PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI MIKROORGANISME PERAIRAN RAWA INDRALAYA SUMATERA SELATAN1

(Purification and !aract"ri#ation a Prot"a$" fro% Microor&ani$% I$o'at"d fro% Indra'a(a S)a%* Sout! Su%at"ra+

Oleh: Ace Baehaki2), Rinto2)

A,STRAK Tujuan penelitan ini adalah untuk melakukan purifikasi dan karakterisasi protease dari bakteri perairan rawa Indrala a! Isolat A"#$ dipilih karena memiliki akti%itas protease tertin&&i! 'asil purifikasi den&an kolom &el sephade( )*+,, menunjukkan penin&katan derajat kemurnian en-im protease bakteri isolat A"#$! .ntuk fraksi / terjadi penin&katan kemurnian menjadi $,$ kali, untuk fraksi +, terjadi penin&katan kemurnian menjadi $,0, sedan&kan fraksi 1" derajat kemurniann a $,/! 2rotease ini mempun ai p' optimum 0 dan suhu optimum sekitar /, o3, Inhibitor ion lo&am an& kuat terhadap protease dari bakteri A"#$ adalah 4e25 6+ m7), 85 dan 9n25 dan dapat dihambat oleh :;TA! Analisis #;#*2A): dan -imo&ram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A"#$ memiliki 2 pita den&an berat molekul +," k; dan +2+ k;! 8ata 8unci: 2urifikasi, 8arakterisasi, 2rotease, Rawa Indrala a

+)

7akalah pada #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, 2) 2ro&ram #tudi Teknolo&i 'asil 2erikanan, 4akultas 2ertanian .ni%ersitas #riwija a =l! 2alemban&*2rabumulih 8m$2 Indarala a O&an Ilir #umatera #elatan, :*mail: ace?"@noneA ahoo!com #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, +

A,STRA T

The purpose of the research was to stud

the purification and characteri-ation of

e(tracellular protease produced from microor&anism isolated from Indrala a #wamp #outh #umatera! The A"#$ isolate was selected due to its hi&h protease acti%it The was purified in sephade( )*+,, &el permeation chromato&raph showed that increased de&ree of purified this en- me! The fraction /, +, and 1" were purified $,$B $,0 and $,/ fold, respecti%el ! The optimum p' and temperature of proteases from A"#$ were 0 and /,,3, respecti%el ! :ffect of metal ions, 4e25, 85 and 9n25 showed stron& inhibited protease A"#$! :ffect of specific inhibitor 6:;TA) showed :;TA inhibited protease A"#$! 7oleculer wei&hts were determinited b usin& #;#*2A): and - mo&ram

techniCue! 7oleculer wei&ht protease isolate A"#$ was +," k; and +2, k;!

K"()ord$- Purification. !aract"ri#ation. Prot"a$". Indra'a(a S)a%*

PENDA/ULUAN

2rotease adalah en-im

an& men&katalisasi pemecahan ikatan peptida dalam

peptida, polipeptida dan protein den&an men&&unakan reaksi hidrolisis menjadi molekul an& lebih sederhana seperti peptida rantai pendek dan asam amino 6<aiola dan Did astuti 2,,2)! 2rotease merupakan kelompok en-im*en-im an& kompleks an& menduduki posisi sentral dalam aplikasin a pada bidan& fisiolo&is dan produk*produk komersial! 2rotease ekstraseluler seba&ian besar berperan dalam hidrolisis substrat 2

