Pati: Agar Pati 1 % 3. Fermentasi Karbohidrat: Laktose Maltose Glukose Sukrose Mannitol 4. Uji MR- VP: MR (Metil-Red) / VP (Voges-Proskauer)

5.

Reduksi Nitrat : Nitrat cair

6.

Produksi Katalase: Larutan hidrogen peroksida

7.

Hidrolisis asam amino triptofan: TSB atau tripton cair 1%

8.

Hidrolisis Urea: Urea cair

9.

Uji Sitrat Simons: Sitrat Garam amonium indikator biru bromtimol

10. Uji Motilitas Indikator garam tetrazolium IV. ALAT DAN BAHAN IV.1. ALAT Autoclave Bunsen Inkubator Ose berujung lurus dan bundar Rak tabung reaksi Tabung durham Tabung reaksi

IV.2. BAHAN Agar miring sitrat Simmons Agar miring TSIA/H2S Indikator merah metil Kaldu glukosa Kaldu laktosa Kaldu maltosa Kaldu manosa Kaldu sakarosa Kaldu tripton Kaldu urea Media Sulfite SIM Medium MR Medium VP Nutrient Agar

Reagen Barritt Reagen Kovac Reagen uji nitrit Suspensi bakteri

IV.3 GAMBAR ALAT

Gambar alat autoclave

Gambar alat bunsen

Gambar alat inkubator

Gambar alat rak tabung

Gambar alat tabung durham

Gambar alat tabung reaksi

VII. PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini, kami melakukan identifikasi terhadap bakteri berdasarkan reaksi biokmia. Tujuan dari percobaan kali ini adalah mengamati secara langsung atau tidak langsung produk enzimatik bakteri. Isolasi dan identifikasi dilakukan guna menemukan spesies suatu mikroorganisme (bakteri). Sampel yang ditanam pada media biakan untuk diisolasi, tidak menutup kemungkinan dari suatu sampel dapat ditemukan lebih dari satu bakteri. Penanaman pada media biakan berguna juga melihat ciri-ciri pertumbuhan suatu bakteri pada media sehinnga dapat untuk mengidentifikasi / menentukan cirri-ciri spesies bakteri dari sampel yang diperiksa. Sebelum praktikum dimulai, disiapkan alat dan bahan yang diperlukan, seperti pembakar bunsen, ose berujung lurus dan bundar, suspensi sampel, serta media pembiakkan bakteri pada tabung reaksi. Pembakar bunsen digunakan untuk memfiksasi alat yang digunakan dalam percobaan agar tidak terdapat bakteri atau kontaminan lain yang dapat bercampur dengan bakteri sampel dan dapat mempengaruhi hasil percobaan. Ose yang digunakan ada 2 jenis, yaitu ose lurus dan ose berujung bundar. Ose berujung lurus digunakan untuk membiakkan suspensi bakteri pada tabung reaksi untuk uji motilitas, sedangkan ose berujung bundar digunakan untuk membiakkan suspensi bakteri pada tabung reaksi lainnya yang bertujuan untuk mengetahui enzim atau zat apa yang dihasilkan oleh bakteri sampel. Pada percobaan ini dilakukan 12 uji terhadap sampel suspensi bakteri, yaitu uji motilitas pada tabung reaksi 1, uji glukosa pada tabung reaksi 2, uji laktosa pada tabung reaksi 3, uji manosa pada tabung reaksi 4, uji maltosa pada tabung reaksi 5, uji sakarosa pada tabung reaksi 6, uji indol pada tabung reaksi 7, uji H2S/TSIA pada tabung reaksi 8, uji urea

