UJI BAKTERI ESCHERICIA COLI PADA DEPO AIR MINUM ISI ULANG

Organisme koliform merupakan petunjuk adanya polusi kotoran (faeses). Bahaya sehubungan dengan air minum adalah bila air tersebut telah tercemar oleh bahan buangan atau kotoran manusia atau hewan berdarah panas. Bila pengotoran semacam itu terjadi, maka air tersebut mengandung bibit-bibit penyakit yang masih hidup. Meminum air semacam itu dapat berakibat timbulnya penyakit demam usus atau disentri. Organisme yang paling umum digunakan sebagai mikroorganisme indikator adalah E. Coli dan kelompok koliform secara keseluruhan. Mikroorganisme indikator merupakan kelompok bakteri yang keberadaannya di makanan di atas batasan jumlah tertentu, yang dapat menjadi indikator suatu kondisi yang terekspos dan dapat mengintroduksi organisme hazardous (berbahaya) sehingga menyebabkan proliferasi spesies patogen ataupun toksigen. Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35 oC. Adanya bakteri koliform di dalam makanan/ minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroba yang bersifat enteropatogenik dan atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi 2 grup yaitu : (1) koliform fekal misalnya Escherichia coli dan ( 2 ) koliform nonfekal misalnya Enterobacter aerogenes. Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanam-tanaman yang telah mati. Jadi, adanya Escherichia coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi feses manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karena itu, standar air minum mensyaratkan Escherichia coli harus nol dalam 100 ml.

Secara garis besar Escherichia bersifat motile. Kehadiran kehidupan bakteri coli

coli memiliki sifat-sifat bentuk besar pengaruhnya terhadap

batang, gram negatif, tidak berkapsul, umumnya mempunyai fimbria dan manusia, terbukti dengan kualitas air minum, secara oleh kehadiran bakteri tersebut

bakteriologis tingkatannya ditentukan yang disajikan pada tabel dibawah ini.

Tabel 1. Batas maksimum cemaran mikroba dalam air mineral Jenis Makanan Air mineral Jenis Pengujian Angka lempeng total MPN coliform Escherichia coli* Clostridium perfringens Salmonella Batas Maksimum per gram/per ml 102 <3 0 0 negatif

Sumber : Lampiran Surat keputusan Dirjen POM Nomor : 037267/B/SK/VII/89 Catatan :* 100 ml untuk jenis makanan bentuk cair Cara kerja dalam menguji kualitas air minum dari sumber mata air dapat dibagi menjadi tiga bagian, yaitu sampling, pemilihan metode analisis dan membandingkan data yang didapat dengan spesifikasi acuan atau standar. Tiga langkah ini saling melengkapi dan berhubungan, karena : Heterogenitas distribusi dari mikroorganisme dalam sebagian besar sampel berarti bahwa rencana sampling harus mampu memberikan hasil secara statistik dalam hal standar. Kekurangtepatan dalam kebanyakan teknik mikrobiologis kuantitatif berarti bahwa standar/ acuan harus dihubungkan dengan data yang diperoleh dengan metode khusus, dan Jumlah sampel yang diperlukan dalam metode tes harus disertakan dalam laporan saat memilih jumlah dari tiap-tiap sampel.

A. PENGAMBILAN SAMPLING 1. Survey Tahap pertama dalam perencanaan sistem pemantauan air adalah pengumpulan data mengenai keadaan lingkungan serta karakteristik dan pemanfaatan sumber air. Berdasarkan data tersebut dapat direncanakan lokasi pengambilan contoh yang tepat sesuai dengan keperluannya. Survey diperlukan untuk menetapkan kecepatan terhadap pergantian gambaran mikrobiologis. Mengambil dan memeriksa sampel sebanyak mungkin dalam satu shift, sehari atau bahkan satu minggu (harus tepat), akan menunjukkan apakah pertambahan organisme dapat muncul, apakah itu cepat atau bertahap dan kapan waktu yang tepat untuk mengambil sampel agar dapat mendeteksinya. Di sisi lain, survey dapat mengindikasikan fluktuasi cepat dan tinggi dalam hitungan mikrobial. Dalam kasus seperti itu, akan diperlukan untuk mengambil sampel sesering mungkin sampai penyebab fluktuasi dapat diidentifikasi dan dikoreksi. Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam menentukan tempat lokasi sampling, dalam hal ini isi ulang air minum pada depo adalah : a) Kualitas fisik yang meliputi kekeruhan, temperatur, warna, bau dan rasa. Kekeruhan air dapat ditimbulkan oleh adanya bahanbahan organik dan anorganik yang terkandung di dalam air seperti lumpur dan bahan-bahan yang berasal dari buangan. Dari segi estetika, kekeruhan di dalam air dihubungkan dengan kemungkinan pencemaran oleh air buangan. b) Kualitas kimia yang berhubungan dengan ion-ion senyawa ataupun logam yang membahayakan, di samping residu dari senyawa lainnya yang bersifat racun, seperti antara lain residu pestisida. Dengan adanya senyawa-senyawa ini kemungkinan besar bau, rasa dan warna air akan berubah, seperti yang umum disebabkan oleh adanya perubahan pH air. Pada saat ini