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

polipetida besar! :n-im proteolitik intraseluler memainkan peran pentin& dalam metabolisme dan proses re&ulasi pada sel hewan, tumbuhan dan mikroor&anisme, seperti men&&anti protein, memelihara kesetimban&an antara de&radasi dan sintesis protein! 2rotease intraseluler ju&a berperan dalam fun&si fisiolo&is lainn a seperti pencernaan, maturasi hormon, perakitan %irus, respon imun, inflamasi, fertilisasi, koa&ulasi darah, fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi, &erminasi dan pato&enesis 6Rao et al +>0>)! 2rotease ju&a diimplikasikan dalam peran re&ulasi ekspresi &en, perbaikan ;<A dan sintesis ;<A 68alis- +>00)! 2rotease merupakan en-im pentin& an& di&unakan secara luas pada aplikasi industri melalui reaksi sintesis dan reaksi is, an& hampir mencapai "/E dari total penjualan ena-im di dunia 6'uan& 2,,")! 2rotease di&unakan pada beberapa aplikasi industri seperti deter&en, farmasi, produk*produk kulit, pen&empukan da&in&, hidrolisat protein, produk*produk makanan dan proses pen&olahan limbah industri! #alah satu sumber en-im protease adalah dari mikroba! 2emilihan mikroba seba&ai sumber en-im mempun ai keuntun&an bila dibandin&kan den&an an& diisolasi dari tanaman ataupun hewan! Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih mudah ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah ditin&katkan bila dikhendaki produksi an& lebih besar, bia a produksin a relatif rendah, kondisi selama produksi tidak ter&antun& oleh adan a per&antian musim dan waktu an& dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek 67e rath dan Fol%asek +>?/ dalam 2akpahan 2,,>)! 2enelitian mikroba seba&ai sumber alami pen&hasil en-im ini sudah ban ak dilakukan akan tetapi penelitian mikroba den&an habitat tertentu seperti dari rawa masih sedikit! #ehin&&a penelitian en-im protease dari mikroba rawa pentin& untuk dilakukan seba&ai alternatif baru seba&ai sumber pen&hasil en-im men&in&at daerah #umatera #elatan termasuk daerah Indrala a memiliki daerah rawa an& san&at luas an& #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, $

tentun a terdapat mikroba an& memiliki keanekara&aman protease ini!

an& tin&&i seba&ai pen&hasil

METODE PENELITIAN 7etode penelitian an& dilakukan terdiri dari beberapa tahap meliputi : produksi protease ekstrak kasar, purifikasi den&an kromato&rafi filtrasi &el dan karakterisasi terhadap protease ekstrak kasar!

Produ0$i Prot"a$" E0$tra0 Ka$ar 7ikroba diinokulasi seban ak +*2 lup pada media Luria Broth 6GB) den&an komposisi tripton +E, <a3l +E dan yeast extract ,,/E! 2roses diawali den&an

penentuan umur prekultur 6dalam media GB) an& tepat untuk keperluan produksi en-im! 2en&amatan dilakukan den&an men&ukur optical density 6O;) sampai nilai O; H ,,0 pada I H "2, nm! 7edia GB an& sudah mempun ai O; H ,,0 diambil +,E kemudian ditambahkan pada media GB an& baru seba&ai media untuk memproduksi protease! 2ada media GB ini diukur nilai O;, akti%itas protease dan kadar protein setiap 0 jam selama /" jam! .ntuk memisahkan sel dilakukan sentrifu&asi den&an kecepatan $,,, rpm selama +/ menit pada suhu 1 ,3!

P"n&u0uran A0ti1ita$ Prot"a$" dan Kadar Prot"in Akti%itas protease diukur den&an metode Ber&me er 6+>0$) den&an

men&&unakan substrat kasein 'ammerstein 2E 6bJ%)!