pada tabung reaksi 9, uji MR pada tabung reaksi 10, uji VP pada tabung reaksi 11, dan uji sitrat pada tabung reaksi 12. Seluruh tabung reaksi yang digunakan telah disterilisasi terlebih dahulu karena harus bekerja secara aseptik agar terhindar dari kontaminan. Lazimnya sebelum dilakukan uji fisiologis terlebih dahulu dilakukan uji pendahuluan seperti : uji bentuk, uji Gram positif atau negatif, dan pewarnaan, untuk memudahkan arah uji. Pada 12 tabung reaksi untuk tiap uji, diisi oleh media yang sesuai untuk setiap ujinya. Pada tabung reaksi 1 digunakan media Sulfite SIM untuk melihat motilitas bakteri. Motilitas adalah salah satu ciri makhluk hidup, begitu pula dengan mikroorganisme, namun alat geraknya masih sederhana berupa flagella atau cilia. Bakteri melakukan motilitas dengan menggunakan energi yang berasal dari ATP yang diuraikan oleh koenzim ATP-ase menjadi fosfo anorganik. Untuk melihat pergerakan (motilitas) bakteri dapat dilihat dengan cara makroskopis (cara Craig). Cara ini pertama kali dikerjakan oleh Craig, yaitu dengan menggunakan perbenihan semi solid ( setengah padat). Untuk hal ini dipergunakan perbenihan cair yang diberi agar-agar 1/4 % (satu perempat persen) dan diletakkan secara tegak didalam tabung reaksi. Pemeriksaan dilakukan dengan cara menanamkan bakteri dengan menggunakan ose berujung lurus (seperti jarum) yang ditusukkan kedalam perbenihan semisolid secara tegak, setelah terlebih dahulu ose tersebut difiksasi di atas pembakar bunsen agar tidak terdapat bakteri (atau kontaminan lain) yang dapat mengkontaminasi bakteri sampel dan mempengaruhi hasil percobaan, didinginkan, lalu dicelupkan kedalam suspensi bakteri yang akan diperiksa. Kemudian diinkubasi selama 21 jam dalam inkubator. Pada garis tanam (tempat penusukan) bakteri akan berkembang biak karena adanya zat makanan dari perbenihan, esok harinya dilihat.

Ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi : 1. Pada bakteri yang tidak bergerak multiplikasi atau perbanyakan bakteri hanya terjadi pada tempat dimana bakteri ditanamkan, sehingga akan terlihat garis tanam menebal, yang berarti bahwa bakteri setelah berkembang biak tetap ditempatnya karena tidak dapat bergerak. 2. Pada bakteri yang dapat bergerak yang bersifat aerob, akan terlihat garis tanam melebar kearah permukaan perbenihan, yang berarti bahwa bakteri setelah membelah diri bergerak ketempat dimana banyak makanan dan oksigen.

3. Pada bakteri yang dapat bergerak dan bersifat anaerob, akan terlihat garis tanam melebar kearah dasar perbenihan, yang berarti bahwa bakteri setelah berkembang biak, bergerak ke tempat dimana terdapat banyak makanan dan mengandung oksigen. Setelah diinkubasi, didapat hasil bahwa terdapat koloni bakteri di luar area tusukan hingga ke arah permukaan media. Hal itu dapat disebabkan karena terdapat kontaminan atau bakteri yang dibiakkan memang bakteri yang bersifat aerob karena bakteri aerob akan cenderung bergerak ke permukaan untuk mendapatkan oksigen. Tetapi selain di permukaan, bakteri tumbuh di sekitar area tusukan sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri dalam sampel kami adalah bakteri (dapat bergerak). Pada tabung reaksi untuk uji-uji gula, dimasukkan tabung Durham ke dalam tiap tabung reaksi (tabung reaksi 2-6). Hal ini dilakukan untuk melihat apakah pada reaksi dihasilkan gas. Bila dihasilkan gas, maka pada tabung Durham akan terisi oleh gas. Sedangkan untuk melihat apakah ada aktivitas bakteri, dapat berdasarkan warna larutan yang sebelumnya berwarna merah dan oranye (untuk media sakarosa) menjadi kuning atau merah keruh artinya bakteri tersebut memfermentasikan gula dan menghasilkan asam. Pada tabung reaksi 2 diisi media kaldu glukosa dengan indikator fenol merah dan terdapat tabung durham di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 2 yang berisi media kaldu glukosa dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Hasilnya adalah tidak terdapat perubahan warna pada media kaldu glukosa dan tidak terdapat gas pada tabung Durham. Warna media kaldu glukosa yang semula berwarna merah tetap berwarna merah dan pada tabung Durham tidak ada gas sedikitpun. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri sampel tidak memfermentasikan glukosa. Tetapi menurut literatur, seharusnya bakteri sampel kami memfermentasikan glukosa dan menghasilkan asam. Tapi pada kenyataannya saat percobaan tidak ditemukan hasil reaksi yang positif. Hal tersebut dapat dikarenakan bakteri sampel tidak terbawa oleh ose sehingga tidak ada bakteri yang berkembang biak dan memfermentasikan glukosa, atau bakteri sudah mati karena saat mengambil suspensi bakteri