kelompok logam berat seperti Hg, Ag, Pb, Cu, Zn, tidak diharapkan kehadirannya di dalam air. c) Kualitas biologis, berhubungan dengan kehadiran mikroba patogen (penyebab penyakit, terutama penyakit perut), pencemar (terutama bakteri coli) dan penghasil toksin. 2. Frekuensi Pengambilan Sampling Perubahan kualitas air yang terus menerus perlu dipertimbangkan dalam penentuan waktu pengambilan sampel pada sumber air. Sampel perlu diambil pada waktu tertentu dan periode yang tetap sehingga data dapat digunakan untuk mengevaluasi perubahan kualitas air. Kadar dari zat-zat tertentu di dalam air dipengaruhi oleh debit air sungai atau volume sumber air. Selama debit aliran yang kecil dimusim kemarau, frekuensi pengambilan contoh perlu ditingkatkan terutama pada sungai yang menampung limbah industri, domestik dan pertanian. Pengukuran debit air diperlukan pula untuk menghitung jumlah beban pencemaran dan diperlukan pula untuk membandingkan kualitas air pada debit rendah dan debit besar selama periode pemantauan. Berdasarkan informasi yang telah dikumpulkan, dapat diketahui parameter-parameter yang melebihi batas kriteria yang berlaku serta frekuensi terjadinya. Dengan demikian dapat ditetapkan frekuensi pengambilan contoh yang diperlukan dan pengambilan contoh secara rutin dapat dilaksanakan. 3. Sampling Teknik sampling dipergunakan untuk memperoleh efisiensi dan efektivitas dalam pelaksanaan pemeriksaan, agar hasil pemeriksaannya dapat dipertanggungjawabkan dari segi mutu pelaksanaan tugas pemeriksaan. Sasaran dari sampling adalah untuk mengambil sampel tanpa mengkontaminasinya dan untuk membawanya ke laboratorium dengan perubahan yang minimum dalam status mikrobialnya. Dalam kondisi

penyimpanannya, sebaiknya juga meminimalisasi pertumbuhan atau kematian dari mikroorganisme yang ada. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pengambilan sampling adalah berapa sampel yang diperlukan dan darimana diambilnya Jawabannya akan sangat dipengaruhi oleh sejarah mikrobiologis dari produk itu sendiri. Sampel yang diambil dari lapang adalah sampel lapang. Sedangkan yang digunakan untuk analisis adalah unit sampel. Dua sampel ini mempunyai ukuran yang sama, tapi sebaiknya sampel lapang harus lebih besar untuk mengantisipasi jika terjadi kecelakaan atau testing ulang. Sampel lapang akan sering berada dalam wadah tertutup dengan jumlah yang lebih besar daripada yang dibutuhkan untuk unit sampel. Tiap unit sampel memberikan hanya satu hasil untuk tiap tes yang dilakukan. Sebelum menentukan jumlah sampel atau unit sampel yang akan diambil, sebaiknya diambil tindakan untuk mengerti signifikansi hasil yang didapatkan jika mengambil lebih dari satu sampel. Semakin kecil jumlahnya, semakin besar kemungkinan bahwa unit-unit yang tak dapat diterima, tidak dapat ditemukan. Sampling mengacu pada proses memilih suatu sampel/ contoh bagian/ kelompok suatu total populasi. Dua hal yang harus diperhatikan dalam pengambilan sampling adalah : a. Probabilitas b. Sampling Plan a. Probabilitas Dengan sampling probabilitas, tiap-tiap unsur populasi mempunyai probabilitas yang telah diketahui dan telah termasuk dalam sampel. Sebaliknya, dengan sampling non probabilitas, kita tidak bisa menetapkan probabilitas masing-masing unsur yang masing-masing unsur akan tercakup di dalam sampel. Masing-masing pendekatan mempunyai keuntungan dan kerugian. Keuntungan utama dari non probabilitas adalah kenyamanan dan biaya. Kelemahannya adalah tidak bisa membuat

pernyataan tentang probabilitas statistik sampel yang ada. Sebagai contoh, kita tidak bisa menghitung suatu interval kepercayaan untuk masalah estimasi atau range penerimaan tes hipotesa. Sampling probabilitas memungkinkan untuk menyatakan probabilitas statistik sampel. Kita dapat mengestimasi tingkatan statistik sampel yang mungkin berbeda dengan parameter populasi. Nilai probabilitas mempunyai rentang dari 0 sampai 1. Pada konteks ini, probabilitas nol (0) berarti tidak ada kemungkinan/ peluang terjadi tes positif (organisme tidak ada sampel). Probabilitas 1 berarti terdapat banyak organisme sehingga setiap tes pasti akan positif. Prinsip dari probabilitas adalah semakin banyak unit yang diuji maka akan semakin besar kemungkinan bahwa organisme yang akan terisolasi. Sebaliknya, semakin sedikit unit yang diuji, semakin kecil peluang untuk mendeteksi adanya kontaminasi. Oleh karena itu, pengambilan sampling harus memilih dengan hati-hati jumlah sampel yang diambil karena hasil akan menggambarkan kondisi riil dari sampel. Pertimbangan utama adalah menghindari bias dalam prosedur sampling dan sampling plan. b. Sampling Plan Prosedur sampling dan kriteria penentuan sampel merupakan sampling plan. Sampel harus diambil dengan metode yang tepat. Prosedur pengambilan dan penanganan sampel harus diperhatikan sehingga tidak merubah mikro yang diuji. Dari sini halal yang harus diperhatikan adalah: Faktor-faktor yang berhubungan dengan sampling plan Prosedur sampling yang diambil pada penelitian di jurnal adalah : a. Pengambilan sampel pada tiga depo yaitu depo Elita, Tirta Alam dan Sinta.

b. Penentuan

kualitas

koliform

dengan

uji penduga

(Presumtive test) dilakukan dengan 9 tabung (seri 3-3-3). Medium yang digunakan adalah kaldu laktosa masingmasing tabung berisi 9 ml kaldu laktosa dilengkapi dengan tabung Durcham dalam posisi terbalik. Untuk pengujian yang menggunakan 9 tabung, pada 3 seri tabung pertama diisi 10 ml sampel air, 3 seri tabung kedua diisi dengan 1 ml sampel air, dan 3 seri tabung ketiga diisi dengan 0,1 ml sampel air. Semua tabung reaksi kemudian diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 oC. Setelah masa inkubasi 1-2 x 24 jam diamati terbentuknya gas asam (Jumlah (gelembung udara pada tabung Durcham) dan MPN (Most Probable Number) atau JPT

(media menjadi keruh). Analisis dilakukan dengan metode Perkiraan Terdekat) dengan menggunakan seri 3-3-3. c. Wawancara dengan pengelola depo air minum isi ulang tentang sumber air baku yang digunakan dan prosedur pemrosesan air minum isi ulang. d. Pengumpulan dokumen Menentukan tempat dan media coli untuk dari petumbuhan air dilakukan yang untuk laktosa

mikroorganisme Pemeriksaan kehadiran berdasarkan (tabung bakteri penggunaan medium kaldu laktosa digunakan

ditempatkan di dalam tabung reaksi berisi tabung durham kecil yang gas letaknya terjadi terbalik, menangkap yang akibat fermentasi

menjadi asam dan gas). Tergantung kepada kepentingan, ada yang menggunakan sistem 3-3-3 (3 tabung untuk 10 ml, 3 tabung untuk 1,0 ml, 3 tabung untuk 0,1 ml) atau 5-5-5 . Ada tiga hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan tempat wadah sampel, yaitu:

a) penyerapan zat-zat kimia dari bahan wadah oleh contoh, misalnya bahan organik dari plastik, natrium, boron dan silika dari gelas; b) penyerapan zat-zat kimia dari contoh oleh wadah, misalnya penyerapan logam-logam oleh gelas atau bahan-bahan organik oleh plastik; c) terjadinya reaksi langsung antara contoh dengan wadah, misalnya fluorida dengan gelas. Pemilihan wadah sampel adalah tabung reaksi lain mudah mencucinya, mengecek keadaannya berisi serta tabung durham. Keuntungan pemakaian wadah gelas antara mensterilisasikannya. Sedang kekurangannya adalah mudah pecah selama pengangkutan. Menentukan ukuran sampel yang diambil Berdasarkan informasi dari prosedur sampling bahwa pengambilan sampling berdasarkan metode pengambilan contoh secara manual yang mudah diatur waktu dan tempatnya, serta dapat menggunakan bermacam-macam alat sesuai dengan keperluannya. Apabila diperlukan volume contoh yang lebih banyak, contoh dapat diambil lagi dengan mudah. Selain itu biaya pemeliharaan alat dengan cara ini tidak besar bila dibandingkan dengan cara otomatis. Akan tetapi keberhasilan pengambilan contoh secara manual sangat tergantung pada keterampilan petugas yang melaksanakannya. Pengambilan contoh secara manual yang berulang-ulang dapat menyebabkan perbedaan perlakuan yang dapat mengakibatkan perbedaan hasil pemeriksaan kualitas air. Pengambilan contoh secara manual sesuai untuk diterapkan pada pengambilan contoh sesaat pada titik tertentu dan untuk jumlah contoh yang sedikit. Sedangkan untuk pengambilan contoh yang rutin dan

berulang-ulang dalam periode waktu yang lama cara manual memerlukan biaya dan tenaga kerja yang besar. Penentuan ukuran sampel dalam jurnal ini dilakukan dengan 9 tabung (seri 3-3-3). Medium yang digunakan adalah kaldu laktosa masing-masing tabung berisi 9 ml kaldu laktosa dilengkapi dengan tabung Durcham dalam posisi terbalik. Untuk pengujian yang menggunakan 9 tabung, pada 3 seri tabung pertama diisi 10 ml sampel air, 3 seri tabung kedua diisi dengan 1 ml sampel air, dan 3 seri tabung ketiga diisi dengan 0,1 ml sampel air. Menjaga kestabilan mikro yang diambil dari sampel Sebelum dianalisis dalam laboratorium, sampel harus dijaga kemurniaannya agar representatif tabung reaksi dan tidak terjadi rekontaminasi. Semua kemudian diinkubasi