#atu unit akti%itas protease

didefinisikan seba&ai jumlah en-im an& dapat men&hasilkan satu Kmol produk tirosin per menit pada kondisi pen&ukuran! 8adar protein ditentukan den&an metode Bradford 6+>?") men&&unakan Bo%ine #erum Albumin 4raction F seba&ai standar protein! #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, 1

Purifi0a$i Prot"a$" 2urifikasi dilakukan den&an men&&unakan kromato&rafi filtrasi &el men&&unakan #ephade( )*+,,! #ebelum dilakukan pemurnian terlebih dahulu dilakukan pen&endapan den&an amonium sulfat teknis den&an konsentrasi amonium sulfat 2,*>,E dilanjutkan den&an dialisis men&&unakan kanton& dialisis cut*off +, k; 6#i&ma)! #eban ak ,,?/ &ram #ephade( )*+,, 6#i&ma) dibasahkan den&an ?/ ml air bebas ion kemudian dipanaskan >,,3 sambil diaduk perlahan selama >, menit dan dibiarkan sampai din&in, kemudian simpan dalam ruan&an 1,3 semalam! Garutan didekantasi lalu supernatan di&anti den&an buffer Tris*'3l ,,+ 7 p' 0 sambil diaduk perlahan! Garutan protease seban ak + ml dimasukan den&an pipet secara perlahan ke dalam kolom tepat di atas permukaan &el! 8olom diisi den&an pen&elusi aitu buffer Tris*'3l +, m7 p' 0! ;iambil setiap fraksi masin&*masin& ?, 62 ml) tetes ditampun& dalam fraction collector 6Redifrac, 2harmacia*Biotech)! an&

Kara0t"ri$a$i *rot"a$" .ji karakterisasi protease an& meliputi pen&aruh p' 6",/B ?B ?,/B 0B 0,/B >) men&&unakan buffer Tris*'3l, suhu 6$, ,3, 1, ,3, /, ,3, ", ,3, ?, ,3), ion lo&am 685, 7n25, 9n25 dan 4e25) dan inhibitor spesifik 6:;TA)! 8onsentrasi ion lo&am dan inhibitor spesifik an& di&unakan masin&*masin& adalah + m7 dan / m7!

SDS PAGE dan 2i%o&ra% 2enentuan berat molekul dilakukan men&&unakan #;# 2A): 6Gaemmli +>?,)! #edan&kan -imo&ram men&&unakan modifikasi metode 3hoi et al, 62,,+)! )el akrilamid 0E dikopolimerisasi den&an substrat kasein 2E! #etelah &el dilakukan elektroforesis, &el #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, /

direndam den&an Triton L*+,, 2,/E selama + jam dan dilakukan inkubasi dalam buffer Tris*3l +, m7, p' 0 selama 21 jam! 2ewarnaan den&an silver staining aitu : &el direndam dalam larutan fikasasi 62/E metanol dan +2E asam asetat) selama + jam kemudian direndam dalam /,E etanol selama 2, menit, kemudian di&anti den&an $,E etanol selama 2 ( 2, menit, larutann a di&anti den&an enhancer kemudian dicuci den&an akuadestilata, setelah dicuci ditambahkan larutan sil%er nitrat selama $, menit kemudian dicuci la&i den&an akuadestilata 2 ( 2, detik dan ditambahkan larutan campuran <a23O$ dan formaldehida dan terakhir den&an larutan fiksasi!

/ASIL DAN PEM,A/ASAN Produ0$i *rot"a$" "0$tra0 0a$ar Isolat an& di&unakan untuk produksi protease ekstrak kasar dan selanjutn a

dilakukan pemurnian adalah isolat dari A"#$! 2emilihan isolat ini berdasarkan hasil penelitian sebelumn a aitu memiliki akti%itas protease tertin&&i dibandin&kan den&an isolat lainn a! 2roduksi protease dilakukan den&an cara bakteri isolat A"#$ diinokulasi seban ak +*2 lup pada media Luria Bertani Broth 6GB) den&an komposisi tripton +E, <a3l +E, yeast extract ,,/E dan skim milk 2roses diawali den&an penentuan umur prekultur

