DGJDLMBM,.M, VM,.M LLMFL BM 09E02234

J usuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas
s Semangat
Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR
TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG
KABUPATEN KARO, SUMATERA UTARA

TESIS

Oleh

JUSUF GINTING
067030012/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2009

J usuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat

8

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR
TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
dalam Program Studi Magister Biologi pada Sekolah Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara

Oleh

JUSUF GINTING
067030012/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2009


8

Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM
AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER
AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG
Nama Mahasiswa : Jusuf Ginting
Nomor Pokok : 067030012
Program Studi : Biologi

Menyetujui,
Komisi Pembimbing :

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.)
Ketua Anggota

Ketua Program Studi Direktur

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M. Sc.) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B., M.Sc)


8

Tanggal lulus : 27 September 2008
Telah diuji pada
Tanggal 27 September 2008

PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.
Anggota : 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.
2. Dr. Herla Rusmarilin, M.S.
3. Dr. Delvian, MP.


8

ABSTRAK

Isolasi bakteri dan uji aktivitas enzim amilase kasar termofilik dari sumber air panas
Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo telah dilakukan di Laboratorium
Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Sumatera Utara, dari bulan Pebruari sampai dengan Agustus 2008.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan karakterisasi bakteri termofil yang
berpotensi amilolitik serta mengetahui aktivitas enzim amilase. Kemampuan isolat
bakteri dalam menghidrolisis pati ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar
koloni setelah ditambahkan larutan iodin 0,1%. Tiga isolat yang dipilih menghasilkan
zona bening terbesar yaitu SG.3 dengan diameter zona bening 52,56 mm, diikuti
SG.2 sebesar 48,75 mm dan SG.1 sebesar 26,15 mm. Konsentrasi glukosa terbesar
hasil hidrolisis pati pada penelitian ini adalah 1074,07 g/ml setelah diinkubasi
selama 48 jam pada suhu 65
o
C dan pH 7,0. Suhu dan pH optimum aktivitas enzim
amilase pada penelitian ini adalah 60
o
C dan 5,0-7,0.

Kata kunci: Amilase, termofilik, amilolitik, hidrolisis pati.


8

ABSTRACT

A study on bacterial isolation and activity assay of crude amylase of thermophilic
bacteria from Desa Semangat Gunung hot spring has been carried out in
Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and
Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to August 2008. This
study was aimed to obtain and to characterize the thermophilic bacteria that had an
amylolytic potentional and to know the activity of crude amylase enzyme. The ability
of isolates to hydrolize starch was indicated by clearing zone around bacterial
colonies after addition of 1% iodine solution. Three isolates with wider clearing zone
were chosen for further work. The result showed that SG.3 produced clearing zone
with diameter of 52.26 mm, followed by SG.2 (48.75 mm) and SG.1 (26.15 mm). The
highest concentration of glucose released was 1074.07 g/ml after incubated for 48
hours at temperature of 65
o
C and pH of 7.0. The optimum temperature and pH for the
enzyme activity in this study was 60
o
C and 5.0-7.0 respectively.

Key words: Amylase, thermophilic, amylolytic, starch hydrolysis.


8

KATA PENGANTAR

Dengan rendah hati, penulis mengucapkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang
Maha Esa atas anugerah dan berkat-Nya yang telah diberikan, sehingga penulis dapat
menyelesaikan penulisan tesis dengan judul, Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Enzim
Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten
Karo, Sumatera Utara. Tesis ini merupakan salah satu persyaratan penyelesaian studi
pada Program Studi Magister Biologi, Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera
Utara. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada:
Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp. A(K) selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara.
Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc. selaku Direktur Sekolah Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk
mengikuti Program Studi Magister Biologi di Sekolah Pascasarjana Universitas
Sumatera Utara Medan.
Kepala Bappeda Pemerintah Propinsi Sumatera Utara yang telah memberikan
beasiswa kepada penulis dan Kepala Dinas Pendidikan Kota Medan yang telah
memberikan izin untuk mengikuti Program Studi Magister Biologi di Sekolah
Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan.
Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing I dan Prof. Dr. Erman
Munir, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing II yang telah membimbing penulis sehingga
dapat menyelesaikan penelitian dan menyempurnakan tesis ini.


8

Seluruh Staf Pengajar pada Program Studi Magister Biologi Sekolah Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara, yang telah memberikan ilmunya selama masa
perkuliahan.
Rekan-rekan Mahasiswa Program Studi Magister Biologi Sekolah Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan bantuan moril dan materil serta
dorongan kepada penulis dalam penulisan tesis ini.
Keluarga Besar Ginting di Tanjung Morawa dan Keluarga Besar Pasaribu di
Medan yang tetap mendorong dan mendoakan penulis dalam penyelesaian studi.
Terakhir penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada Istri tercinta
Dra. Roslina Pasaribu yang tidak kenal lelah memberi semangat dan tetap
mendukung dalam doa selama masa studi.
Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak/Ibu/Saudara/i dan
rekan sekalian yang telah membantu penulis baik secara langsung maupun tidak
langsung. Semoga Tuhan Yang Maha Esa memberkati kita semua.

Medan, 3 Juni 2009
Penulis,

Jusuf Ginting


8

DAFTAR ISI

Halaman
ABSTRAK ...................................................................................................... i
ABSTRACT ...................................................................................................... ii
KATA PENGANTAR ...................................................................................... iii
DAFTAR ISI ................................................................................................... v
DAFTAR TABEL ............................................................................................ vii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... ix
BAB 1 PENDAHULUAN................................................................................ 1
1.1. Latar Belakang............................................................................ 1
1.2. Perumusan Masalah .................................................................... 3
1.3. Tujuan Penelitian ........................................................................ 4
1.4. Hipotesis ..................................................................................... 5
1.5. Manfaat Penelitian ...................................................................... 5
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 6
2.1. Enzim ......................................................................................... 6
2.2. Enzim Amilase ........................................................................... 7
2.3. Bakteri Termofilik ...................................................................... 9
2.4. Enzim Termostabil...................................................................... 10
2.5. Potensi Enzim -amilase dalam Industri...................................... 13
BAB 3 METODE PENELITIAN ..................................................................... 15
3.1. Waktu dan Tempat ...................................................................... 15
3.2. Bahan dan Alat ........................................................................... 15
3.3. Sumber Isolat .............................................................................. 15
3.4. Pengambilan Sampel Air Panas................................................... 16
3.5. Isolasi Bakteri ............................................................................. 16
3.6. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml
Untuk Pengujian ........................................................................ 17
3.7. Pengujian Produksi Enzim -amilase .......................................... 18
3.8. Uji Biokimia Metabolisme Bakteri .............................................. 18
3.9. Pembuatan Media Produksi Enzim Amilase ................................ 20
3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar ............................... 20
3.11. Pembuatan Kurva Baku Glukosa ................................................. 21
3.12. Analisis Data .............................................................................. 22
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 23
4.1. Isolasi, Seleksi dan Karakter Bakteri Penghasil Amilase ............. 23
4.2. Aktivitas Enzim Amilase Isolat Termofil Semangat Gunung ...... 25


8

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase ................... 27
4.4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase ....................... 31
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 35
5.1. Kesimpulan................................................................................. 35
5.2. Saran .......................................................................................... 35
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 36


8

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1. Enzim Termostabil yang Menghidrolisis Pati dan Mikroorganisme
Sebagai Sumbernya ............................................................................... 11

2. Reaksi Biokonversi dan Penggunaan Enzim Termostabil ....................... 12

3. Penggunaan -amilase Dalam Beberapa Sektor Industri ........................ 14

4. Sidik Ragam .......................................................................................... 22

5. Karakter Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase
Dari Sumber Air Panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo .......... 24

6. Diameter Zona Bening Pada Berbagai Isolat Bakteri Termofilik
Penghasil Enzim Amilase Setelah Inkubasi Selama 72 Jam .................... 26

7. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur
Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung ........................ 28

8. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur
Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung .......................... 32


8

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1. Pembentukan Zona Bening oleh Isolat Bakteri Termofilik
Penghasil Amilase Isolat Semangat Gunung .......................................... 26

2. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur

3. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur


8

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas ................................................... 40

2. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase ........................... 41

3. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 10
8
CFU/ml .................................... 42

4. Pengujian Produksi Enzim Amilase oleh Isolat Bakteri ......................... 43

5. Pembuatan Kultur Untuk Produksi Enzim Amilase ................................ 44

6. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar ......................................... 45

7. Uji Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar ............... 46

8. Uji Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar .................. 47

9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase .............. 48

10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa ....................................................... 49

11. Sidik Ragam Pengaruh Suhu Terhadap Konsentrasi Glukosa
Hasil Hidrolisis Pati Isolat Semangat Gunung ....................................... 50

12. Sidik Ragam Pengaruh pH Terhadap Konsentrasi Glukosa
Hasil Hidrolisis Pati Isolat Semangat Gunung ....................................... 51

13. Gambar Pewarnaan Gram ...................................................................... 52

14. Gambar Uji Biokimia ............................................................................ 52

15. Gambar Sumber Air Panas Desa Semangat Gunung .............................. 53


8

BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Penggunaan enzim secara tidak langsung dalam berbagai proses telah dilakukan
sejak awal peradaban manusia. Sekarang ini, hampir 4000 macam enzim telah
diketahui, dan 200 diantaranya digunakan secara komersial. Mayoritas enzim yang
digunakan dalam industri adalah bersumber dari mikroorganisme. Hingga tahun
1960-an, total penjualan enzim hanya beberapa juta dollar per tahun, tetapi mulai saat
itu pasar enzim bertumbuh secara spektakuler (Godfrey and West, 1996).
Enzim adalah protein yang mengkatalis reaksi kimia. Pada reaksi enzimatis,
molekul pada awal proses disebut substrat, dan enzim merubahnya menjadi molekul
yang berbeda. Hampir semua proses dalam sel hidup membutuhkan enzim untuk
mempercepat reaksi. Enzim sangat spesifik terhadap substrat dan dapat menghasilkan
produk utama hampir tanpa produk sampingan. Keunggulan-keunggulan ini
menyebabkan enzim menjadi katalis hayati yang jauh lebih unggul daripada katalis
kimiawi. Prospeknya sebagai biokatalis yang ramah lingkungan karena proses yang
efisien, spesifik, dan tidak menghasilkan limbah yang merepotkan sehingga sangat
dinantikan oleh kalangan industri manufaktur dan masyarakat yang mencintai
lingkungan.


