TRIA WULAN (G8410075) IFROH JATIDIRI MEDIA (G84100077) KELOMPOK 2

1. a.Nama dan grupnya Berdasarkan dari sekuens yang diberi, telah diketahui bahwa sekuens tersebut berasal dari sekuens Oryza sativa (japonica cultivar-group) bZIP transcription factor (aba1) mRNA, complete cds yang berasal dari tanaman padi-padian. Urutan sekuens ini dapat diketahui dari database NCBI kemudian buka BLASTN. Dari hasil perbandingan dapat diketahui bahwa Oryza sativa (japonica cultivar-group) bZIP transcription factor (aba1) mRNA, complete cds memiliki kehomologian yang cukup tinggi hingga mencapai 100% dan bits score yang paling tinggi diantara sekuenssekuens lain dari database (Gambar 1). Sehingga dapat dipercaya bahwa sekuens yang kita miliki cocok dengan sekuens Oryza sativa (japonica cultivar-group) bZIP transcription factor (aba1) mRNA, complete cds.

Gambar 1 Hasil perbandingan sekuens dengan menggunakan NBLAST

TRIA WULAN (G8410075) IFROH JATIDIRI MEDIA (G84100077) KELOMPOK 2

b. Open Reading Frame (ORF) Untuk menentukan ORF, dapat digunakan web GeneMark untuk mengetahui posisi exon yang terdapat pada sekuens tersebut. Buka web

http://exon.gatech.edu/eukhmm.cgi kemudian pindahkan urutan sekuens yang kita miliki kemudian akan menghasilkan data seperti dibawah ini

Gambar 2 Hasil data yang diperoleh dari GeneMark Berdasarkan hasil yang diperoleh adri GeneMark, Exon dengan strand + dengan tipe Single. Rentang exon yang dimiliki Oryza sativa (japonica cultivargroup) bZIP transcription factor (aba1) mRNA, complete cds pada urutan nukleotida nomor 61 sampai 100 serta memiliki panjang ekson 990 bp. Oryza sativa (japonica cultivar-group) bZIP transcription factor (aba1) mRNA, complete cds memiliki 329 asam amino serta memiliki Start/End Frame pada 1 3. c. Temukan motif dan domain

Gambar 3 Hasil pencarian domain dengan web PROSITE

TRIA WULAN (G8410075) IFROH JATIDIRI MEDIA (G84100077) KELOMPOK 2

Penentuan motif dan domain pada urutan sekuens yang dimiliki digunakan web PROSITE. Untuk Glycine-rich region (domain PS50315) berasa pada urutan nomor 1-1083, untuk Alanine-rich region (domain PS 50310) berada pada urutan 3148 dan 650-1248, untuk Threonin-rich region (domain PS50325) berada pada urutan 13-124 dan 373-1207, dan untuk Cysteine-rich region (domain PS50311) berada pada urutan 33-1209. Serta memiliki domain lain seperti (PS00197) 2Fe-2S ferredoxintype iron-sulfur binding region, (PS00198) 4Fe-4S ferredoxin-type iron-sulfur

binding region, (PS00243) Integrins beta chain cysteine-rich domain, (PS01208) VWFC domain, (PS00022) EGF-like domain, dan (PS00008) myristoylation site. MYRISTYL N-

2. Desain primer dengan manual dari Triticum aestivum glutamine-dependent asparagine synthetase (ASN1) mRNA, complete cds
TGTTGCCGTCGATCCAGGAAAATGTGCGGCATACTGGCGGTGCTGGGCTGCGCTGATGACACCCAAGGGAAGA GAGTGCGCGTGCTTGAGCTCTCGCGCAGGCTCAAGCACCGCGGCCCCGACTGGAGCGGCATGCACCAGGTTGG CGACTGCTACCTCTCCCACCAGCGCCTCGCCATCATCGACCCTGCCTCTGGCGACCAGCCGCTCTACAACGAG GACAAGTCCATCGTCGTCACAGTGAATGGAGAGATCTACAACCATGAACAGCTCCGGGCGCAGCTCTCCTCCC ACACGTTCAGGACAGGCAGCGACTGCGAGGTCATCGCACACCTGTACGAGGAGCATGGGGAGAACTTCATCGA CATGCTGGATGGTGTCTTCTCCTTCGTCTTGCTCGATACACGCGACAACAGCTTCATTGCTGCACGTGATGCC ATTGGCGTCACACCCCTCTATATTGGCTGGGGAATTGATGGGTCGGTGTGGATATCATCAGAGATGAAGGGCC TGAATGATGATTGTGAGCACTTTGAGATCTTTCCTCCTGGCCATCTCTACTCCAGCAAGCAGGGAGGCTTCAA GAGATGGTACAACCCACCTTGGTTCTCCGAGGTCATTCCTTCAGTGCCATATGACCCACTTGCTCTCAGGAAG GCTTTCGAAAAGGCTGTCGTCAAGAGGCTTATGACGGACGTTCCATTCGGTGTTCTACTCTCTGGTGGCCTTG ACTCATCATTGGTTGCAGCCGTTACAGTTCGCCACCTGGCAGGAACAAAGGCTGCAAAGCGCTGGGGGACTAA GCTTCACTCTTTTTGTGTCGGACTTGAGGGGTCACCTGATCTGAAGGCTGCAAAGGAGGTAGCCAATTACCTG GGCACCATGCACCATGAGTTCACCTTCACTGTTCAGGACGGCATTGATGCAATTGAGGATGTGATTTATCACA CCGAAACATATGATGTGACGACAATCAGGGCAAGCACGCCAATGTTCCTGATGTCACGCAAGATCAAGTCACT TGGGGTCAAGATGGTCATCTCTGGTGAGGGCTCCGATGAGATTTTCGGAGGGTACCTCTACTTCCACAAGGCA CCCAACAAAGAGGAGCTCCACCGTGAGACATGTCAAAAGATCAAAGCTCTGCATCAGTACGATTGCTTGAGGG CCAACAAGGCAACATCTGCATGGGGCCTCGAAGCACGTGTGCCATTCTTGGACAAGGAGTTTATCAATGAGGC AATGAGCATTGATCCTGAGTGGAAGATGATCCGGCCTGATCTTGGAAGAATTGAGAAATGGGTGCTGAGGAAA GCATTTGATGACGAGGAGCAACCATTCCTGCCGAAGCATATTCTGTACAGGCAGAAAGAGCAGTTCAGTGATG GTGTTGGCTACAGCTGGATTGATGGCCTAAAGGCTCACGCAGAATCGAATGTGACAGATAAGATGATGTCAAA TGCAAAGTTCATCTACCCACACAACACCCCGACTACAAAAGAGGCCTACTGTTACAGGATGATATTTGAGAGG TTCTTCCCCCAGAACTCGGCGATCCTGACGGTGCCAGGTGGGCCAAGCGTTGCATGCAGCACGGCGAAGGCGG

TRIA WULAN (G8410075) IFROH JATIDIRI MEDIA (G84100077) KELOMPOK 2

TAGAGTGGGATGCCCAGTGGTCAGGGAACCTGGATCCCTCAGGGAGAGCAGCACTTGGAGTCCATCTCTCGGC CTATGAACAGGAGCATCTCCCAGCAACCATCATGGCAGGAACCAGCAAGAAGCCGAGGATGATCGAGGTTGCG GCGCCTGGTGTCGCAATTGAGAGTTGATGGTGTCCTGTCCTGCTTGCCAATCTCTAGAGGATT

Berdasarkan sekuen tersebut, pertama-tama dilakukan primer design secara manual yang diawali dengan penentuan primer forward dan reverse dari sekuen ORF tersebut secara acak sehingga dapat dilakukan analisis secara manualnya. Berdasarkan pemilihan acak dari sekuen gen tersebut maka didapatkan sekuen primer forward (diberi tanda kuning) dan sekuen primer reverse (diberi tanda merah). Pemilihan primer diusahakan tidak saling berkomplementer agar tidak self-annealing, tidak memiliki basa T pada ujung 3, memiliki %GC diatas 50%. Selanjutnya dilakukan analisis terhadap sepasang primer tersebut. Primer Forward Primer reverse : GCCAAGCGTTGCATGCAGCA : CCCTCAGGGAGAGCAGCAC

Perhitungan: Primer forward Tm = 4(G+C) + 2(A+T) = 4(6+6) + 2(5+3) = 64 C %GC = =12/20 x 100% = 60%
o

Primer reverse Tm = 4(G+C) + 2(A+T) = 4(5+7) + 2(5+1) = 68oC %GC = =12/18 x 100%= 66.67%

Sedangkan dengan menggunakan primer3, diperoleh left dan right primer dan product size sbesar 248 nukleotida:
Using 1-based sequence positions OLIGO start len tm LEFT PRIMER 223 20 59.04 RIGHT PRIMER 470 20 59.00 SEQUENCE SIZE: 1815 INCLUDED REGION SIZE: 1815 gc% 50.00 60.00 any_th 0.00 7.74 3'_th hairpin seq 0.00 0.00 AAGTCCATCGTCGTCACAGT 7.74 0.00 CCCCAGCCAATATAGAGGGG

PRODUCT SIZE: 248, PAIR ANY_TH COMPL: 0.00, PAIR 3'_TH COMPL: 0.00

Kemudian dijalankan dengan program GeneRunner,

TRIA WULAN (G8410075) IFROH JATIDIRI MEDIA (G84100077) KELOMPOK 2

Primer

tersbut merupakan primer yang baik karena memiliki Tm 60.8 (tidak

melebihi 70) dan % GC 68.2 selain itu Primer forward nya tidak membentuk dimer. Primer reverse memiliki Tm 67.9C, %GC 60%, memiliki hairloops 12 pada suhu 79.1C. Pada kedua metode diketahui bahwa dengan kedua cara penentuan primer cukup baik asalkan tiap primer memenuhi syarat primer yang baik digunakan untuk proses PCR.