6dalam media GB) an& tepat untuk keperluan produksi en-im! 2en&amatan dilakukan den&an men&ukur optical density 6O;) sampai nilai O; H ,,0 pada I H "2, nm! 7edia GB an& sudah mempun ai O; H ,,0 diambil +,E kemudian ditambahkan pada media GB an& baru seba&ai media untuk memproduksi protease! 7edia an& baru seban ak $ liter selanjutn a diinkubasi selama 10 jam 6waktu optimum produksi protease isolat A"#$)! .ntuk memisahkan sel dilakukan sentrifu&asi den&an kecepatan $,,, rpm selama +/ menit pada suhu 1 ,3! ;en&an teknik ini, sel akan men&endap oleh adan a &a a #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, "

&ra%itasi sedan&kan en-im tetap terdapat pada supernatan! #entrifu&asi dilakukan pada suhu rendah untuk mence&ah terjadin a kerusakan struktur en-im, selanjutn a dilakukan pen&ujian akti%itas protease!

P"n&"nda*an d"n&an a%%oniu% $u'fat dan dia'i$i$ 2en&endapan protease dilakukan bertujuan untuk men&endapkan protein protease! 2en&endapan dilakukan den&an men&&unakan ammonium sulfat den&an beberapa perlakuan aitu 2,E, $,E, 1,E, /,E, ",E, ?,E, 0,E dan >,E! 2enambahan

ammonium sulfat dilakukan secara perlahan*lahan sambil larutan en-im distirer pada kondisi suhu 1 ,3! #elanjutn a didiamkan semalam dan dilakukan sentrifu&asi! :ndapan dan filtrat masin&*masin& perlakuan diuji akti%itasn a! Akti%itas tertin&&i pada endapan dan akti%itas terendah pada filtrat an& selanjutn a dipilih! 'asil pen&endapan dapat dilihat pada )ambar +!

Aktivitas protease (U/ml)

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 20 30 40 50

Endapan

60

70
Filtrat

80

90

% pengendapan

)ambar +! 2en&endapan den&an ammonium sulfat 4i&ure +! Ammonium sulfate precipitation

'asil pen&endapan den&an ammonium sulfat menunjukkan akti%itas protease tertin&&i pada endapan adalah den&an pen&endapan ammonium sulfat ?,E! #edan&kan #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, ?

akti%itas terendah pada filtrat adalah ",E, akan tetapi pada filtrat ?,E memiliki akti%itas an& rendah sehin&&a pen&endapan selanjutn a adalah den&an ammonium sulfat ?,E! 'asil pen&endapan ammonium sulfat ?,E selanjutn a dilakukan dialisis den&an men&&unakan kanton& dialisis untuk men&hilan&kan &aram*&aram ammonium sulfat!

Purifi0a$i d"n&an 0ro%ato&rafi 0o'o% S"*!ad"3 G4155 2urifikasi atau pemurnian protease isolat A"#$ den&an kromato&rafi filtrasi &el men&&unakan #ephade( )*+,, seba&ai matriks, dan bufer Tris*'3l ,,,/ 7, p' 0 seba&ai pen&elusin a! #ebelum dilakukan pemurnian den&an kromato&rafi &el, terlebih dahulu dilakukan pen&endapan amonium sulfat ?,E an& dilanjutkan den&an dialisis! #etiap fraksi an& keluar dari kolom diukur akti%itas protease dan kadar protein, hasil tertera pada )ambar 2! 'asil kromato&rafi menunjukkan terdapat $ 6ti&a) puncak fraksi an& memiliki akti%itas tertin&&i aitu fraksi ", +, dan 1"!

0,35 Absorbansi 280 nm dan Aktivitas Protease(Unit/ml) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 50 100 Nomor Fraksi
Protein Aktivitas Protease

150

200

)ambar 2! 8romato&ram protease isolat A"#$ den&an #ephade( )*+,, #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, 0

4i&ure 2! 8romato&ram of isolate A"#$ protease with #ephade(*)*+,,

'asil purifikasi protease bakteri isolat A"#$ dilakukan den&an kolom #ephade( )*+,, tertera pada Tabel +! ;ibandin&kan den&an crude protease hasil ekstraksi den&an ammonium sulfat terjadi penin&katan derajat kemurnian en-im den&an kromato&rafi kolom ini! .ntuk fraksi / terjadi penin&katan kemurnian menjadi $,$ kali, untuk fraksi +, terjadi penin&katan kemurnian menjadi $,0, sedan&kan fraksi 1" derajat kemurniann a $,/!

Tabel +! Tahapan purifikasi protease isolat A"#$ Table +! 2urification steps of isolate A"#$ protease
Tahapan pemurnian 2en&endapa n 6<'1)2#O1 Akti%itas 8adar Folume Total Total Akti%itas 6ml) 2rotease protein akti%itas protein spesifik 6I.Jml) 6m&) 6I.) 6m&) 6I.Jm&) ,,,2"+ ,,+1 +",, 1+,?" 221 ,,+0" ;erajat kemurnian relatif +

#ephade( )* +,, 4raksi / ,,,+"> 4raksi +, ,,,22 4raksi 1" ,,,,0"

,,,2?$ ,,,$," ,,,+$

$ $ $

,,,/,? ,,,"" ,,,2/0

,,,0+> ,,,>+0 ,,,$>

,,"+> ,,?+> ,,""2

$,$ $,0 $,/

2rotease an& telah dimurnikan den&an filtrasi &el men&&unakan #ephade( )*+,, mempun ai akti%itas spesifik dan tin&kat kemurnian sebelumn a! an& lebih tin&&i dari tahap

;en&an demikian dapat disimpulkan bahwa #ephade( )*+,, dapat an& dikhendaki aitu en-im dari sen awa*

di&unakan untuk memisahkan protein

sen awa lain seba&ai pen&otor! :kstrak kasar protein tercampur den&an asam nukleat, karbohidrat dan &aram or&anik! Go&am berat dan asam nukleat biasan a men&&an&&u

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

>

kerja en-im, sehin&&a dapat men&hilan&kan kontaminan tersebut terjadi penin&katan akti%itas en-im 6'aris dan An&al +>0>)!

Kara0t"ri$a$i Prot"a$" "0$tra0 0a$ar Pengaruh pH 2erubahan p' pada skala de%iasi kecil dapat men ebabkan turunn a akti%itas en-im karena den&an perubahan ionisasi &u&us*&u&us fun&sioniln a! )u&us ionik berperan pentin& dalam menja&a konformasi sisi aktif en-im untuk men&ikat dan men&ubah substrat menjadi produk! 2ada perubahan skala de%iasi besar, perubahan p' akan men&akibatkan en-im men&alami denaturasi karena adan a &an&&uan terhadap berba&ai interaksi nonko%alen 6'ames dan 'opper 2,,,) an& menja&a kestabilan struktur ti&a dimensi en-im

Aktivitas Protease

0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 6.5 7 7.5 pH 8 8.5 9

)ambar $! 2en&aruh p' pada protease isolate A"#$ 4i&ure $! :ffect of p' on isolate A"#$ protease

p' san&at berpen&aruh terhadap akti%itas protease bakteri A"#$ 6)ambar $)! p' optimum akti%itas protease berkisar 0! 2rotease bakteri Pseudomonas aeruginosa #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, +,

memiliki p' an& sama den&an isolat A"#$ aitu pada p' 0 6Baehaki et al 2,,0)! #emakin jauh dari p' optimal en-im semakin tidak stabil sehin&&a akti%itasn a semakin rendah! 'al ini karena en-im merupakan protein an& tersusun atas asam amino, 2'

pen&aruh p' berhubun&an den&an sifat asam basa an& dimiliki oleh protein!

ekstrim dapat men ebabkan denaturasi protein en-im an& men&ubah susunan ruan& ti&a dimensi molekul protein en-im! 7enurut <a- 62,,2) perubahan keaktifan en-im akibat perubahan lin&kun&an men ebabkan terjadin a perubahan ionisasi en-im! Don& 6+>>/) menambahkan, p' ekstrim berpen&aruh terhadap struktur en-im dan muatan substrat! 8elebihan atau kekuran&an ion '5 men ebabkan perubahan konformasi sisi aktif en-im, sehin&&a substrat tidak la&i berikatan den&an en-im, selanjutn a berakibat pula pada pembentukan produk!

Pengaruh Suhu 2ada umumn a setiap en-im memiliki akti%itas maksimum pada suhu tertentu, akti%itas en-im akan semakin menin&kat den&an bertambahn a suhu sampai suhu optimum tercapai! #etelah itu kenaikan lebih lanjut akan men ebabkan akti%itas en-im menurun! 2en&aruh suhu terhadap akti%itas protease ekstrak kasar bakteri isolat air rawa terdapat pada )ambar 1!
Aktivitas Protease

0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 30 40 50 S ! 60 70

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

++

)ambar 1! 2en&aruh suhu pada protease isolate A"#$ 4i&ure 1! :ffect of temperature on isolate A"#$ protease ;ari hasil pen&ukuran akti%itas en-im pada berba&ai suhu, suhu optimum protease bakteri isolat A"#$ den&an suhu inkubasi /,,3! 2enelitian protease bakteri lain menujukkan bakteri an& berasal dari perairan memiliki suhu optimum an& cukup

tin&&i, aitu protease bakteri laut Alteromonas sp strain O? memiliki suhu optimum ", ,3 67i amoto et al 2,,2) dan protease Pseudoalteromonas sp strain 2>"*1? dari laut Artartik an& memiliki suhu optimum 1/ ,3 6Fa-Cue- et al 2,,0)! #uhu mempen&aruhi laju reaksi katalisis en-im den&an dua cara! 2ertama, kenaikan suhu akan menin&katkan ener&i molekul substrat dan pada akhirn a menin&katkan laju reaksi en-im! 2enin&katan suhu ju&a berpen&aruh terhadap perubahan konformasi substrat sehin&&a sisi aktif substrat men&alami hambatan untuk memasuki sisi aktif en-im dan men ebabkan turunn a akti%itas en-im! 8edua, penin&katan ener&i termal molekul an& membentuk struktur protein en-im itu sendiri akan men ebabkan rusakn a interaksi*interaksi non ko%alen 6ikatan hidro&en, ikatan %an der walls, ikatan hidrofobik dan interaksi elektrostatik) an& menja&a struktur $; en-im secara bersama*sama sehin&&a en-im

men&alami denaturasi! ;enaturasi men ebabkan struktur lipatan en-im membuka pada ba&ian permukaann a sehin&&a sisi aktif en-im berubah dan men&akibatkan terjadi penurunan akti%itas en-im 6'ames dan 'ooper 2,,,)!

Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik Beberapa en-im membutuhkan ion lo&am seba&ai kofaktor untuk mendukun& efisiensi katalitik en-im! Go&am tersebut membantu reaksi katalitik den&an cara men&ikat substrat pada sisi pemoton&an! #elain berperan dalam pen&ikatan en-im den&an substrat, beberapa lo&am ju&a dapat men&ikat en-im secara lan&sun& untuk menstabilkan #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, +2

konformasi aktifn a atau men&induksi formasi situs pen&ikatan atau situs aktif suatu en-im! )ambar " memperlihatkan pen&aruh ion lo&am terhadap akti%itas protease bakteri isolat A"#$!

0.600 aktivitas protease 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 aktivitas ja ke!48 Fe"l2 #"l $n"l2 %n"l2 1 5 $ $

)ambar /!

2en&aruh ion lo&am pada protease isolate A"#$

4i&ure /! :ffect metal ions on isolate A"#$ protease

Inhibitor ion lo&am an& kuat terhadap protease dari bakteri A"#$ adalah 4e 25, 85 dan 9n25 6)ambar /)! Adan a pen&hambatan ion lo&am terhadap akti%itas protease pada konsentrasi tertentu berkaitan den&an kekuatan ion, dimana kekuatan ion itu sendiri mempen&aruhi konformasi atau struktur ti&a dimensi dari protein en-im atau protein substrat 6#uhartono +>0>)! 2ada konsentrasi tertentu ion lo&am tertentu dapat bertindak seba&ai inhibitor, tetapi dapat ju&a bertindak seba&ai akti%ator pada konsentrasi lain 6Richardson dan ' slop +>0/)! Berdasarkan mekanisme reaksi an& dikatalisis, endopeptidase dapat

dikelompokkan menjadi empat aitu: protease serin, protease aspartat, protease sistein dan protease lo&am! ;alam penelitian ini pen&&olon&an protease hasil produksi dilakukan

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

+$

den&an cara mereaksikan den&an sen awa*sen awa inhibitor spesifik! Adapun pen&aruh inhibitor spesifik :;TA pada protease tanah rawa terdapat pada Tabel 2! Tabel 2! 2en&aruh inhibitor spesifik pada protease isolate A"#$ Table 2! :ffect specific inhibitor on isolate A"#$ protease Akti%itas residu 6E) :;TA + m7 / m7 +>," +0,>

=enis bakteri A"#$

Tabel 2 menunjukkan :;TA 6+m7 dan / m7) dapat men&hambat protease isolat A"#$ hal ini dimun&kinkan karena :;TA men&kelat lo&am*lo&am an& berperan pentin& menja&a stabilitas serta lo&am an& berperan seba&ai kofaktor en-im protease! 8arena protease ini dihambat oleh :;TA sehin&&a protease ini di&olon&kan seba&ai metaloprotease 6protease lo&am)! 2rotease bakteri lain dari perairan an& termasuk

metalloprotease adalah Alteromonas sp O*? 67i amoto et al 2,,2)!

P"n"ntuan 6"rat %o'"0u' d"n&an SDS PAGE dan 2i%o&ra% *rot"a$" "0$tra0 0a$ar

2enentuan berat molekul dilakukan den&an teknik #;#*2A): 6#odium dodesil sulfat*2oliakrilamida &el elektroforesis) dan 9imo&ram merupakan metode an& sudah di&unakan secara luas! 2ada penelitian ini ada dua macam &el an& di&unakan aitu &el penahan 6resolving gel) dan &el pemisah 6stacking gel) an& men&andun& akrilamid, #;#, A2# dan T:7:;! )el poliakrilamid diperoleh den&an cara polimerisasi akrilamid den&an sejumlah cross linking agent metilena bis akrilamid dan amonium persulfat 6A2#) seba&ai katalisator! Radikal bebas an& terbentuk dari pelarutan ammonium persulfat dalam air akan bereaksi den&an akrilamid membentuk akrilamid aktif an&

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

+1

dapat bereaksi satu sama lain membentuk polimer! 'asil #;#*2A): dan 9imo&ram protease isolat bakteri air rawa dapat dilihat pada )ambar "!

A"#$

A"#$
+2, k; +," k;

>? 8;a

"" 8;a

1/ 8;a

21 8;a

)ambar "! #;#*2A): dan 9imo&ram protease isolat A"#$ 67Hmarker) 4i&ure "! #;#*2A): and 9 mo&ram of isolate A"#$ protease 67Hmarker)

Analisis #;#*2A): pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A"#$ memiliki +2 pita den&an B7 sekitar antara +> k; sampai den&an +/$ k;! Analisis 9imo&ram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A"#$ memiliki 2 pita den&an B7 +," k; dan +2, k;! Bakteri T2#*2 an& diisolasi dari kawah

Tan&kupan 2erahu ju&a memiliki 2 pita den&an berat molekul 0, k; dan 1/ k; 6Dah untari et al 2,,,)!

KESIMPULAN

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

+/

'asil purifikasi den&an kolom &el sephade( )*+,, menunjukkan penin&katan derajat kemurnian en-im protease bakteri isolat A"#$! .ntuk fraksi / terjadi penin&katan kemurnian menjadi $,$ kali, untuk fraksi +, terjadi penin&katan kemurnian menjadi $,0, sedan&kan fraksi 1" derajat kemurniann a $,/! 2rotease ini mempun ai p' optimum 0, suhu optimum sekitar /, o3, Inhibitor ion lo&am an& kuat terhadap protease dari bakteri A"#$ adalah 4e25 6+ m7), 85 dan 9n25 dan dapat dihambat oleh :;TA! Analisis #;#* 2A): pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A"#$ memiliki +2 pita den&an B7 sekitar antara +> k; sampai den&an +/$ k;! Analisis 9imo&ram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A"#$ memiliki 2 pita den&an B7 +," k; dan +2, k;!

U APAN TERIMA KASI/ 2eneliti berterima kasih kepada ;irektorat =enderal 2endidikan Tin&&i ;epdiknas an& telah membia ai penelitian ini melalui pro&ram 'ibah Bersain& LFI tahun 2,,0!

DAFTAR PUSTAKA

Baehaki, A!, #uhartono, 7!T!, 2alupi, <!#! dan <urha ati, T! 2,,0! 2urifikasi dan karakterisasi protease dari bakteri pato&en Psudomonas aeruginosa! Jurnal Teknol dan Industri Pangan +>: 0,*0"! Ber&me er, '!.!, Ber&me er, =!, and )raMl, 7! +>0$! Methods of En ymatic Analysis! "ol #! Ferla& 3hemie!, Deinheim! Bradford, 7!7! +>?"! A rapid and sensiti%e methodfor Cuantitation of micro&ram Cuantities of protein utili-in& the principle of protein d e*bindin&! Anal Biochem ?2:2$1*2/1! 3hoi, <!#!, Noon, 8!#!, Gee, =!N!, 'an, 8!N!, and 8im, #!'! 2,,+! 3omparision of three substrates 6casein, fibrin, and &elatin) in -imo&raphic &el! J Biochim Mol Biol $1:/$+*/$"! #eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+, +"

'ames, B!;!, and 'ooper, <!7! 2,,,! #prin&er*Ferla&!, 'on&kon&!

Biochemistry$ The Instant %otes!

Ed!ke&#!

'arris, :!G!F!, #, An&al! +>0>! Protein Purification Methods!A Practical approach! IRG 2ress!, O(ford! 'uan&, )!, Nin&, T!, 'uo, 2!, and =ian&, =! 2,,"! 2urification and characteri-ation of a protease from thermophilic Bacillus strain '#,0! African Biotecnol /:21$$*21$0! 8alis-, '!8! +>00! 7icrobial proteinases! Adv Biochim Eng Biotechnol $"B +*"/! Gaemmli, .!8! +>?,! 3lea%a&e of structural protein durin& the assembl of the heat of bacteriopha& T1! %ature 22?:"0,*"0/! 7i amoto, 8!, Tsujibo, '!, <ukui, :!, Itoh, '!, 8aid-u, N!, and Inamori, N! 2,,2! Isolation and characteri-ation of the &enes encodin& two metalloproteases 67prI and 7prII) from a marine bacterium, Alteromonas sp! strain O*?! Biosci Biotecnol Biochem "":1+"*2+ <aiola, :!, dan Didh astuti, <! 2,,2! Isolasi, seleksi dan optimasi produksi protease dari beberapa isolat bakteri! 'ayati ":1"?*1?$! <a-, #! 2,,2! En ymes and (ood! O(ford .ni%ersit 2ress!, 2akistan! 2akpahan R! 2,,>! