Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Enzim

ABSTRAK Enzim adalah suatu protein yang memiliki kemampuan untuk mengkatalisis reaksi-reaksi biokimia. Dahulu, banyak penelitian menemukan bahwa aktivitas enzim diasosiasikan dengan protein, namun beberapa ilmuan berargumen bahwa protein hanyalah bertindak sebagai pembawa enzim dan protein sendiri tidak dapat melakukan katalisis. Enzim sangat penting dalam kehidupan manusia, karena semua reaksi metabolisme dalam tubuh dikatalis oleh enzim. Tanpa enzim atau jika aktivitas enzim terganggu, maka reaksi metabolism sel akan terganggu atau berlangsung sangat lambat. Percobaan ini bertujuan untuk dapat melakukan uji aktivitas enzim -amilase dalam hidrolisis pati dan dapat menjelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim. Dengan menggunakan saliva (air liur) sebagai sumber enzim amilase, amilum sebagai substrat, ekstrak phaseolamin (Phaseolus vulgaris) sebagai inhibitor, dan larutan iodium sebagai indikator amilum yang menghasilkan warna biru tua. Alat yang digunakan adalah penangas air dengan suhu 370C untuk inkubasi, mikropipet, spektrofotometer sebagai analisis kuantitatif kadar amilum, serta beberapa tabung reaksi yang diberi label. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah pH, suhu, kadar substrat, kadar enzim, inhibitor, koenzim dan kofaktor. Aktivitas enzim amylase adalah berperan dalam memecah karbohidrat menjadi molekul yang lebih sederhana atau yang memecah polisakarida menjadi disakarida.
A. PENDAHULUAN

Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator, senyawa yang meningkatkan kecepatan reaksi kimia. Enzim katalisator berikatan dengan reaktan, yang disebut substrat, mengubah reaktan menjadi produk, lalu melepaskan produk. Walaupun enzim dapat mengalami modifikasi selama urutan ini, pada akhir reaksi enzim kembali ke bentuk asalnya. Selain meningkatkan kecepatan reaksi, enzim dapat mengatur kecepatan reaksi dalam jalur metabolik tubuh(1). Amylase adalah suatu enzim pencernaan yang dalam keadaan normal bekerja ekstrasel untuk memecah kanji menjadi kelompok-kelompok karbohidrat yang lebih kecil dan akhirnya menjadi monosakarida. Sumber organ utama amylase adalah kelenjar liur dan pancreas. Amylase saliva dalam keadaan normal masuk ke mulut oleh sekresi melalui ductus salivarius(2). Kerja enzim dipengaruhi oleh laju reaksi enzimatik. Faktor-faktor penting yang mempengaruhi laju reaksi enzimatik adalah konsentrasi substrat dan enzim, demikian pula faktor-faktor lain seperti pH, suhu, dan ada tidaknya kofaktar dan ion logam(3). Michaelis-Menten berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi kompleks enzim-substrat, sebab apabila tergantung pada konsentrasi substrat akan menghasilkan pertambahan kecepatan reaksi yang apabila digambarkan akan merupakan garis lurus. Km adalah konstanta Michaelis-Menten, dengan persamaan(4): V= (Vmaks [S])/(Km+[S])

Suhu mempengaruhi aktivitas enzim. Pada suhu rendah enzim menjadi tidak aktif, karena tidak terjadi benturan antara molekul enzim dengan substrat. Sedangkan pada suhu tinggi, enzim akan mengalami denaturasi atau struktur enzim akan rusak(5). Salah satu inhibitor enzim adalah ekstrak Phaseolus vulgaris .Phaseolus vulgaris telah diteliti memiliki efek sebagai penghambat enzim saliva dan pancreas amylase dalam memecah amilum menjadi disakarida dan monosakarida(6).
B. METODE

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gelas beker, gelas ukur, kaca arloji, kuvet, labu ukur, mikro pipet, mortir dan stamper, penangas air, pipet tetes, pipet volume, spatula, beberapa tabung reaksi, dan vortex. Bahan yang digunakan antara lain: saliva sebagai sumber amylase, larutan amilum , larutan iodium, buffer fosfat, dan ekstrak phaseolamin. Untuk percobaan awal uji aktivitas -amilase dilakukan dengan cara tes iodine pada saliva sebelum dan sesudah makan crackers gandum. Prinsip pada percobaan ini adalah terbentuknya warna biru tua antara amilum dengan iodine. Disetiap percobaan, dibaca serapan amilum dengan menggunakan spektrofotometer. Prinsip spektrofotometer adalah sinar polikromatis diubah menjadi monokromatis oleh monokromator, dikenakan pada analit berupa gelombah elektro magnetic diubah menjadi elektrolistrik oleh detector dan dibaca oleh recorder. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas -amilase saliva dengan menggunakan larutan amilum (pati) 0.5%, buffer fosfat 50 mM pH 7.0, larutan iodium, dan air liur (saliva) dari praktikan. Pada cawan petri, dicampur masing-masing 1 tetes amilum dan saliva, kemudian diamati perubahan yang terjadi setelah didiamkan 5 menit dan ditambahkan larutan iodium. Colorless point, disiapkan 11 tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan 1 ml buffer fosfat. Pada tabung 1, ditambahkan 1 ml saliva dan dihomogenkan. Dilakukan pengenceran dengan cara mengambil 1 ml dari tabung 1 kemudian dimasukkan ke tabung 2 dan dihomogenkan. Begitu seterusnya dilakukan pada tabung-tabung berikutnya. Sehingga diperoleh seri kadar sampai 1:1024. Tabung 11 digunakan sebagai blanko (berisi buffer fosfat saja). Ditambahkan pada masingmasing tabung larutan amilum 1%, dihomogenkan dan diinkubasi 370C. setelah 15 menit, ditambahkan 2 tetes larutan iodium. Uji aktivitas amylase, disiapkan 7 tabung reaksi. Tabung 1-6 diisi 0.8 ml larutan iodium (suhu kamar). Tabung 7 diisi 1.5 ml larutan amilum, diinkubasi pada 370C selama 2 menit, ditambahkan 0.1 ml saliva encer, dicampur dan dicatat waktu awalnya. Setelah 2 menit, 0.2 ml larutan tabung 7 ditambahkan pada tabung 1. Pengaruh kadar enzim terhadap aktivitas enzim. Saliva 2 ml diencerkan 10X, 20X, 40X, 80X, 160X. Siapkan 6 tabung, satu tabung untuk blanko (berisi larutan amilum, larutan iodium, dan air suling) dan 5 tabung untuk uji. 5 tabung uji dimasukkan amilum 1 ml, saliva 200 l dengan seri kadar yang berbeda, larutan iodium, dan air suling. Setelah dihomogenkan, dibaca serapannya pada panjang gelombang 580 nm, dan dihitung kecepatan reaksi enzimatik. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim. 2 ml saliva diencerkan 10X dengan aquades. Disiapkan 12 tabung reaksi yang bersih. Tabung 1 dan 2 ditempatkan di bejana berisi es 100C. Tabung 3 dan 4 ditempatkan di bejana berisi air , yang suhunya dipertahankan tetap 250C. Tabung 5 dan 6 ditempatkan di rak tabung, pada suhu ruangan. Tabung 7 dan 8 ditempatkan di penangas air yang suhunya dipertahankan

370C. Tabung 9 dan 10 ditempatkan di penangas air pada suhu 600C. Tabung 11 dan 12 ditempatkan di penangas air mendidih. Tabung ganjil sebagai uji dan tabung genap sebagai blanko. Seluruh tabung di isi 1 ml larutan amilum, 200 l air liur, 1 ml larutan iodium, dan 4 ml aquades. Untuk tabung blanko tidak diisikan air liur. Kemudian dibaca serapannya pada spektrofotometer. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim. Dibuat dapar dengan pH antara 1 sampai 10 misal 2, 4, 6, 8, 10. Dibuat substrat amilum dalam berbagai macam dapar dengan konsentrasi 0,4%. Dibuat blanko untuk masing-masing pH. Masing-masing tabung diisi 1 ml larutan amilum dengan variasi pH, air liur 200 l, larutan iodium 1 ml, dan air suling 4 ml. Untuk tabung blanko tidak diisikan air liur. Kemudian dibaca serapannya pada panjang gelombang 580 nm. Pengaruh kadar substrat terhadap aktivitas enzim.Diencerkan 2 ml air liur sebanyak 10X dengan aquades. Dibuat berbagai macam kadar substrat dengan menggunakan larutan dapar dengan seri kadar 2 %,1.75%,1.5%,1.25%,1%,0.75%,0.5%,0.25% dan 0%. Disiapkan 1 tabung sebagai blanko. Pada masing-maisng tabung di isi 1 ml larutan amilum, 200 l air liur, 1 ml larutan iodium, dan 4 ml aquades. Blanko tidak diberi liur. Dibaca serapannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 580 nm. Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim. Disiapkan 3 tabung reaksi. Tabung 1 diisi dengan ekstrak phaseolamin 100l+buffer 300l+saliva(1:10) 30l,diinkubasi 370C selama 5 menit, ditambahkan 100 l larutan amilum,diinkubasi 370C selama 5 menit. Tabung 2 diisi dengan ekstrak phaseolamin 100l+buffer 300l+saliva (1:10) 30l+100l larutan amilum,diinkubasi 370C selama 15 menit, ditambahkan 100 l larutan amilum,diinkubasi 370C selama 5 menit. Tabung 3 diisi buffer 300l +saliva(1:10) 30l+100 l larutan amilum,diinkubasi 370C selama 15 menit. Ditambahkan larutan iodium 1 ml pada masing-masing tabung dan dibaca serapannya pada spektrofotometer.
C. HASIL DAN PERHITUNGAN

Percobaan Awal Sebelum makan crackers gandum: saliva + iodin berwarna kuning Setelah makan crackers gandum: saliva + iodin berwarna biru 1.1 Uji Aktivitas -amilase Saliva 1. Reaksi kuantitatif untuk amylase saliva: Reaksi berwarna biru 2. Colorless point: Tabung terakhir yang tidak berwarna adalah tabung nomer 3. 3. Aktivitas amylase: Tabung yang berubah menjadi warna merah-bata adalah tabung 7 1.1 Pengaruh Kadar Enzim terhadap aktivitas Enzim
Pengenceran Enzim 10X 20X 40X 80X 160X Kadar 10% 5% 2.5% 1.25% 0.625% Au 0.2241 0.2148 0.2932 0.6622 2.4509 A/menit 2.3882 2.3975 2.3191 1.9501 0.1614

Absorbansi (Ab) Pengenceran Enzim 10x 20x 40x 80x 160x

blanko 2.6123

Kadar 10% 5% 2.5% 1.25% 0.625%

Au 0.2655 2.4984 2.4662 2.4984 2.5331 2.6581

A/menit 2.3926 0.1597 0.1919 0.1597 0.125

Absorbansi blanko (Ab)

1.2 Pengaruh Suhu terhadap aktivitas Enzim

suhu inkubasi 5 sampai 10 25 suhu kamar 37 60 100 Suhu Inkubasi 10 25 Suhu kamar 37 60 100 Ab 0.958 0.828 0.728 0.762 0.825 1.761 Ab 0,841 0,795 0,850 0,513 1,289 2,709 Au 0.175 0.476 0.155 0.631 0.255 2.05 Au 0,245 0,407 0,271 0,897 0,888 2,42 A / menit 0.783 0.352 0.573 0.131 0.57 -0.289 A / menit 0,596 0,388 0,579 - 0,381 0,401 0,567

1.3 Pengaruh pH terhadap aktivitas Enzim

pH 2 4 6 7 8 10 Ab 0.239 0.188 0.116 0.13 0.634 0.207 Au 0.144 0.107 0.111 0.117 0.114 0.114 A / menit 0.095 0.081 0.005 0.013 0.520 0.093

pH 2 4 6 7 8 10

Ab 0,149 0,143 0,116 0,266 0,192 0,168

Au 0,237 0,142 0,117 0,158 0,103 0,133

A / menit - 0,088 0,001 - 0,001 0,108 0,089 0,035

1.4. Pengaruh inhibitor terhadap Aktivitas Enzim

Tabung ke1 2 3 Warna Merah Merah Merah Absorbansi 1,1058 1,4233 0,5374 K*absorbansi 5,5292 7,1167 2,6868

