BAB III METODE ANALISIS A. Prinsip Metode 1. Kromatografi lapis tipis Prinsip KLT adalah pemisahan omponen!

omponen atas dasar per"edaan adsorpsi ata# partisi oleh fase diam di "a$ah fase gera %ang telah di"#at. &. Densitometri Penetapan adar s#at# sen%a$a dengan lempeng romatografi mengg#na an instr#men TLC scanner dengan 'ara meng# #r serapan analit (peng# #ran 'aha%a dapat "er#pa 'aha%a %ang dipant#l an ata# %ang diter#s an)* pemadaman fl#oresensi #nt# mengand#ng "ahan "erfl#oresensi analit ata# hasil rea si analit. B. Alat dan Bahan 1. Alat + ! Nera'a analiti ! Chamber ! Lempeng KLT sili'a gel ! ,-&./ 01 ! ,elas "e er ! La"# # #r .1 ml* 11 ml ! Pipet 2ol#me 1 ml* 3 ml* . ml* 4 ml* 1. ml* &. ml ! Kertas saring ! S%ringe & 5L ! Densitometer ! TL6 scanner &. Bahan + ! Sampel (min#man gelas mer 789) ! Standar tartra:ine dan rhodamin ! El#en + n!"#tanol + metil etil eton + N;/O; + air (.+3+1+1) ! A<#adest lapisan %ang

&

Pem"#atan "a # Tartra:ine a. Pem"#atan lar#tan sto Tartra:ine 3 mg=ml Ditim"ang "a # tartra:ine dengan se sama se"an%a 1.1 mg mengg#na an nera'a analiti . Ser"# dit#ang an e dalam gelas "ea er dan dilar#t an dengan &1 mL A<#ades mengg#na an pengad# dimas# Stok T. ". Pem"#atan seri lar#tan Ba # Tartra:ine Lar#tan Stok T diam"il 1*1 > &*1 > 3*1 > /*1 dan .*1 mL mengg#na an pipet gondo . Masing ? masing dimas# T1 #nt# an e dalam la"# ta ar &. mL "er"eda. Ditam"ah an onsentrasi 1*&/ mg=mL > T3 #nt# onsentrasi A<#ades hingga "atas tanda pada masing!masing la"# ta ar terse"#t lal# di"eri la"el onsentrasi 1*1& mg=mL > T2 #nt# onsentrasi 1*30 mg=mL > T4 #nt# 1*01 mg=mL pada la"# ta ar. onsentrasi 1*/@ mg=mL dan T5 #nt# hingga lar#t semp#rna lal# lar#tan terse"#t an e dalam la"# ta ar .1 mL dan ditam"ah an A<#ades hingga "atas

tanda. Didapat an lar#tan 3 mg=mL %ang mer#pa an Ba # Tartra:ine dan di"eri la"el

3. Pem"#atan "a # Ahodamine a. Pem"#atan lar#tan sto Ahodamine 3 mg=ml Ditim"ang "a # rhodamin dengan se sama se"an%a 1.1 mg mengg#na an nera'a analiti . Ser"# dit#ang an e dalam gelas Bea er dan dilar#t an dengan &1 mL A<#ades mengg#na an pengad# dimas# hingga lar#t semp#rna. Lar#tan terse"#t an e dalam la"# ta ar .1 mL dan ditam"ah an dengan A<#ades hingga

"atas tanda. Didapat an lar#tan 3 mg=mL mer#pa an Ba # Ahodamine dan di"eri la"el Stok R . ". Pem"#atan seri lar#tan Ba # Ahodamine Lar#tan Stok R diam"il 1*1 > &*1 > 3*1 > /*1 dan .*1 mL mengg#na an pipet gondo . Masing ? masing dimas# R1 #nt# an e dalam la"# ta ar &. mL "er"eda. Ditam"ah an onsentrasi 1*&/ mg=mL > R3 #nt# onsentrasi A<#ades hingga "atas tanda pada masing!masing la"# ta ar terse"#t lal# di"eri la"el onsentrasi 1*1& mg=mL > R2 #nt# onsentrasi 1*30 mg=mL > R4 #nt# 1*01 mg=mL pada la"# ta ar. onsentrasi 1*/@ mg=mL dan R5 #nt#

/. Pen%iapan -ase Diam Plat sili'a gel 01 ,-&./ "eralas al#m#ni#m dipanas an pada o2en selama 11 menit #nt# mem"# a pori pori pada sili'a dan menghilang an adar air. Plat sili a di el#ar an dan siap #nt# dig#na an. .. Optimasi Komposisi -ase ,era Plat sili'a gel 01 ,-&./ "eralas al#m#ni#m disiap an dan dileta an di"a$ah lamp# BC&./ nm dan lamp# BC30. nm. Plat sili'a gel 01 ,-&./ "eralas al#m#ni#m %ang "ersih em#dian dipanas an pada o2en selama 11 menit #nt# mem"# a pori!pori pada sili'a dan menghilang an adar air. Plat sili a di el#ar an dan siap #nt# dig#na an. Pada Plat KLT Sili a ,el ,-&./ dila # an empat penotolan+ sampel ind# m#rni "er$arna merah* sampel ind# m#rni "er$arna #ning* "a # rhodamin (lar#tan sto A) dan "a # tartra:in (lar#tan sto T). Dila # an pem"#atan fase gera dengan omposisi n!"#tanol ? metil etil eton ? N;/O; ? ;&O (.+ 3 + 1 + 1 ) dalam 111 mL #nt# 1 chamber dan dila # an penDen#han chamber. Mas# an plat e dalam chamber "er# #ran &1 E &1 %ang diDen#h an oleh #ap fase gera . ;asil penotolan diel#si an* sehingga didapat an Dara el#si %ang ter"ai . Plat di el#ar an dari chamber dan di"iar an mengering pada s#h# r#ang selama . menit. Dilihat hasil el#si dari penotolan. Dipasti an Dara el#si %ang ditemp#h telah men#nD# dalam pemisahan(tida an pemisahan %ang "ai . Apa"ila Dara el#si s#dah '# #p "ai menim"#l an "e"erapa "er'a di titi %ang sama)* "erarti

omposisi fase gera s#dah dapat dig#na an. 0. Optimasi panDang gelom"ang ma simal Tartra:in dan Ahodamin Lar#tan Stok T dan Stok R ditotol an mengg#na an Linomat dengan 3E repetisi #nt# tiap sen%a$a dalam plat KLT Sili a ,el ,-&./ %ang sama. Plat KLT %ang telah ditotol an oleh sto terse"#t* dimas# an dalam TL6 s'anner dan di"a'a panDang gelom"ang ma simal #nt# Tartra:ine dan D#ga Ahodamin

4. Calidasi Metode Peng# #ran Kadar Se"enarn%a dengan penam"ahan Standar Adisi Dila # an peng# #ran pada masing!masing sampel+ Sampel Ind# "lang o (tanpa penam"ahan) Sampel Ind# A 1 mL (adisi 1 mL Sto T F 1 mL Sto A) Sampel Ind# A & mL (adisi & mL Sto T F & mL Sto A) Sample Ind# A 3 mL (adisi 3 mL Sto T F 3 mL Sto A) Sampel Ind# A / mL (adisi / mL Sto T F / mL Sto A) Sample Ind# A . mL (adisi . mL Sto T F . mL Sto A) Ditotol an eenam sampel terse"#t pada plat KLT. Dila # an pem"#atan fase gera dengan omposisi n!"#tanol ? Metil Etil Keton ? N;/O; ? ;&O (.+ 3 + 1 + 1 ) dalam 111 mL #nt# 1 chamber dan dila # an penDen#han chamber. Mas# an plat e dalam chamber %ang diDen#h an oleh #ap fase gera . ;asil penotolan diel#si an. Plat KLT di el#ar an dari chamber dan di ering an selama . menit. Plat KLT %ang s#dah ering dis'an mengg#na an TLC Scanner dengan panDang gelom"ang %ang telah dioptimasi pada lang ah se"el#mn%a. Setelah didapat an romatrogram* dapat ditent# an AB6 (Area Under Curve). Didapat an & #r2a ( #r2a adisi dari rhodamin dan #r2a adisi tartra:in). Pada ed#a grafi di"#at h#"#ngan antara respon analit (AB6) 2s onsentrasi. Dari garis linier %ang ter"ent# * diperpanDang hingga memotong s#m"# 8. Slope %ang didapat am dari garis linier rhodamin dan tartra:in* di"anding an dengan slope pada masing!masing #r2a "a # dari rhodamin dan tartra:in. Apa"ila tida "er"eda signifi an ma a garis %ang memotong s#m"# 8 adalah adar se"enarn%a. Apa"ila "er"eda e dalam persamaan #r2a signifi an ma a setiap titi n%a nilai AB6 dis#"stit#si masing!masing. Nilai G re'o2er% dapat di# #r dengan +

ali"rasi. Dimana a #rasi dari rhodamin dan tartra:in didapat an dari nilai G re'o2er%

G re'o2er% H

ata#

A1H Nilai onsentrasi sampel dari masing masing titi penotolan. (6 total)

A& H Nilai onsentrasi sampel dari masing masing titi penotolan* %ang di s#"sit#si an e dalam persamaan #r2a ali"rasi (6 total hasil s#"sit#si e dalam persamaan #r2a ali"rasi). B1H nilai pada s#m"# E hasil perpanDangan garis linier B&H nilai E ( adar se"enarn%a) hasil dari AB6 %ang dis#"stit#si an e dalam persamaan #r2a ali"rasi 6H Konsentrasi teoritis dari "a # %ang dig#na an @. Penent#an Parameter 2alidasi Linieritas Linieritas didapat an dari persamaan #r2a "a #* #r2a "a # di"#at dengan 'ara pem"#atan seri onsentrasi "a #. Di"#at & #r2a "a #+ Pem"#atan #r2a "a # rhodamin> di"#at . seri onsentrasi 1.1& mg=mL> 1.&/ mg=mL> 1./@ mg=mL> 1.01 mg=mL dan pem"#atan #r2a "a # Tartra:in dengan seri onsentrasi %ang sama. Dilihat AB6 pada masing!masing peng# #ran. Di"#at #r2a I (respon) 2s 8 ( onsentrasi). Di"#at persamaan regresi linier %H"EFa* dimana> " adalah slope dan a adalah intersep. Didapat an D#ga nilai r ( oefisien orelasi). (r %ang "ai H 1*JJJJ) Sensitivitas (LOD, LOQ, Slope) a. Sensitivitas dilihat dari nilai LOD LOD (limit of detection) ata# "atas dete si diarti an se"agai %ang men#nD# onsentrasi analit terendah %ang masih dapat didete si* dimana LOD mer#pa an "an%a n%a sampel an respon (S) 3 ali terhadap noise (N) ata# LOD H 3 E SD=N

. Sensitivitas dilihat dari nilai LOQ LOK (limit of quantification) ata# "atas #antifi asi diarti an se"agai analit terendah dalam sampel %ang dapat ditent# an dengan presisi a #rasi %ang dapat diterima pada ondisi operasional metode %ang dig#ana an. LOK D#ga memili i rasio signal to noise 11+1* sehingga LOK H 11 E SD=N

!. Sensitivitas dilihat dari nilai Slope Slope didapat an dari masing!masing #r2a "a # (rhodamin dan tartra:in) dan #r2a adisi. Slope pada #r2a "a # didapat dari nilai " pada persamaan garis linier %H"EFa> slope pada #r2a adisi didapat dari persamaan garis %H"E F a> dilihat dari nilai " n%a. Slope %ang "ai apa"ila nilain%a L 1*4. "resisi (dilak#kan 3$ peni% an&an) Sampel ind# m#rni "er$arna #ning dihomogen an lal# ditim"ang se"an%a 3 gram dan dila # an repli asi se"an%a 3E. Sampel ind# m#rni "er$arna merah an e dalam TL6 dihomogen an lal# ditim"ang se"an%a 3 gram dan dila # an repli asi se"an%a 3E. Ditotol an pada plat KLT (0 penotolan)* tanpa diel#si an. Dimas# s'anner dan di"a'a nilai AB6 n%a. Nilai AB6 dimas# an e dalam persamaan #r2a

"a # se"agai nilai % (respon) sehingga didapat an nilai E ( onsentrasi). Dihit#ng presisin%a %ang dilihat dari nilai SD dari nilai E dan ASD. ASDH 111G E SD = rata!rata nilai 8. ASD di ata an memili i presisi %ang "ag#s har#s mas# dalam isaran antara 1! &G (sen%a$a a tif dalam D#mlah %ang "an%a ) ata# .!1.G (sen%a$a %ang adarn%a han%a sedi it)