8

Industri pati adalah salah satu pengguna enzim terbesar untuk hidrolisis dan
modifikasi bahan mentahnya. Polimer pati, seperti polimer-polimer lainnya
memerlukan kombinasi enzim-enzim untuk melengkapi hidrolisisnya. Kombinasi ini
meliputi -amilase, glukoamilase atau -amilase dan isoamilase atau pullulanase
(Poonam and Dalel, 1995). Dari seluruh konsumsi enzim di dunia, enzim
penghidrolisis pati digunakan sebanyak 30% (Van der Maarel et al., 2002).
Pati didegradasi oleh enzim amilolitik dari sejumlah mikroorganisme (Lin et
al., 1997). Amilase dari tumbuhan, hewan dan mikroorganisme telah dipelajari sejak
pertama sekali enzim ditemukan (Boyer et al., 1972). -amilase adalah salah satu
enzim yang paling penting dan banyak digunakan dalam bioteknologi sekarang ini.
Enzim yang bersumber dari mikroorganisme secara umum banyak diminati oleh
industri. Spektrum pemakaian enzim amilase secara luas digunakan di berbagai
bidang seperti medis, kimia analisis, industri tekstil, industri makanan dan industri
penyulingan (Pandey et al., 2000).
Amilase merupakan enzim yang menghidrolisis molekul pati untuk
memberikan produk yang bervariasi termasuk dekstrin dan polimer-polimer kecil
yang tersusun dari unit-unit glukosa (Windish and Mhatre, 1965). Enzim-enzim ini
memiliki jumlah yang besar digunakan dalam bioteknologi dalam pembuatan roti,
makanan, tekstil dan industri kertas. -milase memiliki kira-kira 25% dari seluruh
pasar enzim, hampir menggantikan hidrolisis kimia pati pada industri pengolahan pati
(Pandey et al., 2000).
1


8

Penggunaan enzim termostabil secara luas telah diterapkan dalam bidang
industri, yaitu: -amilase dalam industri pati (Poonam and Dalel, 1995), sejumlah
pemakaian yang lain yaitu pada tahapan perkembangan yang bervariasi. Dalam
industri makanan, enzim ini telah digunakan dalam sintesis asam amino (Satosi et al.,
2001). Dalam bidang perminyakan, kimia dan industri pulp dan kertas, enzim
termostabil telah digunakan untuk melenyapkan sulfur yang mengandung polutan
pada biodegradasi senyawa kimia seperti dibenzitiofen (Bahrami et al., 2001), pada
produksi 1,3-propandiol dari gliserol dan pada penggantian reagen kimia pencemar
yang menyebabkan terbentuknya produk yang beracun (Peter et al., 2001).
Enzim termostabil adalah enzim yang stabil dan aktif pada suhu yang lebih
tinggi dari pada suhu optimum untuk pertumbuhan mikroorganisme (Saboto et al.,
1999). Enzim termostabil adalah enzim yang paling diinginkan oleh kebanyakan
industri. Enzim -amilase termostabil telah digunakan secara luas dalam proses
pembuatan bir, produksi gula, industri tekstil dan dalam industri pembuatan deterjen
(Hewitt and Solomons, 1996). Setiap penggunaan enzim -amilase memerlukan
kekhususan spesifitas, stabilitas, suhu dan pH. Seleksi mikroorganisme dengan
aktifitas -amilase yang tinggi dapat memfasilitasi penemuan amilase yang baru yang
sesuai untuk digunakan dalam industri (Gupta et al., 2003). Fermentasi termofilik
juga dianggap sangat baik digunakan dalam bidang teknik dan pemeliharaan
lingkungan (Kristjanson, 1989).

3


8

1.2. Perumusan Masalah
Banyak industri yang dalam proses produksinya memerlukan bantuan enzim.
Pada umumnya enzim yang diperlukan adalah enzim yang tahan terhadap suhu tinggi
karena proses kimia dalam industri banyak yang berlangsung pada suhu tinggi yaitu
di atas 40
o
C. Oleh karena itu, kebutuhan akan enzim yang bersifat termostabil sangat
tinggi. Salah satu enzim yang berperan sangat penting dalam industri dan
bioteknologi adalah enzim amilase. Dilaporkan bahwa kebutuhan akan enzim amilase
termostabil bagi industri adalah yang terbesar dibandingkan dengan enzim-enzim
lainnya.
Indonesia merupakan salah satu wilayah yang memiliki aktifitas vulkanologi
yang relatif tinggi dan banyak memiliki sumber geotermal sehingga memiliki peluang
yang cukup besar sebagai sumber mikroorganisme penghasil enzim amilase
termostabil. Salah satu sumbernya adalah kolam sumber air panas yang cukup banyak
tersebar di Indonesia termasuk di Sumatera Utara, diantaranya adalah sumber air
panas yang terletak di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara.
Melalui penelitian ini akan diselidiki apakah terdapat bakteri termofilik penghasil
amilase dalam sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo,
Sumatera Utara.

1.3. Tujuan Penelitian
4


8

a. Untuk mendapatkan isolat bakteri yang memiliki potensi amilolitik dari
kolam sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo,
Sumatera Utara.
b. Untuk mengetahui karakter bakteri termofil yang bersifat amilolitik dari
kolam sumber air panas.
c. Untuk mengetahui aktivitas enzim amilase kasar dari isolat bakteri
termofil.
1.4. Hipotesis
a. Terdapat beberapa isolat bakteri termofilik yang mampu menghasilkan
enzim amilase dari sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka,
Karo, Sumatera Utara.
b. Terdapat perbedaan karakter diantara isolat bakteri termofilik penghasil
enzim amilase.
c. Terdapat perbedaan aktivitas enzim amilase kasar dari isolat-isolat bakteri
termofilik tersebut.

1.5. Manfaat Penelitian
a. Sebagai informasi bahwa terdapat bakteri termofilik penghasil enzim
amilase di kolam sumber air panas Desa Semangat Gunung, Merdeka,
Karo, Sumatera Utara.
5


8

b. Sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut terhadap usaha
eksplorasi enzim amilase yang bersifat termostabil.


8

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Enzim
Enzim adalah suatu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang berfungsi
sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi)
dalam suatu reaksi kimia. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan
molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi.
Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya
dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan
perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai contoh, enzim -
amilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan pati menjadi glukosa (Maton
et al., 1993).
Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu,
keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH optimum
yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan
bentuk jika suhu dan pH berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak
dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini
akan menyebabkan enzim akan kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga
dipengaruhi oleh kofaktor dan inhibitor (Maton et al., 1993).


8

2.2. Enzim Amilase
Amilase adalah nama yang diberikan kepada enzim glikosida hidrolase yang
memecah pati menjadi molekul maltosa. Enzim ini ditemukan terutama pada air liur.
-amilase bekerja dalam ikatan -1,4-glikosida. -amilase adalah enzim yang
pertama ditemukan dan diisolasi. -amilase dari tumbuhan, hewan dan
mikroorganisme telah dipelajari sejak enzim ditemukan untuk pertama kalinya (Boyer
and Ingle, 1972). -amilase merupakan salah satu enzim yang sangat penting dalam
bidang bioteknologi sekarang ini. Enzim yang bersumber dari mikroorganisme secara
umum banyak diminati oleh industri. Spektrum pemakaian enzim amilase secara luas
digunakan di berbagai bidang seperti medis, kimia analisis, industri tekstil, industri
makanan dan industri penyulingan (Pandey et al., 2000). Enzim amilase dapat
diklasifikasikan ke dalam 3 (tiga) kelompok, yaitu:
1. Alfa amilase (-amilase)
-amilase (EC 3.2.1.1) memiliki nama lain yaitu 1,4--D-glukan glukano
hidrolase; glikogenase. Enzim ini menghidrolisis pati, glikogen, dan polisakarida
lainnya melalui pemutusan ikatan -1,4-glikosida secara acak. Karena
kemampuannya bekerja di bagian manapun dari substrat, -amilase bekerja lebih
cepat daripada -amilase. Enzim -amilase terdapat pada bermacam-macam bakteri,
jamur, tumbuhan, dan hewan dan memiliki peranan yang besar dalam penggunaan
polisakarida. -amilase merupakan enzim penting dalam industri.
6
7


8

Pada umumnya -amilase adalah metaloenzim, yang membutuhkan ion kalsium
(Ca
2+
) untuk aktifitas, integritas struktural dan untuk stabilitasnya (Bordbar and
Omidiyan, 2005). -amilase dapat dibagi ke dalam 4 kelompok, yaitu endoamilase,
eksoamilase, enzim pemutus cabang dan transferase (Van der Mareel et al, 2002).
Endoamilase memutus ikatan -1,4, eksoamilase memutus ikatan -1,4 atau -1,6
dari residu glukosa eksternal, enzim pemutus cabang menghidrolisis ikatan -1,6
rantai panjang polisakarida, dan transferase memutus ikatan -1,4 glikosida molekul
donor dan mentransfer bagian dari donor kepada akseptor glikosida membentuk
ikatan glikosida baru.
2. Beta amilase (-amilase)
-amilase (EC 3.2.1.2) memiliki nama lain 1,4--D-glukan maltohidrolase;
glikogenase; sakarogen amilase. -amilase juga disintesis oleh bakteri, jamur, dan
tumbuhan. -amilase mengkatalis hidrolisis ikatan kedua dari -1,4 glikosida,
memutuskan dua unit glukosa pada saat yang sama. Selama proses pematangan buah,
-amilase memecah pati menjadi gula, menghasilkan rasa manis pada buah yang
matang. -amilase juga ada pada perkecambahan, dimana -amilase dan protease
memperlihatkan bahwa perkecambahan telah dimulai. Sejumlah mikroorganisme juga
menghasilkan amilase untuk mendegradasi pati ekstraseluler. Jaringan hewan tidak
memiliki -amilase, kecuali bila mikroorganisme terdapat dalam saluran
pencernaannya. pH optimum -amilase adalah 12.
3. Gamma amilase ( -amilase )


8

-amilase (EC 3.2.1.3) memiliki nama lain glukan 1,4--glukosidase; 1,4--D-
glukan glukohidrolase; exo-1,4--glukosidase; glukoamilase; lisosomal -glukosidase
Pemutusan ikatan akhir (1-4) glikosida pada ujung non reduksi dari amilose dan
amilopektin, menghasilkan glukosa, -amilase juga memutuskan ikatan (1-6)
glikosida. -amilase sangat efisien pada lingkungan yang bersifat asam dan bekerja
pada pH optimum 3.

2.3. Bakteri Termofilik
Organisme termofilik diartikan sebagai organisme yang mampu hidup pada
suhu tinggi. Organisme ini tidak hanya mampu bertahan hidup tetapi bahkan tumbuh
subur dalam air mendidih (Brock, 1985). Bakteri dibagi menjadi beberapa kelas
berdasarkan suhu dimana mereka dapat tumbuh dengan baik. Bakteri dengan suhu
yang rendah adalah psikrofil, yang dapat tumbuh baik hingga suhu -10
o
C dan suhu
optimum 15
o
C atau lebih rendah. Mesofil dapat tumbuh pada suhu 2045
o
C. Termofil
tumbuh dengan subur pada suhu di atas 45
o
C, dan beberapa hidup pada suhu atau
bahkan diatas titik didih air. Strain bakteri termofilik telah diidentifikasi dengan
rentang suhu optimum dari 55
o
C hingga 105
o
C
Kemampuan bakteri termofilik tumbuh pada suhu tinggi dan menghasilkan
enzim ekstraseluler yang stabil merupakan pertanda adanya kemungkinan
peningkatan produksi dan aktifitas enzim mereka melalui rekayasa genetika. Oleh
9


8

karena itu, mikroorganisme ini merupakan kandidat pertama untuk menghasilkan
enzim yang digunakan dalam industri (Hisotsuyanagi, 1979).
Mikroorganisme, sebagaimana halnya makhluk hidup lainnya, menyesuaikan
diri dengan lingkungan tempat mereka hidup. Organisme termofilik mengandung
protein yang bersifat termostabil dan tahan terhadap denaturasi dan proteolisis
(Kumar et al., 2001). Membran sel termofilik dibentuk oleh asam lemak jenuh. Asam
lemak melengkapi suatu lingkungan hidrofobik untuk sel dan menjaga kekakuan sel
untuk hidup pada suhu yang meningkat (Herbert et al., 1992).

2.4. Enzim Termostabil
Mikroorganisme termofilik dipercaya berpotensi menjadi pilihan yang baik
sebagai sumber enzim termostabil. Bakteri termofilik dapat diisolasi dari lingkungan
alam yang bersuhu tinggi yang tersebar di seluruh dunia dan ditemukan di daerah
yang memiliki gunung berapi aktif (Brock, 1985).
Enzim termostabil memungkinkan terjadinya proses pada suhu tinggi, yang
jelas menguntungkan sebab memiliki reaktifitas yang tinggi, stabilitas yang lebih
tinggi, hasil yang lebih tinggi, viskositas yang rendah dan masalah kontaminasi yang
lebih rendah (Moszhaev, 1993). Enzim termostabil dapat diperoleh dari organisme
mesofilik dan termofilik, bahkan psikrofil memiliki beberapa enzim termostabil
(Adams et al., 1995). Enzim termostabil yang diisolasi dari organisme termofilik
memiliki sejumlah pemakaian secara komersil oleh karena stabilitasnya (Demirijan et
10


8

al., 2001). Keuntungan dari bioproses yang berlangsung pada suhu tinggi adalah
kecepatan difusi yang lebih tinggi, menurunkan viskositas substrat, kecepatan reaksi
lebih tinggi (Milo et al., 1999), meningkatkan kelarutan reaktan, dan mengurangi
risiko terjadinya kontaminasi dengan mikroba patogen (Mtzel et al., 1997).
Polimer pati memerlukan suatu kombinasi enzim untuk melengkapi
hidrolisisnya. Kombinasi enzim ini meliputi -amilase, glukoamilase atau -amilase
dan isoamilase atau pullunase (Poonam and Dalel, 1995). Tabel 1 berikut ini
menunjukkan enzim termostabil yang menghidrolisis pati yang diperoleh dari
mikroorganisme.
Tabel 1. Enzim termostabil yang menghidrolisis pati dan mikroorganisme sebagai
sumbernya (Underkofler, 1976)

Enzim Mikroorganisme
Suhu optimal
(
o
C )
pH
optimal
-amilase

-amilase

Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus licheniformis
Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Lactobacillus manihotivorans
Myceliophtora thermophila
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus woesei
Staphylothermus marinus
Thermococcus aggreganes
Thermococcus celer
Thermococcus fumicolans
Thermococcus hydrothermalis
Thermococcus profoundus
Bacillus circulans
Bacillus cereus var. mycoides
Bacillus sp.
Clostridium thermosulphurogenes
70
100
70 80
70
55
100
100
100
65
100
90
95
85
80
60
50
50
75
7,0
6,0 6,5
5,0 6,0
7,0
5,5
5,6
5,5
6,5 7,5
5,0
5,5
5,5
4,0 6,3
4,8 7,8
4,0 5,0
-
-
7,5
5,5
11


8

Pullulanase
Bacillus sp.
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus woesei
Thermococus aggregans
Thermus caldophilus GK 24
Thermococus celer
Thermococcus hydrothermalis
Thermococcus litoralis
Thermotoga maritima MSB8
60
98
100
100
75
90
95
98
90
-
5,5
5,5 6,0
6,5
5,5
5,5
5,5
5,5
6,0

Beberapa konversi biokatalitik enzim termostabil dan penggunaannya dalam
industri dapat dilihat dalam Tabel 2.
Tabel 2. Reaksi biokonversi dan penggunaan enzim termostabil (Haki and Rakshit,
2003)

Enzim
Rentang
suhu (
o
C )
Biokonversi Aplikasi
-amilase
( bakteri )

-amilase
( jamur )
Pullulanase
Xylanase

Kitinase

Selulase

Protease

Lipase
90 100

50 60

50 60
45 65,
105
65 75

45 55,
95

65 85

30 70
Pati dekstrosa

Pati dekstrosa

Pati dekstrosa
Bubur kayu xylan +
lignin
Kitin kitobiose
Kitin N-asetil
glukosamin
N-asetil glukosamin
glukosamin
Kitin kitosan
Selulosa glukosa

Protein asam amino
dan peptida

Pelepasan lemak,
Hidrolisis pati, pembuatan
bir, pembuatan roti dan
deterjen
Produksi maltosa

Produksi sirup glukosa
Industri kertas

Industri makanan,
kosmetik, farmasi, agro
kimia

Hidrolisis selulosa,
degradasi polimer dalam
deterjen
Pembuatan roti, pembuatan
bir, deterjen, industri kulit

Industri susu, deterjen,
12


8

DNA
polimerase

90 - 95
hidrolisis, inesterifikasi,
alkoholisis, aminolisis
DNA amplifikasi
bubur kertas, farmasi,
kosmetik dan industri kulit
Teknik genetika / PCR

2.5. Potensi Enzim -amilase Dalam Industri
Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaannya paling
besar. Pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total
enzim yang lainnya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti
tumbuhan, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme
banyak digunakan dalam industri. Hal ini dikarenakan mikroorganisme periode
pertumbuhannya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang
berasal dari fungi pada tahun 1894 (Burhan et al, 2003).
Enzim -amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai
macam makanan, minuman dan industri tekstil. -amilase ekstra seluler dihasilkan
dari beberapa bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus
dan B. licheniformis (Pandey et al, 2000). -amilase termostabil memiliki nilai
komersial yang luas dalam penggunaannya dalam memproses pati, pembuatan bir dan
produksi gula (Leveque et al, 2000), industri tekstil dan dalam proses pembuatan
deterjen (Hewitt and Solomons, 1996). Sifat termostabil yang dimiliki oleh enzim
13


8

merupakan karakter yang diinginkan oleh banyak industri yang menggunakan enzim
(Morgan and Priest, 1981). Penggunaan enzim -amilase dalam beberapa sektor
industri ditunjukkan pada Tabel 3 di bawah ini.

Tabel 3. Penggunaan -amilase dalam beberapa sektor industri (Van der Mareel et al,
2002)

Sektor Penggunaan
Industri makanan Produksi sirup glukosa, kristalin glukosa
Produksi sirup fruktosa jagung
Produksi sirup maltosa
Pengurangan viskositas sirup gula
Pengurangan pembentukan uap pada jus
Pelarutan dan pembentukan gula pati untuk
fermentasi alkohol dalam industri bir
Penghambat pembusukan pada industri roti
Industri deterjen Digunakan sebagai bahan tambahan untuk
menghilangkan kotoran dari pati
Industri kertas Pengurangan viskositas pati pada kertas
Industri tekstil Pencegahan pembesaran pada serat tekstil
Industri farmasi Digunakan sebagai bantuan pencernaan

14


8

BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Pebruari sampai Agustus 2008 bertempat di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

3.2. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah yeast ekstrak, bacto pepton,
MgSO
4
.7H
2
O, NaCl, CaCl
2
.2H
2
O, KCl, pati, hidrogen peroksida 3%, iodium, kristal
violet, aquadest, gram iodin, alkohol, safranin, reagen dinitrosalicilyc acid (DNS),
sitrat buffer fosfat.
Alat yang digunakan adalah botol sampel steril, termometer, indikator pH
universal, shaker, forteks, water bath, bunsen, pipet ukur, propipet, jarum ose, petri
dish, tabung reaksi, autoklaf, inkubator, gelas objek, erlenmeyer, hot plate, magnetic
stirer, oven, test tube, mikroskop, kamera foto, spectrofotometer, sentrifuge, jangka
sorong.

3.3. Sumber Isolat


8

Sumber isolat dalam penelitian ini adalah air dari sumber air panas Desa
Semangat Gunung, Kabupaten Karo, Sumatera Utara.
3.4. Pengambilan Sampel Air Panas
Sampel air panas diambil dari sumber air panas Desa Semangat Gunung,
Kabupaten Karo, Propinsi Sumatera Utara, dari 3 tempat yang berbeda. Sebelum
sampel air diambil, terlebih dahulu dilakukan pengukuran parameter fisik dan kimia
di lapangan. Parameter pertama yang diukur adalah suhu air di tiap titik pengambilan
sampel dengan menggunakan termometer yang dicelupkan selama 3 menit ke dalam
tiap sumber pengambilan sampel. Parameter ke dua adalah pH air pada setiap titik
pengambilan sampel yang diukur dengan indikator pH universal dengan cara
dicelupkan ke permukaan air, lalu warna yang diperoleh dicocokkan dengan tabel pH
yang tertera pada kotak pH universal. Sampel air diambil dari kolam sumber air panas
dengan kedalaman 40 cm dari permukaan air sebanyak 200 ml dari setiap titik
pengambilan, kemudian dimasukkan ke dalam botol steril dan diberi label dan
selanjutnya dimasukkan ke dalam termos agar suhu air dapat dipertahankan. Sampel
air kemudian dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA,
Universitas Sumatera Utara, untuk dilakukan isolasi.

3.5. Isolasi Bakteri
Isolasi bakteri dilakukan dengan menggunakan media padat yang mengandung
pati 10 g, yeast ekstrak 2 g, bacto pepton 5 g, MgSO
4
.7H
2
O 0,5 g, NaCl 0,5 g,
15
16


8

CaCl
2
.2H
2
O 0,15 g, agar 20 g yang dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH diatur
sampai pH 7). Larutan dipanaskan dan disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit
pada suhu 121
o
C, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak 15 ml.
Sampel diambil sebanyak 0,1 ml dan disebarkan di atas lempeng agar dengan
menggunakan hockey stick untuk menumbuhkan bakteri. Hal ini dilakukan sebanyak
dua kali ulangan untuk setiap sampel yang berbeda. Isolat diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 60
o
C. Setiap koloni yang berbeda dimurnikan kembali pada medium segar
dengan metode cawan gores. Isolat murni bakteri yang diperoleh kemudian
dikarakterisasi melalui pengamatan morfologi koloni yang meliputi bentuk koloni,
tepi koloni, elevasi koloni, warna koloni, uji bakteri gram positif dan negatif, dan
sejumlah uji biokimia yang meliputi uji katalase, uji hidrolisis pati, uji hidrolisis
gelatin, uji sitrat, uji TSIA dan uji motilitas. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 1
dan 2.

3.6. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 10
8
CFU/ml Untuk Pengujian
Bakteri yang digunakan dalam pengujian dibuat dalam bentuk suspensi. Dengan
menggunakan jarum ose diambil 1-2 ose biakan bakteri lalu dimasukkan ke dalam
tabung reaksi steril yang telah berisi larutan NaCl fisiologis 0,85%. Campuran
kemudian dihomogenkan dengan vortex, kekeruhan campuran dibandingkan dengan
kekeruhan McFarland 0,5 standard yang setara dengan 10
8
CFU/ml. Alur kerja dapat
dilihat pada Lampiran 3.
17


8

Bahan untuk pembuatan larutan McFarland adalah BaCl
2
(1,175% 10/v BaCl
2
)
dan H
2
SO
4
(1% v/v). 0,05 ml dari 0,048 M BaCl
2
ditambahkan pada 99,5 ml 0,35 N
H
2
SO
4
.

3.7. Pengujian Produksi Enzim Amilase
Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam cawan petri yang berisi
media produksi amilase, lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 65
o
C. Tiap koloni
yang tumbuh pada media pati tersebut ditetesi dengan reagen iodium untuk
menyeleksi bakteri penghasil enzim amilase. Isolat yang menghasilkan enzim amilase
ditunjukkan oleh adanya zona bening di sekitar koloni bakteri. Diameter zona bening
diukur dengan menggunakan jangka sorong. Tiap isolat yang positif menghasilkan
enzim amilase melalui uji iodin ini digunakan untuk pengujian selanjutnya. Alur kerja
dapat dilihat pada Lampiran 4.

3.8. Uji Biokimia Metabolisme Bakteri
3.8.1. Uji Katalase
Sebanyak 2 tetes hidrogen peroksida diteteskan pada kaca objek, kemudian satu
ose isolat bakteri termofil amilase diletakkan di atasnya. Uji katalase positif ditandai
dengan dihasilkannya gelembung udara. Adanya gelembung udara menunjukkan
banyaknya gas oksigen yang dihasilkan (Lay, 1994).
3.8.2. Uji hidrolisis pati
18


8

Satu ose isolat bakteri dari suspensi biakan diambil lalu digoreskan pada media
pati dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65
o
C. Permukaan koloni ditetesi dengan
iodin. Uji positif ditunjukkan dengan adanya zona bening disekeliling koloni (Lay,
1994).

3.8.3. Uji hidrolisis gelatin
Satu ose inokulum ditusukkan ke bagian tengah media gelatin semi padat lalu
diinkubasi selama 5 hari pada suhu 65
o
C dan didinginkan dalam lemari pendingin
selama 15 menit. Uji positif bila terdapat cairan pada permukaan media (Lay, 1994).
3.8.4. Uji Sitrat
Satu ose isolat bakteri digoreskan ke dalam tabung yang berisi media miring
Simone Citrat Agar (SCA) dan dengan ose lurus isolat bakteri ditusukkan di bagian
tengah media sampai ke dasar tabung reaksi, lalu diinkubasikan selama 48 jam pada
suhu 65
o
C. Uji positif ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi
biru (Lay, 1994).
3.8.5. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
Satu ose isolat bakteri digoreskan pada media miring TSIA, kemudian bagian
tengah media ditusuk dengan lurus. Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65
o
C. Uji
positif ditandai dengan keretakan atau naiknya media dan adanya endapan hitam
(Lay, 1994).
3.8.6. Uji Motilitas
19


8

Satu ose isolat bakteri diinokulasikan pada media Sulfit Indol Motility (SIM)
dengan cara menusukkannya hingga setengah media pada tabung reaksi lalu
diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65
o
C. Uji positif ditunjukkan dengan adanya
jejak pergerakan bakteri (Lay, 1994).