pada inkubator pada suhu 37 oC. Setelah masa inkubasi 1-2 x 24 jam diamati terbentuknya gas (gelembung udara pada tabung Durcham) dan asam (media menjadi keruh). Analisis dilakukan dengan metode MPN (Most Probable Number) atau JPT (Jumlah Perkiraan Terdekat) dengan menggunakan seri 3-3-3. 4. Distribusi Sampling Sebelum dianalisa dalam laboratorium, sampel harus dalam keadaan murni dari sumber pengambilan sampel. Jika sampel terlalu besar untuk dibawa ke laboratorium, pindahkan sampel yang representatif ke dalam wadah steril. Bersihkan area sekitar dari wadah dengan diseka oleh alkohol 70%. Gunakan peralatan steril untuk membuka wadah dan jangan digunakan sebelum di re-sterilisasi karena akan dibawa ke laboratorium sebagai sampel lapang. Peralatan yang tepat untuk mangambil sampel air, yaitu sebelum mengambil sampel (biasanya dengan pipet) sebaiknya diaduk agar larutan

atau suspensi menjadi homogen. Berikan label pada tiap-tiap wadah setelah sampel diambil. Catat dalam angka dan buat catatan di lain tentang detail sampelnya. Bawa sampel ke laboratorium sesegera mungkin karena dalam kondisi lingkungan yang ideal satu sel bakteri setiap 20 menit akan membelah menjadi dua, sehingga dalam waktu tujuh jam satu sel bakteri tersebut sudah akan membiak menjadi 2.097.152 juta sel bakteri. Sterilisasi-ulang peralatan di lapangan mungkin dibutuhkan. Jika autoclave kecil, steamer atau oven uap panas tidak tersedia, masukkan dalam 70% v/v etil alkohol lalu bakar atau dimasukkan selama 30 detik dalam sanitizer baketrial yang sama dengan 100 ppm klorin tersedia, dicuci dalam air steril dan dikeringkan dengan kain steril. Perlakuan pembakaran dan alkohol jangan dilakukan jika terdapat resiko kebakaran atau meledak, atau jika panas dapat merusak peralatan. Perlakuan alkohol tidak membasmi spora bakterial. B. METODE ANALISIS Metode analisis digunakan untuk menganalisa sampel yang diambil dari tempat pengambilan sampel. Sebelum melakukan isolasi, beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu: 1. Preparasi Sampel Preparasi sampel diperlukan untuk mengantisipasi terjadinya rekontaminasi dalam laboratorium. Caranya adalah dengan melakukan tekik transfer aseptis. Teknik transfer aseptis adalah suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi. Ada beberapa aturan yang harus diketahui dan dipenuhi di dalam teknik transfer aseptis ini, yaitu :

 Sebelum Pelaksanaan : Singkirkan semua barang yang tidak diperlukan dari meja dan ruang kerja Kenakan pakaian atau jas laboratorium yang bersih dan higinis sebelum masuk ke dalam laboratorium Dianjurkan untuk mengenakan masker yang bersih dan higienis Kenakan penutup rambut yang bersih dan higinis Jangan sekali-kali meletakkan tabung dan peralatan laboratorium lainnya di luar laboratorium Sebelum dan Setelah Pelaksanaan : Cuci tangan anda dengan bersih dan gunakan antiseptis Sanitasi dan desinfeksi ruang kerja (laboratorium dan sekitarnya) dengan desinfektan yang memadai, termasuk Laminar Air Flow dan Inkubator Sterilisasi semua alat dan bahan sebelum digunakan Ketika Pelaksanaan Kultur : Jangan berbicara Bekerjalah di dekat api (pembakar bunsen) dan di dalam Laminar Air Flow Bukalah tabung atau cawan di atas api dan jauhkan dari hidung dan mulut anda Usahakan jangan meletakkan tutup (kapas penutup) tabung reaksi di atas lantai/alas meja atau laminar Miringkan tutup cawan petri yang akan dibuka sebagai penghalang antara kultur dengan mulut dan hidung anda Jangan buka tutup cawan petri terlalu lebar dan terlalu lama Bekerjalah dengan cepat

 Setelah Pelaksanaan : Segera tutup semua tabung atau cawan yang masih terbuka Singkirkan segera semua peralatan atau bahan sisa yang sudah tidak digunakan lagi Bersihkan dan keringkan segera tumpahan-tumpahan media yang ada Sanitasi dan desinfeksi ulang ruang kerja (laboratorium anda) Lepas pakaian kerja dan jas laboratorium anda sebelum meninggalkan ruang kerja anda 2. Penyiapan Media Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wadah yang telah disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada jurnal ini, media yang dibutuhkan adalah PCA ( Plate Count Agar) dan NA (Nutrient Agar). Penyiapan media komersial ini pada umumnya mengikuti langkah-langkah sebagai berikut : 1. Setiap komponen atau medium terhidrasi (bubuk) dilarutkan ke dalam aquades atau air suling pada volume yang tepat dan sesuai. 2. pH media ditentukan dan disesuaikan dengan nilai optimum pertumbuhan mikroba sebagaimana tertera pada kemasan media komersial. 3. Dituang ke dalam media yang sesuai, seperti erlenmeyer atau tabung labu dan disumbat dengan penutup yang kuat.

4.

Disterilisasi

dengan

suhu

dan

waktu

yang

adequate

(memadai) sesuai dengan yang tertera pada kemasan. (Umumnya pada suhu 121oC selama 15 menit). PLATE COUNT AGAR (Merck) Formula : Casein-Peptone Glucose Yeast Extract Agar Penyimpanan : Simpan di tempat yang kering dan tertutup rapat. Simpan pada suhu 15oC 25oC. Jaga dari cahaya.