1.5.Pengaruh Kadar Substrat terhadap Aktivitas Enzim

Kadar Au 2% 2.959 1.75% 3.010 1.5% 2.959 1.25% 2.913 1% 2.799 0.75% 0.908 0.5% 0.671 0.25% 0.567 0% 0.116 Absorbansi Blanko (Ab) Kadar Au 2% 2.7994 1.75% 2.7994 1.5% 2.7994 1.25% 2.7994 1% 2.7092 0.75% 2.7092 0.5% 1.6880 0.25% 1.1761 0% 0.0905 Absorbansi Blanko (Au) A/menit 1.041 0.990 1.041 1.087 1.201 3.092 3.329 3.433 3.884 4.000 A/menit 1.2006 1.2006 1.2006 1.2006 1.2908 1.2908 2.3120 2.8239 3.9095 4.000

D. DISKUSI

Pada percobaan awal, sebelum praktikan memakan crackers gandum saliva setelah ditetesi iodine terjadi perubahan warna menjadi kuning. Setelah praktikan memakan crackers gandum, saliva setelah ditetesi iodine terjadi perubahan warna menjadi biru. Hal ini menunjukkan bahwa tubuh tidak dapat mengkompensasi amilase dalam jumlah yang lebih saat mendapat asupan makanan dari luar. Reaksi kualitatif untuk amylase saliva, setelah campuran saliva dengan larutan amilum didiamkan 5 menit, terjadi perubahan warna menjadi biru setelah ditetesi larutan iodine. Perubahan warna biru ini dikarenakan masih terdapat amilum pada saliva sehingga iodin bereaksi dsengan amilum dan menghasilkan warna biru. Untuk uji colorless point, tabung terakhir yang tidak berwarna adalah tabung 3. Tabung yang tidak berwarna memiliki kadar enzim yang tinggi sehingga mampu menghidrolisis amilum secara sempurna, sedangkan tabung yang lain 4 10 kadar amilase sudah tidak mampu menghidrolisis amilum. Di setiap percobaan, dilakukan analisis kualitatif menggunakan spektrofotometer. Prinsip alat ini adalah adanya sinar polikromatis diubah oleh monokromator menjadi monokromatis, diserap oleh analit berupa gelombang elektromagnetik diubah menjadi elektrolistrik oleh detector dan dibaca oleh recorder. Pada percobaan ini, digunakan panjang gelombang 580 nm, yaitu maks untuk amilum. Blanko hanya berfungsi sebagai pembanding. Absorbansi blanko haruslah lebih besar dari absorbansi pada tabung lainnya, karena blanko tidak berisi amilase. Sehingga dapat ditentukan kecepatan reaksi enzim (A/menit) dari selisih antara absorbansi blanko dan absorbansi amilum sisa (Au). Pada percobaan uji aktivitas amylase, tabung yang berubah menjadi merah bata / merah bata pada nomer 7. Pada tabung nomer 7 enzim amilase sudah dapat mendegradasi amilum secara sempurna sehingga warna biru yang di hasilkan antara reaksi iodium dan amilum sudah tidak ada lagi. Dan dihasilkan warna merah bata yang mengidentifikasikan bahwa enzim alfa amilase sudah mampu menghidrolisis secara sempurna pada tabung nomor 7. Pada perhitungan aktivitas amilase ( somogyi units/dl) didapatkan hasil 6.428 somogyi units. 1 somogyi units artinya 1mg glukosa yang diproduksi selama 30 menit. Sehingga aktivitas amilase pada praktikum ini adalah 6.428 somogyi unit yang artinya 6.428 glukosa dalam tubuh yang diproduksi dalam waktu 30menit. Untuk normalnya dari somogyi units yaiutu 3 somogyi units. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa 6.428 somogyi units/dl merupakan hasil yang bagus karena dengan waktu yang sangat singkat dia mampu menghidrolisis amilum. Kecepatan reaksi dipengaruhi oleh kadar enzim. Pada hasil percobaan (1.2), tabung 1 dengan kadar enzim 10% memiliki kecepatan reaksi 2.3882. Kecepatan reaksi paling tinggi adalah pada tabung 2 yaitu 2.3975 dengan kadar enzim 5%. Kemudian kecepatan reaksi enzim menurun seiiring dengan semakin kecilnya kadar enzim yaitu pada tabung 3,4, dan 5. Seharusnya ketika enzim semakin diencerkan, maka absorbansi amilum (Au) semakin besar. Au adalah absorbansi amilum sisa yang tidak bereaksi dengan enzim. Sehingga kecepatan reaksi semakin kecil. Selain dipengaruhi oleh kadar enzim, aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh suhu. Hal ini ditunjukkan pada hasil percobaan 1.3. Ketika diberikan suhu yang berbeda yaitu pada suhu 5-100C, 250C, pada suhu kamar (250C), pada suhu tubuh (370C), 600C, dan 1000C, maka aktivitas enzim (A/menit) juga berbeda. Pada data hasil dari 2 kelompok yang melakukan percobaan ini , suhu optimum enzim adalah 10oC dilihat

dari kecepatan aktivitas enzim yang terbesar yaitu 0.783 dan 0,596. Padahal dalam literatur atau dari data penelitian terdahulu menunjukkan suhu optimum enzim bekerja pada suhu 370C-450C. kesalahan hasil percobaan ini kemungkinan karena human error atau dari bahan yang digunakan telah mengalami kerusakan. Kecepatan reaksi enzimatik juga dipengaruhi oleh keasaman (pH). Pada data hasil percobaan 1.4 oleh 2 kelompok, menunjukkan pH optimal enzim bekerja adalah pada pH 8 dilihat dari selisih absorbansi blanko dengan larutan pada tabung uji yang paling tinggi, yaitu 0.520 dan0,089. Pada literature, pH optimum enzim bekerja adalah 6.5-7. Tabel kedua memiliki kecepatan reaksi enzimatik (A/menit) bernilai negative. Munculnya nilai negative ini menunjukkan percobaan mengalami kesalahan, padahal blanko tidak mengandung enzim yang mengakibatkan berkurangnya kandungan amilum. Pengaruh kadar substrat terhadap aktivitas enzim. Pada hasil percobaan yang dilakukan oleh dua kelompok menunjukkan semakin diencerkan substrat maka semakin kecil kadar substrat yang akan didegradasi oleh enzim, maka aktivitas enzim meningkat. Seharusnya, semakin kecil kadar substrat akan menurunkan aktivitas enzim, karena pada kadar enzim yang tetap dengan adanya penurunan kadar substrat maka hanya sedikit sejumlah enzim yang berikatan dengan substrat. Pada percobaan ini, perbedaan hasil dengan teori disebabkan oleh salahnya teknik cara kerja yaitu hanya memakai 1 blanko sebagai pembanding 9 tabung uji yang berbeda kadar substratnya. Pada percobaan pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim, dihasilkan dari percobaan bahwa absorbansi 2>1>3. Tidak sesuai dengan literature 1>2>3. Dimana pada literature apabila enzim dan inhibitor (tabung 1) dicampur dan diinkubasi maka ikatan enzim dengan inhibitor akan kuat. Kemudian ditambah substrat dan diinkubasi lagi. Maka seharusnya menghasilkan absorbansi yang lebih besar disbanding tabung 2. Karena tidak ada persaingan antara inhibitor dan substrat untuk menempati sisi aktif enzim. Pada tabung 1, aktivitas enzim meningkat dan tidak berikatan dengan enzim karena sudah terduduki oleh inhibitor. Pada tabung 2: secara bersamaan mengalami persaingan antara substrat dan inhibitor untuk menduduki sisi aktif. Pada tabung 3, substrat dengan mudah menduduki posisi sisi aktif.
E. KESIMPULAN

1. Enzim -amilase memiliki aktivitas menghidrolisis amilum (polisakarida) menjadi molekul yang lebih kecil (disakarida). 2. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh kadar enzim, suhu, keasaman (pH), kadar substrat, dan inhibitor dilihat dari absorbansi amilum yang tidak bereaksi dengan enzim dengan menggunakan uji kuantitatif spektrofotometer.

F. REFERENSI 1. Marks, D., Marks, A., Smith, C., Biokimia Kedokteran Dasar, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 96 2. Ronald, A., Richard, A., Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 353 3. Kuchel, P., Ralston, G., Biokimia Schaums Easy outlines, Erlangga, Jakarta, 49

4. Poedjiadi, A., Supriyanti, T., Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta, 140, 150 5. Robertson, T., Effect of Temperature Variation on Fungal Amylase Activity, Biology 221 Labssoratory Section, New York, 2011, 19 6. Vinson, A., Kharrat, H., Shuta, D., Investigation of an Amylase Inhibitor on Human Glucose Absorption after Starch Consumption, The Open Nutraceuticals Journal,2009, 2, 88-91:88