3.9. Pembuatan Media Produksi Enzim Amilase
Bahan untuk membuat media produksi enzim amilase terdiri dari (per liter
larutan) 2% pepton, 0,03% K
2
HPO
4
, 0,1% MgSO
4
.7H
2
O dan 0,5% pati. Semua
bahan dicampur lalu sebanyak 40 ml dipindahkan ke dalam tabung erlenmeyer 100
ml dan disterilisasi di dalam autoklaf. Satu ose isolat bakteri yang dipilih
dicampurkan dengan media produksi amilase yang telah steril kemudian digoyang
dalam shaker water bath selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 65
o
C.
Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 5.
3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar
Kultur bakteri penghasil enzim amilase yang berumur 72 jam disentrifugasi
dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil.
Satu ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1
ml larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat, kemudian diinkubasi dalam water bath
selama 20 menit untuk setiap perlakuan suhu (40
o
C, 50
o
C, 60
o
C, 65
o
C, 70
o
C, 80
o
C).
Variasi suhu yang digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan pendapat Brock
20


8

(1985) yang mengemukakan bahwa kecepatan tumbuh maksimal dari beberapa
bakteri termofilik berkisar pada suhu 55
o
C-70
o
C. Satu unit aktivitas enzim amilase
didefenisikan sebagai banyaknya pati yang terhidrolisis menjadi glukosa selama masa
inkubasi 20 menit. Setelah dikeluarkan dari water bath, ditambahkan 2 ml
dinitrosalicilyc acid (DNS) untuk menghentikan reaksi. Campuran didinginkan pada
air mengalir selama 15 menit. Selanjutnya absorbansi diuji dengan menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan
dengan kurva standard glukosa yang terbuat dari larutan glukosa monohidrat dengan
konsentrasi mulai 0,010,20 ppm (Kombong, 2004). Alur kerja dapat dilihat pada
lampiran 6. Pekerjaan yang sama dilakukan pada perlakuan pH dengan cara
mengukur aktivitas enzim dengan menggunakan pH yang bervariasi yaitu 4,0, 5,0,
6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada suhu 65
o
C. Buffer yang digunakan untuk penentuan pH
optimum adalah buffer sitrat fosfat 0,05 M. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 7.
Aktivitas enzim amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif
sebagai mg glukosa yang dihasilkan per ml filtrat enzim dengan menggunakan rumus:

Dimana :
AE = Aktivitas Enzim (unit/ml filtrat enzim)
MG = Miligram Glukosa
BMg = Berat Molekul glukosa
MI x BMg
1000 x MG
AE =
21


8

MI = Masa Inkubasi
3.11. Pembuatan Kurva Baku Glukosa
Bahan yang digunakan adalah glukosa monohidrat (C
6
H
12
O
6
. H
2
O) 1000 g/ml
(1000 ppm), diencerkan pada berbagai konsentrasi yaitu 80, 100, 120, 140, 160, 180,
200, 220, 240, dan 260 g/ml (10 variasi konsentrasi). Sebanyak 1 ml dari tiap
konsentrasi glukosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1,5 ml
reagen DNS, dipanaskan selama 5 menit lalu didinginkan dengan air mengalir selama
15 menit, kemudian ditambahkan 20 ml aquadest steril dan diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 540 nm. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 10.
3.12. Analisis Data
Hasil pengamatan morfologi dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil
berupa data kuantitatif dianalisis varian, bila didapatkan perbedaan nyata atau sangat
nyata dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (Sujana, 1989). Rancangan
yang dilakukan adalah rancangan acak lengkap non faktorial karena media dan
kondisi lingkungan serta perlakuan terhadap amilase kasar dikondisikan sama kecuali
perlakuan suhu dan pH untuk mengukur aktivitas enzim. Perlakuan suhu dan pH
dilakukan dengan 3 kali ulangan. Dalam penelitian ini diukur konsentrasi amilase
kasar (g/ml) pada berbagai kondisi suhu dan pH. Data hasil penelitian dihitung
dalam struktur Tabel sidik ragam yang disajikan sebagai berikut.
Tabel 4. Sidik Ragam
Sumber
keragaman
Derajat
bebas
Jumlah kuadrat
Kuadrat
tengah
F
hitung

F
tabel

0,05 0,01
22


8

Perlakuan

p-1

( Yij)
2
/n.FK

JK
perl
/db
perl

KT
P
/KT
G

Tabel F

Tabel F
Galat

p(n-1) JK
t
-JK
p
JK
G
/db
G
(0,05) (0,01)
Total p(n-1) JK
total

Pengujian hipotesis dilanjutkan bila nilai F
hitung
> F
tabel
maka hipotesis nol
ditolak, yang berimplikasi bahwa perlakuan suhu memberikan pengaruh nyata
terhadap konsentrasi glukosa (g/ml). Dengan demikian dilakukan uji Duncan
Multiple Range Test (DMRT) untuk melihat jarak antar perlakuan suhu dan pH.
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi, Seleksi dan Karakter Bakteri Penghasil Amilase
Dari hasil isolasi yang telah dilakukan, diperoleh 8 isolat bakteri penghasil
enzim amilase yang berbeda berdasarkan pengamatan warna, bentuk, tepi dan elevasi
koloni, bentuk dan penataan sel, serta sejumlah uji biokimia sederhana yang meliputi
uji motilitas dengan menggunakan media SIM, uji sitrat dengan menggunakan media
SCA, uji TSIA, uji hidrolisis gelatin dengan menggunakan media gelatin dan uji
katalase dengan menggunakan H
2
O
2
3% serta pewarnaan gram dengan menggunakan
mikroskop cahaya. Hasil dari pengujian ini digunakan untuk pencirian dan
identifikasi mikroorganisme.
Dari 8 isolat tersebut, diperoleh 3 isolat bakteri penghidrolisis pati terbaik yang
ditentukan berdasarkan besarnya zona bening di sekitar koloni bakteri tersebut. Tiga


8

isolat tersebut adalah SG.1, SG.2, dan SG.3. SG.1 diperoleh dari kolam I dengan suhu
air 55
o
C dan pH 7. SG.2 diperoleh dari kolam II dengan suhu air 59
o
C dan pH 6.
SG.3 diperoleh dari kolam III dengan suhu air 62
o
C dan pH 6. Hasil pengamatan
morfologi, uji biokimia sederhana dan pewarnaan gram dari masing-masing koloni
isolat bakteri penghasil enzim amilase dapat dilihat pada Tabel 5 berikut ini.

Tabel 5. Karakter isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase dari sumber air
panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo

Isolat
Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk Uji Biokimia Pewarnaan
Koloni Koloni Koloni Koloni Sel M S T G K Gram

SG.1

SG.2

SG.3

bulat

tidak
beraturan
tidak
beraturan

rata

rata

berlekuk

timbul

rata

timbul

krem

krem

krem

batang

batang

batang

+

+

+

-

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

Keterangan : M =Motilitas G =Gelatin
S =Sitrat K =Katalase
T =TSIA

Dari bentuk koloni, ke-3 isolat memiliki bentuk, tepi dan elevasi koloni yang
bervariasi, sedang warna koloni umumnya krem dan bentuk sel batang. Pewarnaan
Gram menunjukkan 2 isolat yaitu SG.1 dan SG.2 bersifat Gram negatif, sedang isolat
SG.3 bersifat Gram positif. Uji motilitas terhadap ketiga isolat menunjukkan bahwa
23
24


8

ketiganya bersifat motil ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri di dalam
media. Hasil uji sitrat menunjukkan bahwa SG.1 tidak mampu menggunakan sitrat
sebagai sumber karbon, sedangkan SG.2 dan SG.3 mampu menggunakan sitrat
sebagai sumber karbon. Keadaan positif pada uji sitrat ditandai dengan berubahnya
medium dari hijau menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan peningkatan
pH dalam media (Cappuccino and Sherman, 1983). Dari uji TSIA diperoleh bahwa
SG.1 tidak mampu memfermentasikan glukosa dan laktosa atau sukrosa. Keadaan
positif pada uji TSIA ditandai dengan adanya perubahan warna dan endapan hitam
pada media. TSIA digunakan terutama untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif.
Media ini mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa, serta
indikator merah fenol dan FeSO
4
untuk memperlihatkan pembentukan H
2
S yang
ditunjukkan dengan adanya endapan hitam (Lay, 1994). Dari uji hidrolisis gelatin
diperoleh bahwa SG.1, SG.2 dan SG.3 mampu menghidrolisis gelatin. Uji positif
gelatin ditandai dengan medium gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam
lemari pendingin selama 30 menit (Cappuccino and Sherman, 1983). Hasil uji
katalase menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki enzim katalase yang ditandai
dengan terbentuknya gelembung udara di sekitar koloni ketika ditambahkan dengan
larutan 3% H
2
O
2
. Katalase adalah enzim yang mengkatalis penguraian hidrogen
peroksida (H
2
O
2
) menjadi air (H
2
O) dan oksigen (O
2
). Hidrogen peroksida bersifat
toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen


8

peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang
tumbuh dalam lingkaran aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut (Lay, 1994).

4.2. Aktivitas Enzim Amilase Isolat Termofil Semangat Gunung
Isolat bakteri termofilik yang mengindikasikan penghasil enzim amilase
dilihat aktivitasnya dengan mengukur diameter zona bening di sekitar isolat bakteri
termofilik. Zona bening yang terbentuk di sekitar isolat bakteri termofilik
menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut mampu menghidrolisis pati (Dirnawan et
al., 2000). Diameter zona bening terbentuk setelah isolat bakteri diinkubasi selama 72
jam pada suhu 65
o
C.
Besar kecilnya diameter zona bening yang terbentuk dari masing-masing isolat
berbeda-beda. Hal ini disebabkan kemampuan menghidrolisis pati dari setiap isolat
juga berbeda-beda. Diameter zona bening bakteri termofilik penghasil enzim amilase
dari masing-masing isolat dapat dilihat pada Tabel 6 dan pembentukan zona bening
oleh isolat bakteri termofilik penghasil amilase pada isolat Semangat Gunung dapat
dilihat pada Gambar 1.
Tabel 6. Diameter zona bening pada berbagai isolat bakteri termofilik penghasil
enzim amilase setelah inkubasi selama 72 jam

Isolat Diameter Zona Bening (mm)
SG.1
SG.2
SG.3
26,15
48,75
52,56

25
26


8

Gambar 1. Pembentukan zona bening oleh isolat bakteri termofilik penghasil amilase
isolat Semangat Gunung


8

Pada Tabel 6 dan Gambar 1 dapat dilihat bahwa zona bening terbesar dihasilkan
oleh isolat SG.3 (52,56 mm) diikuti oleh SG.2 (48,75 mm) dan SG.1 (26,15 mm).
Hasil ini menunjukkan bahwa isolat SG.3 merupakan penghasil enzim amilase
dengan kriteria memiliki potensi tinggi, diikuti oleh isolat SG.2 dengan kriteria
memiliki potensi sedang dan isolat SG.1 dengan kriteria memiliki potensi rendah.
Pereira et al. (1999) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil enzim
amilase dengan aktivitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi tinggi
dengan diameter zona bening >30 mm, sedang kriteria yang memiliki potensi sedang
adalah diameter zona bening 20-30 mm dan kriteria memiliki potensi rendah adalah
diameter zona bening <20 mm. Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri
termofilik penghasil enzim amilase dengan aktivitas hidrolitik termasuk kriteria
memiliki potensi tinggi dengan diameter zona bening >26 mm, sedang kriteria yang
memiliki potensi sedang adalah diameter zona bening 14-26 mm dan kriteria yang
memiliki potensi rendah adalah diameter zona bening <14 mm.

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase
Aktivitas amilolitik supernatan dalam menghidrolisis pati diuji pada rentang
suhu 4080
o
C pada pH konstan 7,0 ditunjukkan pada Tabel 7 berikut ini.

27


8

Tabel 7. Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai
konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

Isolat Suhu (
o
C)
Konsentrasi glukosa
(g/ml)
Aktivitas enzim
(U/ml)
Notasi 5%
SG.1
40
50
60
65
70
80
141,08
319,68
463,74
422,58
411,38
341,40
0,04
0,09
0,13
0,12
0,11
0,09
c
bc
a
ab
abc
abc
SG.2
40
50
60
65
70
80
772,00
908,97
969,11
856,15
715,28
626,79
0,21
0,25
0,27
0,24
0,20
0,17
c
ab
a
ab
cd
d
SG.3
40
50
60
65
70
80
362,67
532,57
1074,07
876,73
597,74
489,81
0,10
0,15
0,30
0,24
0,17
0,14
e
abcd
a
ab
abc
abcd
Keterangan: angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada masing-masing isolat, tidak
berbeda nyata pada taraf 5%

Pada Tabel 7 di atas dapat dilihat bahwa aktivitas enzim amilase isolat SG.1
pada suhu 40
o
C menunjukkan hasil berbeda nyata pada taraf 5% dibanding dengan
perlakuan pada suhu 60
o
C dan 65
o
C. Perlakuan pada suhu 50
o
C berbeda nyata dengan
perlakuan pada suhu 60
o
C. Perlakuan pada suhu 50
o
C, 65
o
C, 70
o
C dan 80
o
C tidak
berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.2 perlakuan suhu 40
o
C berbeda nyata dengan
suhu 60
o
C dan 80
o
C pada taraf 5%. Perlakuan suhu 50
o
C dan 65
o
C tidak berbeda
nyata pada taraf 5%. Pada SG.3 perlakuan suhu 40
o
C dan 60
o
C berbeda nyata pada
taraf 5%, sedang suhu 50
o
C, 70
o
C dan 80
o
C tidak berbeda nyata pada taraf 5%.

28


8

Dari hasil pengujian diperoleh nilai konsentrasi glukosa tertinggi hasil hidrolisis
pati oleh isolat SG.1 terdapat pada suhu inkubasi 60
o
C yaitu sebesar 463,74 g/ml
dan aktivitas enzim 0,13 U/ml, isolat SG.2 pada suhu 60
o
C sebesar 969,11 g/ml dan
aktivitas enzim 0,27 U/ml, dan isolat SG.3 pada suhu 60
o
C sebesar 1074,07 g/ml
dan aktivitas enzim 0,30 U/ml. Pada Tabel 7 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim
meningkat pada rentang suhu 50
o
C-70
o
C. Aktivitas enzim berkurang pada suhu diatas
70
o
C. Bacillus subtilis dilaporkan memiliki suhu optimum aktivitas enzim -amilase
70
o
C (Burhan et al, 2003). Strain Bacillus stearothermophillus yang diisolasi dari
sampel industri pemrosesan kentang memiliki suhu optimum aktivitas enzim -
amilase 70
o
C dengan pH optimum 5,5-6,0 (Wind et al, 1994). -amilase dari genus
Bacillus stabil pada suhu tinggi dan memiliki potensi yang diharapkan dalam industri
yang menggunakan pati sebagai bahan baku. Untuk lebih jelasnya, berikut ini adalah
grafik pengaruh suhu terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati pada isolat
Semangat Gunung (Gambar 2).
29


8

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi
glukosa isolat Semangat Gunung

Dari Tabel 7 dan Gambar 2 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim dalam
menghidrolisis pati meningkat mulai dari suhu 50
o
C sampai 60
o
C. Suhu optimum
aktivitas enzim amilase pada penelitian ini adalah 60
o
C. Hasil ini sesuai dengan yang
ditunjukkan oleh isolat SG.3 yang memiliki aktifitas enzim tertinggi yang diisolasi
dari sumber air panas dengan suhu 62
o
C. Sohail et al. (2005) melaporkan bahwa
Bacillus sp. memiliki suhu optimum aktivitas enzim -amilase 60
o
C. Anto et al.
(2006) melaporkan bahwa Bacillus cereus MTCC 1305 memiliki suhu optimum
0
200
400
600
800
1000
1200
40 50 60 65 70 80
Suhu (
o
C)
SG.2 SG.3 SG.1
K
o
n
s
e
n
t
r
a
s
i

g
l
u
k
o
s
a

(
g
/
m
l
)

30


8

aktivitas enzim -amilase 55
o
C. Enzim -amilase dari genus Bacillus stabil pada suhu
tinggi dan sangat diminati oleh industri yang menggunakan larutan pati. Menurut
Burhan et al. (2003), pengaruh suhu terhadap aktivitas produksi amilase berhubungan
dengan pertumbuhan organisme. Rentang suhu yang besar (35-80
o
C) merupakan suhu
optimum untuk pertumbuhan dan produksi enzim -amilase pada bakteri. Pengaruh
suhu terhadap aktivitas enzim secara umum ditunjukkan melalui mekanisme
kompleks yang melibatkan fenomena berlawanan dari stimulasi dan inaktifasi.
Aktivitas mula-mula meningkat dengan makin tingginya suhu, namun pada suatu titik
tertentu terjadi inaktifasi enzim yang ditandai dengan menurunnya aktivitas enzim.
Pengaruh suhu sesungguhnya agak kompleks, yaitu suhu yang terlalu tinggi akan
mempercepat pemecahan atau perusakan enzim, sebalikya semakin tinggi suhu
semakin aktif pula enzim tersebut.