Preparasi : Larutkan 22,5 gram ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) atau air deionisasi. Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen. Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC. pH akhir = 7,0 pada 25oC.

MEDIA KALDU Teknik turbiditas menggunakan media broth (kaldu) dan yang diamati adalah karakteristik kekeruhannya. Tiap mikroorganisme memiliki karakteristik turbiditas (kekeruhan) yang berbeda-beda. Ada diantara mikroorganisme yang membentuk partikel melayang ( flocculent) di dalam media broth. Ada yang tersedimentasi, melayang di permukaan saja (pellicle) dan ada pula yang melayang di permukaan berbentuk seperti cincing (ring). Cara Kerja : a) Tuang media broth ke dalam tabung reaksi secara aseptis. b) Ambil dengan cara menstreak biakan mikroba dari kultur. c) Transfer dengan cara menstreak ke dalam tabung reaksi yang berisi broth tadi.

d) Inkubasi ke dalam inkubator dan amati bentuk koloni yang tumbuh.

3. Teknik Biakan Murni a. Teknik Pour Plate (Teknik Agar Tuang) Teknik pour plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Cara Kerja : a) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. b) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. c) Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri. d) Tuang media agar yang masih cair (suhu 50 oC) ke dalam cawan petri tadi. e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri selama 36-48 jam pada suhu 37oC. b. Teknik Spread Plate (Teknik Agar sebar) Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour

plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar.

Cara Kerja 1 : (dengan pipetting) a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. c) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. d) Pipet larutan dilusi tadi sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri. e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja untuk meratakan larutan dilusi tadi di atas permukaan media agar. f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri selama 36-48 jam pada suhu 37oC. Cara Kerja 2 : (dengan swab/apus) a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki. c) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. d) Masukkan swab stick (tangkai apus) steril ke dalam tabung reaksi hingga bagian kapasnya tenggelam di dalam larutan dilusi. Usahkan memasukkan tangkai apus jangan sampai menyentuh dinding tabung reaksi. e) Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan secara merata. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores.

f) Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri selama 36-48 jam pada suhu 37oC. c. Teknik Streak Plate (Teknik Penggoresan Agar) Teknik streak plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum ose. Cara Kerja : a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah. c) Bakar bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api. d) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen. e) Bagi tiga bidang permukaan atas cawan petri yang akan distreak dengan spidol atau lainnya. f) Streak ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores. g) Arah streak pada permukaan agar menurut pembagian bidang tadi. Kemudian inkubasi selama 36-48 jam pada suhu 37 oC dan amati koloninya. Berikut gambar hasil dengan penggorean.

d. Pemindahan Biakan Di dalam teknik transfer aseptis ada beberapa teknik yang perlu difahami, yaitu : a. Inoculating (inokulasi) dengan jarum ose b. Pipetting (mentransfer dengan pipet) c. Alcohol Flamming (mentransfer dengan forsep yang dibakar dengan alkohol) a. Inoculating dengan jarum ose 1. Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah. 2. Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang, kemudian segera ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya dengan ketiga jari tengah, manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk dan ibu jari memegang jarum ose. 3. Bakar bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api. 4. Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose

jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen. 5. Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup. Ingat, jarum ose jangan dibakar kembali karena akan membunuh bakteri yang akan diinokulasikan. 6. Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya dengan cara yang sama dengan cara kedua dan bakar bibirnya dengan cara yang sama dengan cara ketiga diatas. 7. Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung tadi sebagaimana cara keempat. 8. Bakar bibir tabung reaksi dan tutup sebagaimana cara ketiga. 9. Bakar kembali jarum ose sebagaimana cara kesatu. 10. Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau pengenceran. b. Pipetting 1. Ambil pipet yang telah steril, buka pembungkusnya dan pasang katup karetnya. 2. Bakar ujungnya dibakar atas bunsen selama beberapa detik. Jangan terlalu lama karena dapat merusak ujung pipet. 3. Ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya dengan kedua jari manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk, jari tengah dan ibu jari memegang pipet. 4. Segera masukkan pipet ke dalam tabung reaksi, tekan katup karet penghisap tombol [S] (lihat gambar di bawah) lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan pipet jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen. 5. Bakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup. 6. Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya dengan cara yang sama dengan cara kedua dan bakar bibirnya dengan cara yang sama dengan cara ketiga.

7. Segera masukkan pipet ke dalam tabung tadi, kemudian keluarkan cairan yang telah diinokulasi dari pipet dengan menekan tombol [E]. 8. Bakar bibir tabung reaksi dan tutup sebagaimana cara ketiga. 9. Pindahkan pipet dan ganti dengan pipet baru apabila akan melakukan pipeting kembali. 10. Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau pengenceran. c. Alcohol Flamming Biasanya digunakan untuk meletakkan kertas cakram atau instrumen lain ke dalam cawan petri yang berisi media. 1. Ambil forsep, celupkan ujungnya ke dalam alkohol, lalu segera bakar ujungnya di atas bunsen selama beberapa detik secara mendatar. Ingat, jangan miring sebagaimana gambar di bawah. 2. Ambil kertas cakram steril atau instrumen lainnya dengan forsep tadi. 3. Ambil tabung reaksi yang berisi zat antimikrobial, celupkan kertas cakram tadi ke dalam cairan di dalam tabung reaksi. 4. Ambil cawan petri yang telah berisi biakan bakteri di dalam agar, buka penutupnya dengan cara memiringkan beberapa derajat hingga hanya pada satu sisi bagian saja yang terbuka. Ingat jangan terlalu lebar membukanya atau me mbuka seluruh tutupnya dari cawan. 5. Segera masukkan kertas cakram steril atau instrumen lainnya dengan forsep secara hati-hati agar tidak merusak permukaan agar. Lakukan di dekat pembakar bunsen. 6. Segera tutup dan bakar kembali bibir cawan. 7. Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan. 4. Penghitungan Jumlah Bakteri

Penghitungan jumlah mikroorganisme dengan cara viable count atau disebut juga sebagai standard plate count (SPC) didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasi dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Berdasarkan hal tersebut seringkali digunakan istilah colony forming units (CFU/ ml) untuk penghitungan jumlah mikroorganisme hidup. Penghitungan jumlah mikroorganisme hidup ( viable count) adalah jumlah minimum mikroorganisme. Hal ini disebabkan koloni yang tumbuh pada lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berbiak dalam media dan suhu inkubasi tertentu seperi pada gambar dibawah ini.

Dalam

penghitungan

mikroorganisme

seringkali

dilakukan

pengenceran. Penelitian ini menggunakan tabung reaksi untuk melakukan pengenceran sehingga hanya memerlukan bahan yang sedikit. TEKNIK DILUSI (PENGENCERAN) Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count). TPC bertujuan untuk menghitung dan menganalisis tingkat higinitas produk dari tingkat kontaminasi mikrobial. Bahan : 1. Produk (Pasta, Hand Soap, dll)

2. PCA (Plate Count Agar) 3. BPW (Buffer Pepton Water) 4. Aquades Steril 5. Alkohol 70 % Peralatan : 1. Petri Dish 2. Tabung Reaksi 3. Erlenmeyer 4. Gelas Piala/ erlenmeyer 5. Mixer 6. Laminar Air Flow Cara Kerja : 7. Autoclave 8. Inkubator 9. Timbangan Analitis/Balance 10. Pipet Ukur 11. Bunsen Burner

Dari larutan kultur kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian.

Dari larutan dilusi 1/10 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian.

Dari larutan dilusi 1/100 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000 bagian.

Dari larutan dilusi 1/1000 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian dan seterusnya.

Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah suatu rasio dilusi yang apabila pada tiap dilusi ditumbuhkan ke dalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung, maka jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara : Jumlah koloni x Misal : Apabila pada dilusi 1/100 tumbuh sebanyak 20 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah : 1 1/100 = 2000 sel 1 Pengenceran

20 koloni x

Apabila pada dilusi 1/1000 tumbuh sebanyak 3 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah : 1 1/1000

2 koloni x

= 3000 sel

Oleh karena itu, dengan metode dilusi kita dapat memperkirakan jumlah sel mikroba pada suatu benda atau produk. Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi di dalam perhitungan plate count ini, yaitu : a. Koloni yang dihitung dari contoh tiap cawan harus mengandung koloni yang jumlahnya antara 30-300 koloni. Jika tidak ada yang memenuhi syarat ini, maka pilih sample yang jumlahnya mendekati 300. Misal 1 : Dilusi 10-3 Petri I : 200 koloni Dilusi 10-3 Petri II : 204 koloni Dilusi 10-4 Petri I : 15 koloni Dilusi 10-4 Petri II : 18 koloni

Dikarenakan dilusi 10 -4 pada sample jumlah koloni kurang dari 30, maka yang dihitung hanyalah dilusi 10 -3, yaitu : (200+204)/ 2 x 1/10 -3 = 202 x 103 sel. Misal 2 : Dilusi 10-3 Petri I : 340 koloni Dilusi 10-3 Petri II : 260 koloni Dilusi 10-4 Petri I : 23 koloni Dilusi 10-4 Petri II : 26 koloni Dikarenakan yang mengandung koloni pada kisaran 30-300 adalah hanya Dilusi 10-3 Petri II, maka jumlah sel adalah 260 x 103 sel. b. Koloni yang tumbuh di dalam lapisan-lapisan air pada permukaan agar atau di antara permukaan agar dan bagian bawah petri dish dikenal dengan (Spreader). Spreader ini bentuknya besar dan seringkali menutupi koloni-koloni lainnya sehingga petri menjadi susah dihitung (uncountable). Penyebab spreader ini seringkali adalah kontaminasi dan lapisan air yang tersisa pada petri. Apabila spreader yang muncul ukurannya kecil dan terpisah dari koloni lainnya maka dihitung sebagai satu koloni. c. Bila jumlah bakteri yang diperoleh dari hasil pengenceran berturutturut kurang lebih sama atau hasil perbandingan jumlah bakteri yang lebih banyak dibagi dengan jumlah bakteri yang lebih sedikit adalah lebih kecil dari dua, maka hasil pengenceran tersebut dirata-ratakan. Misal 1 : Dilusi 10-3 Petri I : 250 koloni Dilusi 10-3 Petri II : 200 koloni Dilusi 10-4 Petri I : 34 koloni Dilusi 10-4 Petri II : 40 koloni Dikarenakan hasil perhitungan masuk pada kisaran 30-300, maka dapat dihitung semua tingkat pengenceran sebagai berikut : Dilusi 10-3 : (250+240)/ 2 x 103 = 245 x 103.

Dilusi 10-4 : (34+40)/ 2 x 104 = 37 x 104 = 370 x 103. Perbandingan jumlah pengenceran tersebut adalah : 370 x 103 : 245 x 103 = 1,51 Dikarenakan hasil perbandingan kurang dari 2, maka hasil dari dua pengenceran tersebut dapat dirata-ratakan : (245 + 370)/ 2 x 103 = 307,5 x 103 sel. d. Pada umumnya, jumlah koloni pada pengenceran pertama lebih besar dan lebih banyak daripada pengenceran setelahnya, sehingga seringkali sukar dihitung. Karena itu penghitungan dimulai dari pengenceran-pengenceran setelahnya yang dapat dihitung. Apabila pengenceran pertama menunjukkan tidak ada koloni, namun pada pengenceran setelahnya menunjukkan ada koloni atau water blanko (kontrol) menunjukkan adanya pertumbuhan koloni, maka perlakuan perlu diulang, karena telah terjadi kontaminasi yang menyebabkan data yang diperoleh tidak valid. Setelah inkubasi, hitung semua koloni yang terbentuk yang berada pada kisaran 30-300 koloni dan catat pada tiap dilusi yang berbeda. Hanya plate dengan jumlah 30-300 yang countable (dapat dihitung). Hal ini dikarenakan jumlah koloni yang kurang dari 30 dianggap negatif karena akan memberikan nilai probabilitias 0, sehingga sampel tidak absah secara statistik untuk digunakan dalam penghitungan. Jumlah koloni yang lebih dari 300 tidak dapat dihitung karena saling menumpuknya koloni sehingga perhitungan menjadi tidak akurat.

Dibawah ini disajikan gambar hasil pengenceran

Dilution Plate 1 Plate 2

10-2

10-3

10-4

10-5

5. Isolasi dan Identifikasi Isolasi berguna untuk memisahkan satu sel mikroorganisme dari mikroorganisme lainnya dalam media untuk menghasilkan satu koloni. Satu koloni mikroorganisme dibuat dari jutaan sel bakteri yang teridentifikasi, berasal dari satu sel mikroorgansime. Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam sampel digunakan metode MPN (Most Probable Number). Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyburkan pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji. Uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari 3 tahap yaitu (1) Uji penduga (presumptive test), (2) Uji penguat (confirmed test) dan

Uji

pelengkap (completed

test).

Uji

penduga

juga merupakan

uji

kuantitatif koliform menggunakan metode MPN. a. Uji penduga (presumptive test) Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri koliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume didalam tabung Durham. Berikut disajikan gambar dengan menggunakan media laktosa yang akan digunakan untuk menghitung MPN.

Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan

untuk menghitung jumlah mikroba didalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1x24 jam hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2x24 jam pada suhu 35 oC. Jika dalam waktu 2x24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN dengan metode tiga tabung.

No of Tubes Positive In first

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2

No of Tubes Positive In middle

0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2

middle

last MPN first

0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 <0.03 2 0.03 0.06 0.09 0.03 2 2 2 2

last MPN
0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 0.091 0.14 0.20 0.26 0.15 0.20 0.27 0.34 0.21 0.28 0.35 0.42 0.29 0.36 0.44 0.53 0.23 0.39 0.64 0.95 0.43 0.75 1.2 1.6 0.93 1.5

0.061 2 0.092 2 0.12 2 0.062 2 0.093 2 0.12 0.16 0.13 0.16 0.19 2 2 2 2 2

0.094 2

0.036 3 0.072 3 0.11 0.15 0.11 0.15 0.19 0.11 0.15 3 3 3 3 3 3 3

0.073 3

1 1

2 2

2 3

0.5 0.24

3 3

2 2

2 3

2.1 2.9

b. Uji penguat (confirmed test) Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1x24 jam pada suhu 35oC, suspensi ditanamkan pada media Eosin Methylen Biru Agar (EMBA) secara aseptik kehijauan dengan kilat metalik atau dengan menggunakan jarum koloni berwarna merah muda inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah dengan lendir untuk kelompok koliform lainnya. Berikut adalah gambar isolasi koliform dengan menggunakan media EMBA.

c. Uji pelengkap (completed test) Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji kelengkapan untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji ketetapan diinokulasikan kedalam medium kaldu laktosa dan medium agar miring Nutrient Agar (NA), dengan jarum inokulasi secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 1x24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli. Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu 37 oC (untuk golongan koli) dan satu seri diinkubasi pada suhu 42 oC (untuk golongan koli coli

fekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42oC, sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42oC. Standar Nasional Indonesia (SNI) mensyaratkan tidak adanya koliform dalam100 ml air minum. Akan tetapi United States Enviromental Protection Agency (USEPA) lebih longgar persyaratan uji koliform-nya mengingat koliform belum tentu menunjukkan adanya kontaminasi feses manusia, apalagi patogen. USEPA mensyaratkan presence/ absence test untuk koliform pada air minum, dimana dari 40 sampel air minum yang diambil paling banyak 5% boleh koliform. Apabila sampel yang diambil lebih kecil dari 40, maka hanya satu sampel yang boleh positif mengandung koliform. Meskipun demikian, USEPA mensyaratkan pengujian indikator sanitasi lain seperti protozoa Giardia lambliadan bakteri Legionella. Pada air bukan untuk minum umumnya terdapat perbedaan persyaratan koliform dan Escherichia coli. Air untuk kolam renang (primary contact water) misalnya mensyaratkan kandungan koliform <2,4 x 103, tetapi syarat Escherichia coli tentunya lebih ketat, yaitu < 1 x 103 dalam 100 ml. d. Uji identifikasi Untuk membedakan Enterobacter aerognes dan Escherichia coli dilakukan uji IMViC (Indole, sebagai berikut :
indole + (-) - (+) - (+) methyl red + - (+) + VogesProskauer + citrat probable e identification + + Escherichia coli Enterobacter or Klebsiella Citrobacter

Methyl

red,

Voges-Proskauer

tes,

penggunaan Citrat). Kedua reaksi tersebut akan memberikan hasil

Dibawah ini adalah hasil dari uji IMViC :

Reaksi Indole

Reaksi Methyl Red

Media Sitrat

Metode MPN dapat disimpulkan secara keseluruhan seperti paad gambar dibawah ini:

C. MEMBANDINGKAN DATA DENGAN STANDAR

Dari hasil pengujian di laboratorium didapatkan pada tiga depo air minum isi ulang yaitu : Elita, Tirta Alam dan Sinta tidak terbentuk gas pada tabung Durham. Ini menunjukkan bahwa air tersebut tidak mengandung bakteri Koliform, dimana nilai MPN seri 3-3-3 adalah 0-0-0 dengan indeks MPN < 3. Berarti MPN Koliform/ 100 cc air minum contoh = 0. Data dari penelitian ini pun ditunjang dengan standar atau acuan dari Lampiran Surat keputusan Dirjen POM Nomor : 037267/B/SK/VII/89 bahwa jensis-jenis pengujian pada air mineral dalam 100 ml, yaitu angka lempeng total 102, MPN koliform < 3, Escherichia coli = 0, Clostridium perfingens = 0 dan Salmonella menunjukkan negatif. Data pada standar dapat dijadikan dasar dapat mengandung atribut atau variabel. Atribut data adalah keputusan ya atau tidak, contoh: ada atau tidaknya organisme khusus terdapat dalam sampel pada jumlah yang melebihi level khusus (bisa nol). Jumlah dari sampel positif mewakili atribut data, dan keputusan didasarkan pada jumlah sampel positif. Rencana yang tersebut sebelumnya didasarkan pada data atribut.

DAFTAR PUSTAKA

Badan Standar Nasional. 2004. Tata Cara Pengambilan Contoh dalam Rangka Pemantauan Kualitas Air pada suatu Daerah Pengaliran Sungai. http://www.bsn.or.id/SNI/download/Ed03_04/SNI03-7016-2004.pdf. Diakses tanggal 23 Januari 2007. Barnet, Margaret. 1997. Microbiology Laboratory Exercises. 2nd Edition. Wm. C. Brown Publisher. London. Danasaputra, R. 2004. Pedoman Teknis Operasional Alat Pasteurisasi Susu. http://agribisnis.deptan.go.id/web/pustaka/teknologi %20proses/Pedoman%20Teknis%20Operasional%20Alat %20PasteurisasiSusu.pdf. Diakses tanggal 23 Januari 2007. Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PAU. IPB. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. raja Grafindo Persada. Jakarta. Paustian, T. 2006. Microbiology and Bacteriology; The World of Microbes. http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php? module=Book&func=displayarticle&art_id=273. Diakses tanggal 29 Januari 2007. Pratama, M. R. 2006. Mengenal Media Pertumbuhan Mikrobial. http://rachdie.blogsome.com/2006/10/18/mengenal-media-pertumbuhanmikrobial/. Diakses tanggal 23 Januari 2007. ________________. Prosedur Analisa Mikrobial Rutin (Industri Kosmetika). http://rachdie.blogsome.com/2006/10/17/mikrobiologipangan/. Diakses tanggal 23 Januari 2007. ________________. Teknik Dasar Analisa Mikrobiologi . http://rachdie.blogsome.com/2006/11/01/teknik-dasar-analisamikrobiologi/ . Diakses Tanggal 23 Januari 2007. ________________. Teknik Dasar Analisa Mikrobiologi 2. http://72.14.235.104/search? q=cache:Te_5HLyaY94J:www.bpkp.go.id/unit/hukum/bpkp/1989/41 089.pdf+penentuan+jumlah+sampel+yang+akan+diuji&hl=id&gl=id& ct=clnk&cd=6. Diakses tanggal 23 Januari 2007. Reynolds, J, and College, R. 2004. Lab Procedures Manual; Water Analysis.

http://www.rlc.dcccd.edu/mathsci/reynolds/micro/lab_manual/TOC.html. Diakses tanggal 17 januari 2007. Supardi, I. Dan Sukamto. 1999. Mikrobiologi dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan. Alumni. Bandung. Widiyanti, N. L. P. M dan Ristiati, N. P. 2004. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform pada Depo Air Minum Isi Ulang Di Kota Singaraja Bali. http://www.ekologi.litbang.depkes.go.id/data/vol%203/Ni%20Putu %20_2.pdf. Diakses tanggal 23 Januari 2007.