menggunakan ose, ose yang dipakai masih panas sehingga bakteri mati sebelum dibiakkan dalam media kaldu glukosa. Pada tabung reaksi 3 diisi media kaldu laktosa dengan indikator fenol merah dan terdapat tabung Durham di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 2 yang berisi media kaldu laktosa dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Hasilnya adalah tidak terdapat perubahan warna pada media kaldu laktosa dan tidak terdapat gas pada tabung Durham. Warna media kaldu laktosa yang semula berwarna merah tetap berwarna merah dan pada tabung Durham tidak ada gas sedikitpun. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri sampel tidak memfermentasikan laktosa sedikitpun. Tetapi menurut literatur, seharusnya bakteri sampel kami memfermentasikan laktosa dan menghasilkan asam serta gas. Tapi pada kenyataannya saat percobaan tidak ditemukan hasil reaksi yang positif. Hal tersebut dapat dikarenakan bakteri sampel tidak terbawa oleh ose sehingga tidak ada bakteri yang berkembang biak dan memfermentasikan laktosa, atau bakteri sudah mati karena saat mengambil suspensi bakteri menggunakan ose, ose yang dipakai masih panas sehingga bakteri mati sebelum dibiakkan dalam media kaldu laktosa. Pada tabung reaksi 4 diisi media kaldu manosa dengan indikator fenol merah dan terdapat tabung Durham di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 2 yang berisi media kaldu manosa dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Hasilnya adalah tidak terdapat perubahan warna pada media kaldu laktosa dan tidak terdapat gas pada tabung Durham. Warna media kaldu manosa yang semula berwarna merah tetap berwarna merah dan pada tabung Durham tidak ada gas sedikitpun. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri sampel tidak memfermentasikan manosa sedikitpun. Tetapi menurut literatur, seharusnya

bakteri sampel kami memfermentasikan manosa dan menghasilkan asam. Tapi pada kenyataannya saat percobaan tidak ditemukan hasil reaksi yang positif. Hal tersebut dapat dikarenakan bakteri sampel tidak terbawa oleh ose sehingga tidak ada bakteri yang berkembang biak dan memfermentasikan manosa, atau bakteri sudah mati karena saat mengambil suspensi bakteri menggunakan ose, ose yang dipakai masih panas sehingga bakteri mati sebelum dibiakkan dalam media kaldu manosa. Pada tabung reaksi 5 diisi media kaldu maltosa dengan indikator fenol merah dan erdapat tabung Durham di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 5 yang berisi media kaldu maltosa dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Hasilnya adalah terdapat perubahan warna pada media kaldu maltosa tetapi tidak terdapat gas pada tabung Durham. Warna media kaldu maltosa yang semula berwarna merah menjadi berwarna oranye tetapi pada tabung Durham tidak ada gas sedikitpun. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri sampel memfermentasikan maltosa. Pada tabung reaksi 6 diisi media kaldu sakarosa dengan indikator fenol merah dan erdapat tabung Durham di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 6 yang berisi media kaldu sakarosa dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Hasilnya adalah terdapat perubahan warna pada media kaldu sakarosa tetapi tidak terdapat gas pada tabung Durham. Warna media kaldu maltosa yang semula berwarna agak oranye menjadi berwarna kuning tetapi pada tabung Durham tidak ada gas sedikitpun. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bakteri sampel memfermentasikan sakarosa. Hasil yang ditunjukan dalam uji fermentasi menggunakan medium yang berisi gula berupa glukosa cair, laktosa cair, manosa cair, maltosa cair, dan sakarosa cair, tidak

semuanya positif. Hasil positif menunjukkan bakteri memiliki enzim beta-galaktosidase yang dapat memecahkan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Selain itu bakteri juga memiliki enzim sukrase yang dapat memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Setelah semua gula menjadi sederhana yaitu berupa monosakarida, proses fermntasi dapat terjadi pada medium-medium tersebut. Hasil fermentasi akan mengeluarkan asam organik yang dapat merubah pH medium, karena itu medium tersebut akan mengalami perubahan warna akibat respon indikator didalamnya. Pada tabung reaksi 7 diisi media kaldu tripton di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 7 yang berisi media kaldu tripton dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Setelah diinkubasi, suspensi bakteri dalam kaldu tripton kemudian ditambahkan pereaksi Kovac sebanyak 10-12 tetes, kemudian dilihat apakah terbentuk cincin indol berupa lapisan berwarna merah atau tidak. Hasilnya adalah tidak terbentuk lapisan berwarna merah yang menandakan hasil uji negatif. Hasil uji negatif menandakan bahwa bakteri tidak menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indol dan asam piruvat melalui enzim triptofanase. Tetapi menurut literatur, seharusnya bakteri sampel kami menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indol dan asam piruvat. Tapi pada kenyataannya saat percobaan tidak ditemukan hasil reaksi yang positif. Hal tersebut dapat dikarenakan bakteri sampel tidak terbawa oleh ose sehingga tidak ada bakteri yang berkembang biak dan memfermentasikan glukosa, atau bakteri sudah mati karena saat mengambil suspensi bakteri menggunakan ose, ose yang dipakai masih panas sehingga bakteri mati sebelum dibiakkan dalam media kaldu tripton. Pada tabung reaksi 8 diisi media agar miring TSIA/H2S di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan digoreskan pada media agar miring TSIA/H2S secara zig zag. Penggoresan harus dilakukan secara zig zag agar bakteri dapat tersebar di dalam medium agar. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik

aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Setelah diinkubasi kemudian dilihat apakah ada pertumbuhan bakteri pada media agar atau tidak. Hasil dari uji ini menunjukkan bahwa terdapat bakteri yang tumbuh pada medium agar yang artinya bakteri tersebut dapat tumbuh pada media agar tersebut. Hasil positif ini tidak sesuai dengan literatur yang seharusnya menandakan hasil uji negatif untuk uji ini. Kemungkinan bakteri yang tumbuh pada media kami ini bukan bakteri uji kami melainkan bakteri kontaminan yang ikut tergoreskan ke dalam media agar. Hal tersebut terjadi karena kerja kami yang mungkin kurang aseptis, ose tidak terfiksasi secara sempurna, atau kerja kami tidak dekat dengan pembakar bunsen. Pada tabung reaksi 9 diisi media agar miring yang mengandung urea di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan digoreskan pada media agar miring yang mengandung urea secara zig zag. Penggoresan harus dilakukan secara zig zag agar bakteri dapat tersebar di dalam medium agar. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Setelah diinkubasi kemudian dilihat apakah ada pertumbuhan bakteri pada media agar atau tidak. Dari hasil pengamatan didapat bahwa hasil uji positif bakteri menghidrolisis urea, dilihat dari adanya pertumbuhan bakteri pada permukaan agar yang berbentuk zig zag dan perubahan warna media agar yang semula berwarna kekuningan menjadi merah keunguan. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di dalam tabung tersebut menghasilkan urease yang akan menghidrolisis urea dan menghasilkan amoniak yang kemudian akan menaikkan pH. Di dalam media agar tersebut mengandung indikator merah fenol yang akan berubah warna dari kuning (pada pH 6,8) menjadi merah keunguan (pada pH diatas 8). Akan tetapi seharusnya bakteri uji kami tidak menghasilkan hasil positif untuk uji hidrolisis urea ini. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri yang tumbuh pada media yang mengandung urea ini merupakan bakteri kontaminan yang ikut masuk ke dalam tabung saat dilakukan penggoresan pada media agar. Hal tersebut terjadi karena kerja kami yang mungkin kurang aseptis, ose tidak terfiksasi secara sempurna, atau kerja kami tidak dekat dengan pembakar bunsen. Pada tabung reaksi 10 diisi media kaldu glukosa dalam medium MR-VP di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose

berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 7 yang berisi media kaldu tripton dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Setelah diinkubasi, biakan suspensi bakteri tersebut kemudian ditetesi indikator metil merah sebanyak 3 tetes, kemudian dilihat apakah terjadi perubahan warna menjadi merah atau tidak. Hasil positif ditunjukkan oleh perubahan warna suspensi bakteri menjadi merah. Hasil dari uji MR ini adalah positif. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri uji kami memfermentasikan glukosa di dalam medium MR-VP yang kemudian akan menghasilkan banyak sekali asam sehingga dapat menurunkan pH sampai 5 atau bahkan kurang. Pada tabung reaksi 11 diisi media kaldu glukosa dalam medium MR-VP di dalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan dicelupkan dalam tabung reaksi 7 yang berisi media kaldu tripton dan dikocok hingga homogen secara perlahan agar bakteri tidak berkumpul pada satu sisi saja. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Setelah diinkubasi, suspensi bakteri kemudian ditambahkan pereaksi Barrit, kemudian dikocok selama 30 detik, lalu dilihat adanya perubahan warna menjadi merah atau tidak. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah yang artimnya terjadi pembentukan 2,3-butandiol dan etanol. Hasil uji bakteri kami adalah negatif, yang artinya bakteri kami tidak menghasilkan alkohol, tetapi menghasilkan asam dari hasil fermentasi glukosa dalam media MR-VP. Pada tabung reaksi 12 diisi media agar miring sitrat Simmons didalamnya. Pembiakkan bakteri dilakukan dengan memasukkan suspensi bakteri menggunakan ose berujung bulat yang telah difiksasi terlebih dahulu lalu didinginkan. Setelah ose dingin, ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri dan digoreskan pada media agar miring yang mengandung urea secara zig zag. Penggoresan harus dilakukan secara zig zag agar bakteri dapat tersebar di dalam medium agar. Proses ini dilakukan di dekat pembakar bunsen yang menyala sesuai dengan teknik aseptik untuk menghindari kontaminan. Setelah proses

tersebut, tabung reaksi diinkubasi selama 21 jam. Setelah diinkubasi kemudian dilihat apakah ada pertumbuhan bakteri pada media agar atau tidak. Hasil uji ini adalah negatif, dilihat dari tidak adanya pertubuhan bakteri dalam media agar sitrat Simmons, yang menandakan bahwa bakteri uji tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satusatunya. Agar sitrat Simmons mengandung bromtimol biru sebagai indikator yang dapat berubah warna dari hijau menjadi biru bila keadaan agar menjadi basa, yang menunjukka hasil positif. Bakteri uji yang kami gunakan adalah Escheria coli yang merupakan Enterobacterium yang hidup pada usus besar manusia. Escheria coli merupakan bakteri yang bersifat motil, memfermentasikan karbohidrat dan menghasilkan gas, menghidrolisis asam amino triptofan dan menghasilkan indol dan asam piruvat, tidak menghasilkan hidrogen sulfida, tidak menghidrolisis urea, memfermentasikan glukosa yang menghasilkan asam, dan tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Hasil dari praktikum kami, bakteri yang kami uji banyak mengandung bakteri kontaminan dan banyak terjadi false positive dan false negative, akibat kerja yang kurang aseptis dan hati-hati.

IX.

KESIMPULAN Hasil dari uji enzimatis bakteri yang kami lakukan adalah bakteri kami merupakan

bakteri yang bersifat motil, memfermentasikan maltosa dan sakarosa tetapi tidak memfermentasika glukosa, laktosa dan manosa, tidak menhasilkan indol dan asam piruvat melalui hidrolisis triptofan, menghasilkan H2S, menghidrolisis urea, meghasilkan asam dalam fermentasi glukosa dalam media MR-PV, tidak menghasilkan alkohol, dan tidak dapat hidup pada media sitrat.

DAFTAR PUSTAKA

Backmann, A. 2006. Carbohydrate metabolism in bacteriause of differences in carbohydrate metabolism for identifying bacteria. Caister Academic Press. USA. Campbell, N.A., J.B. Reece. 2005. Biology Seven Edition. Benjamin Cummings. San Francisco. Cappuccino , J.G & Sherman. 1983. Microbiology a Laboratory Manual. Addison Weshley Publishing Company. New York. Dwi, Amalia. 2010. Karakterisasi Bakteri Patogen. Available online at:

http://www.scribd.com/doc/31356180/karakterisasi-bakteri-patogen (Diakses 19 Maret 2011) Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambaran. Jakarta. Funke BR, Tortora GJ, Case CL . 2004. Microbiology: an introduction (8th ed, ed.). Benjamin Cummings. San Francisco. Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada. Jakarta. Lehninger. 1995. Dasar dasar Biokimia. Jilid I. Erlangga. Jakarta. Maisyah. 2009. Aktivitas Biokimia Mikroba. Available online at:

http://rgmaisyah.wordpress.com/2009/05/10/aktivitas-biokimia-mikroorganisme/ (Diakses tanggal 19 Maret 2011) Murray. 1995. Biokimia Harper. EGC. Jakarta. Pelczar, M.J. Dan Chan, E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta. Strohl, William A., Rouse,H and Fisher, BD. 2001. Lippincotts Illustrated Reviews:

Microbiology. Lippincott William & Wilkins. USA. Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang. Malang