4.4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase
Aktivitas amilolitik supernatan pada pH yang berbeda diuji pada rentang pH
4,09,0 pada suhu inkubasi 65
o
C. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim disebabkan
oleh terjadinya perubahan tingkat ionisasi pada enzim atau substrat sebagai akibat
dari perubahan pH. Analisis data pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil
hidrolisis pati isolat Semangat Gunung dapat dilihat pada Tabel 8. pH optimum pada
SG.1 adalah 7,0 dengan konsentrasi glukosa 345,29 g/ml dan aktivitas enzim 0,10
U/ml. pH optimum SG.2 adalah 5,0 dengan konsentrasi glukosa 798,75 g/ml dan
31


8

aktivitas enzim 0,22 U/ml. pH optimum SG.3 adalah 5,0 dengan konsentrasi glukosa
822,99 g/ml dan aktivitas enzim 0,23 U/ml.
Tabel 8. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase yang diukur sebagai
konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

Isolat pH
Konsentrasi glukosa
(g/ml)
Aktivitas enzim
(U/ml)
Notasi 5%
SG.1
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
225,92
264,57
268,68
345,29
265,71
241,01
0,06
0,07
0,07
0,10
0,07
0,07
bcd
abc
ab
a
abc
bcd
SG.2
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
318,99
798,75
644,85
610,78
496,67
364,50
0,09
0,22
0,18
0,17
0,14
0,10
d
a
b
b
c
d
SG.3
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
786,63
822,99
610,09
576,25
568,02
534,17
0,22
0,23
0,17
0,16
0,16
0,15
ab
a
c
cd
cde
cde
Keterangan : angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada masing-masing isolat, tidak
berbeda nyata pada taraf 5%

Dari Tabel 8 dapat dilihat bahwa pada SG.1 perlakuan pada pH 7,0 berbeda
nyata dengan pH 4,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 5,0, 6,0, 7,0 dan 8,0
tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.2 perlakuan pada pH 4,0 tidak berbeda
nyata dengan perlakuan pH 9,0 dan perlakuan pH 6,0 tidak berbeda nyata dengan
perlakuan pH 7,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 5,0 berbeda nyata dengan pH
4,0, 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Pada SG.3 perlakuan pH 5,0 berbeda nyata
32


8

dengan pH 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 7,0, 8,0, dan 9,0
tidak berbeda nyata pada taraf 5%.
Pada umumnya enzim hanya aktif pada kisaran pH yang terbatas. Nilai pH
optimum suatu enzim ditandai dengan menurunnya aktivitas pada kedua sisi lainnya
dari grafik yang disebabkan oleh turunnya afinitas atau stabilitas enzim. Grafik
pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati pada isolat Semangat
Gunung dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.

Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi
glukosa isolat Semangat Gunung

0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0
pH
SG.3
K
o
n
s
e
n
t
r
a
s
i

g
l
u
k
o
s
a

(
g
/
m
l
)

SG.1 SG.2
33


8

Dari Tabel 8 dan Gambar 3 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim amilase pada
isolat SG.1 meningkat mulai dari pH 5,0-7,0 dengan pH optimum 7,0. Penurunan
aktivitas enzim terjadi pada pH di atas 7,0. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas
enzim amilase dan pertumbuhan bakteri isolat SG.1 paling baik terjadi pada
lingkungan dengan pH netral. Pada isolat SG.2, aktivitas optimum enzim amilase ada
pada pH 5,0. Pada isolat SG.3, aktivitas enzim amilase meningkat pada pH optimum
5,0. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas dan pertumbuhan bakteri isolat SG.2 dan
SG.3 paling baik terjadi pada lingkungan asam. Penurunan aktivitas enzim amilase
terjadi pada pH di atas 5,0. Anto et al. (2006) melaporkan bahwa Bacillus cereus
MTCC 1305 memiliki pH optimum aktivitas enzim -amilase 5,0.

34


8

BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi bakteri dan uji
aktivitas enzim amilase kasar termofilik, dapat disimpulkan sebagai berikut :
a. Sebanyak 3 isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase kasar yang
memiliki zona bening terbesar telah diisolasi dan diseleksi dari 8 isolat
dengan karakteristik morfologi koloni dan sifat biokimia yang berbeda.
b. Suhu optimum aktivitas enzim amilase ketiga isolat adalah 60
o
C yang
ditunjukkan oleh besarnya konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati.
c. Isolat SG.3 memiliki aktivitas enzim amilase tertinggi pada suhu dan pH
optimum 60
o
C dan 5,0.
d. Aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,30 unit/ml diperoleh dari isolat SG.3.

5.2. Saran
Enzim yang dihasilkan pada penelitian ini masih berupa enzim kasar dan belum
optimal. Disarankan untuk diadakan penelitian lebih lanjut untuk mempelajari
mekanisme dan faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas enzim dari bakteri
termofilik isolat Semangat Gunung.


8

DAFTAR PUSTAKA

Adams, M.W.W. and Kelly, R.M. 1998. Finding and using thermophilic enzymes.
Trends in Biotechnology 16: 329-332.

Anto, H., Trivedi, U. and Patel, K. 2006. Alpha amylase production by Bacillus
cereus MTCC 1305 using solid-state fermentation. Food Technol. Biotechnol.
44 : 241-245.

Bahrami, A., Shojaosadati, and S., Mahbeli, G. 2001. Biodegradation of
dibenzothiophene by thermophilic bacteria. Biotechnol. Lett. 23: 899-901.

Bordbar, K., and Omidiyan, R. H. 2005. Study on interaction of -amilase from
Bacillus subtilis with cetyl trimethylammonium bromide, Colloids Surf. B.
Biointerfaces 40: 67-71.

Boyer, E.W., and Ingle, M. 1972. Extracellular alkaline amylase from a Bacillus
species. J. Bacteriol 110: 992-1000.

Brock, T.D. 1985. Life at high temperatures. Science 230: 132-138.

Burhan, A., Nisa, U., Gokhan, C., Omer, C., Ashabil, A., and Osman, G. 2003.
Enzymatic properties of a nover thermophilic, alkaline and chelator resistant
amylase from an alkalophilic Bacillus sp. isolate ANT-6. Process Biochemistry
38: 1397-1403.

Cappuccino, J.G and Sherman, N. 1983. Microbiology a laboratory manual. 2
nd
ed.
New York: The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.

Demirijian, D.C., Morris-Varas, F., and Cassidy, C.S. 2001. Enzyme from
extremophiles. Curr. Opln. Chem. Biol. 5: 144-151.

Dirnawan, H., Suwanto, A., and Purwanaria, T. 2000. Eksplorasi bakteri termofil
penghasil enzim hidrolitik ekstraseluler dari sumber air panas Gunung Pancar.
Hayati 7: 52-55.

35


8

Godfrey, T. and West, S. 1996. Industrial enzymology. London, UK: Macmillan
Press.

Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., and Chauhan, B. 2003.
Microbial -amylase: a biotechnological perspective. Process Biochemistry 38:
1599-1616.
Haki, G.D. and Rakshit, S.K. 2003. Developments in industrially important
thermostable enzymes: a review. Bioresource Technology 89: 17-34.

Herbert, R. and Sharp, R. 1992. Molecular Biology and Biotechnology of
Extremophiles. Chapman and Hall, New York.

Hewitt, J.C., and Solomons, G.L. 1996. The production of -amylase (E.C.3.2.1.1.)
by Bacillus amyloliquefaciens, in a complex and a totally defined syntetic
culture medium. Journal of Industrial Microbiology 17: 96-99.

Hisotsuyanagi, K. 1979. Stepwise introduction of regulatory genes stimulating
production of -amylase into Bacillus subtilis: Constructions of -amylase
extrahyper producing strain. Agric. Biol. Chem. 43:2343-2349.

Igarashi, K., Hatada, Y., Hagihara, K., Saeki K., Takaiwa, M., and Kobayashi, T.
1998. Enzymatic properties of a novel liquefying -amylase from an
alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences.
Appl. Environ. Microbiol. 64: 3282-3289.

Kombong, H. 2004. Evaluasi daya hidrolitik enzim glukoamilase dari filtrat kultur
Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar 5: 16-20.

Kristjansson, J.K.1989. Thermophilic organisms as sources of thermostable enzymes.

Kumar, H.D. and Swati, S. 2001. Modern Concepts of Microbiology, second revised
ed. Vikas Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Edisi I. Cetakan I. Jakarta: Raja
Grafindo Persada.

Leveque, E., Janecek, S., Haye, B., and Belarbi A. 2000. Thermophilic archaeal
amylolityc enzimes. Trends in biotechnology 7: 49-53.

36
37


8

Lin L.L., Hsu W.H. and Chu W.S. 1997. A gene encoding form an -amylase form
themophilic Bacillus sp. Strain TS-23 and its expression in Escherichia coli. J.
Appl. Microbiol. 82: 325-334.

Maton, A., Jean, H., William, L., Susan, J.and Maryanna, QW., 1993. Human Biology
and Health. Englewood Cliffs, New Jersey, USA: Prentic Hall.

Milo, R.E., Duffner, F.M. and Muller, R. 1999. Catechol 2, 3-dioxygenase from the
thermophilic, phenol-degrading Bacillus thermoleovorans strain A2 has
unexpected low thermal stability. Extremophile 3: 185-190.

Morgan, F.J. and Priest, F.G. 1981. Characterization of thermostable -amylase from
Bacillus licheniformis NCTB 6346. Journal of Applied Bacteriology 50: 104-
114.

Moszhaev, V. 1993. Mechanism-based strategies for protein thermostabilization.

Mtzel, A., Reinscheid, U.M., Antranikian, G. and Muller, R. 1996. Isolation and
characterization of thermostable Bacillus strain that degrade phenol and cresol
as sole carbon source at 70
o
C. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 593- 596.

Pandey, A., Nigam P. and Soccol C.R. 2000. Advances in microbial amylases.
Biotechnol. Appl. Biochem 31: 135 152.

Pereira, N., Andrade, A. and Carolina, M. 1999. Thermophilic microorganism and
their polymer-hydrolitic enzymes. Brazilian Arch. Bio. and Tech. 12: 112-130.

Peter, W., Alexandra, T. and Klaus, D. 2001. Conversions of glycerol to 1,3-
propandiol by a newly isolated thermophilic strain. Biotechnol. Lett. 23: 463-
466.

Poonam, N. and Dalel, S. 1995. Enzyme and microbial systems involved in starch
processing. Enzyme Microb. Technol. 17: 770-778.

Saboto, D., Nucci R., Rossi, M., Gryczynski, I., Gryczynski, Z. and Lakowicz, J.
1999. The -glycosidase from the hyperthermophilic archaeon
Sulfolobusolfataricus: enzyme activity and conformational dynamics at
temperature above 100
o
C. Biophys. Chem. 81: 23-31.

Satosi, H., Seigo, O., Kenji, T., Kazuhisa, K., Tetsuo, K., Toshiaki, K. and Hitosi, K.
2001. Chemo-enzymatic synthesis of 3-(2-naphtyl)-L-alanine by an amino
38


8

transfer form the extreme themophiles Thermococcus profundus. Biotechnol.
Lett. 23: 589-591.

Sohail, M., Ahmad, A., Shahzad, S. and Khan, S.A. 2005. A survey of amylolytic
bacteria and fungi from native environmental samples. Pak. J. Bot., 37: 155-
161.

Sujana. 1989. Metode Statistika. Edisi ke-5. Bandung: Tarsito.
Underkofler, L. 1976. Microbial enzymes. In: Miller, B., Litsky, W. (Eds). Industrial
Microbiology. McGraw-Hill, New York.

Van der Maarel, M., Van der Veen, B., Uitdehaag, H., Leemhuis, H. and Dijkhuizen,
L. 2002. Properties and application of starch converting enzymes of the -
amylase family. J. Biotechnol. 94: 137-155.

Wind, R.D., Buitelaar, R.M., Egglink, G.,Huizing, H.J., and DijKhuized, L. 1994.
Characterization of a new Bacillus stearothermophillus isolate: a highly
thermostable -amylase producing strain. Applied Microbiology and
Biotechnology 41: 155-162.

Windish, W.W. and Mhatre, N.S. 1965. Microbial amylases. In W.U. Wayne (Ed.).
Advances in applied microbiol. 7: 273-304. New York: Academic Press.

Zeikus, J., Lee, C., Lee, Y. and Saha, B. 1998. Thermostable saccharides: new
sources, uses and biodesigns. J. Biotechnol. 60: 155-163.

39


8

Lampiran
1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas

diambil 0,1 ml

disebar kedalam petri dish
berisi media agar selektif
termofil
diinkubasi selama 48 jam
pada suhu 65
o
C

diambil satu ose dari
tiap koloni yang tumbuh
digores pada media agar
selektif amilase
pada suhu 65
o
C

ditetesi larutan iodin
terdapat zona bening
Sampel air panas

Kultur bakteri
dalam media padat
Kultur murni bakteri
termofil amilolitik


8

2. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase

Karakteristik
makroskopis

Karakteristik
mikroskopis
Karakteristik sifat
fisiologi / biokimia
- bentuk koloni
- tepi koloni
- elevasi koloni
- warna koloni
- uji bakteri
gram +/ -
- bentuk sel
- uji katalase
- uji hidrolisis pati
- uji gelatin
- uji sitrat
- uji TSIA
- uji motilitas

H a s i l

Bakteri termofil
penghasil enzim amilase
40
Isolat tunggal bakteri
penghasil enzim amilase


8

3. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 10
8
Cfu/ml

diambil satu ose
dimasukkan dalam larutan
NaCl 0,85%

dihomogenkan dengan
vortex

dibandingkan dengan
kekeruhan Mac Farland 0,5
standard yang setara dengan
10
8
CFU/ml

Isolat bakteri
Suspensi isolat bakteri
41


8

4. Pengujian Produksi Enzim Amilase oleh Isolat Bakteri

diambil 0,5 ml

dimasukkan dalam cawan
petri berisi media agar +pati
pada suhu 65
o
C

ditetesi larutan iodium

Suspensi isolat bakteri
tunggal
Isolat bakteri
Menghasilkan zona
bening
Isolat menghasilkan
enzim amilase
Zona bening diukur
dengan jangka sorong
42


8

5. Pembuatan Kultur Untuk Produksi Enzim Amilase

diambil satu ose
dilarutkan dalam 40 ml
media produksi amilase
yang telah disterilisasi

pada suhu 65
o
C dalam
shaker water bath dengan
kecepatan 150 rpm

Isolat tunggal penghasil
amilase dengan zona
bening terbesar
Kultur bakteri dengan
produksi enzim amilase
Seleksi 3 isolat terpilih
43


8

6. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar

disentrifugasi selama 20
menit dengan kecepatan
6000 rpm

Supernatan diambil dengan
mikropipet

Kultur bakteri produksi
enzim amilase
Supernatan yang mengandung
enzim amilase kasar
44


8

7. Uji Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

diambil 1 ml
dimasukkan ke dalam
tabung reaksi
ditambahkan 1% larutan pati
diinkubasi dalam water bath
selama 20 menit pada suhu
40
o
C, 50
o
C, 60
o
C, 65oC,
70
o
C, 80
o
C
ditambahkan 2 ml reagen
DNS untuk menghentikan
reaksi
dipanaskan selama 5 menit
dalam air mendidih
didinginkan selama 15 menit
pada air mengalir
absorbansi diuji dengan
spektro-fotometer dengan
panjang gelombang 540 nm

Ekstrak enzim amilase
dari supernatan
45


8

dibandingkan dengan
larutan standar glukosa

8. Uji Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

diambil 1 ml
dimasukkan ke dalam
tabung reaksi
dalam larutan sitrat buffer
fosfat pada pH 4, 5, 6, 7, 8,
dan 9
65
o
C
reaksi
dalam air mendidih

pada air mengalir

data hasil pengujian
dari supernatan
46


8

dibandingkan dengan

9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase

diambil 2 ml
dipanaskan dalam air
mendidih selama 20 menit

dalam larutan sitrat buffer
fosfat sampai pH 6,5
40, 50, 60, 65, 70, dan 80
o
C

reaksi
dalam air mendidih

dari supernatan
47


8

pada air mengalir dan
ditambah 20 ml air suling


dibandingkan dengan

10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa

dibuat pengenceran 80-280
g/mol
dimasukkan 1ml ke dalam
tabung reaksi

ditambah 1,5 ml reagen DNS

didinginkan dengan air
mengalir selama 15 menit
ditambahkan 20 ml aquadest
divortex
diukur absorbansinya dengan
Larutan standar glukosa
1 ml larutan standar glukosa
dalam tabung reaksi
48


8

spektrofotometer pada

dibuat kurva standar dan
persamanaan regresinya

11. Sidik ragam pengaruh suhu terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis
pati isolat Semangat Gunung.

Sidik Ragam untuk isolat SG.1.
SK db J K KT F
Perlakuan 5 199840,40 39968,0807 8,608**
Galat Percobaan 12 55712,43 4642,7028
17 255552,84
Tanda ** =berbeda nyata pada taraf 5%
Koefisien Keragaman (KK) =19,46%

SK db J K KT F
Perlakuan 5 243604,27 48720,8558 14,220**
Galat Percobaan 12 41114,49 3426,2073
17 284718,77
Absorbansi
Kurva standar
glukosa
49


8


SK db J K KT F
Perlakuan 5 1067368,4 213473,679 258,7916**
Galat Percobaan 12 9898,64 824,8864
17 1077267,03

12. Sidik ragam pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati
isolat Semangat Gunung.

SK db J K KT F
Perlakuan 5 25465,73 5093,1476 2,3605**
Galat Percobaan 12 25891,13 2157,5945
17 51356,87

SK db J K KT F
Perlakuan 5 493418,34 98683,6682 79,5683**
Galat Percobaan 12 14882,86 1240,2383
17 508301,20
50


8

SK db J K KT F
Perlakuan 5 227288,45 45457,6916 22,0514**
Galat Percobaan 12 24737,30 2061,4414
17 252025,76

13. Gambar Pewarnaan Gram

SG.1 : Gram (-) SG.2 : Gram (-) SG.3 : Gram (+)

14. Gambar Uji Biokimia

51


8

Isolat SG.1 Isolat SG.2 Isolat SG.3

15. Gambar sumber air panas desa Semangat Gunung
1. Gambar sumber air panas I ( Lokasi I )
52


8

Suhu air panas 55
o
C, pH air 7,0.

2. Gambar sumber air panas II ( Lokasi II )

53
54


8

Suhu air panas 59
o
C, pH 6,0.

3. Gambar sumber air panas III ( Lokasi III )

55


8

Suhu air panas 62
o
C, pH 6,0.


8


8


8


8


8


8


8


8


8

DGJDLMBM,.M, VM,.M LLMFL BM 09E02234

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

DGJDLMBM,.M, VM,.M LLMFL BM 09E02234

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

J usuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas

Anda mungkin juga menyukai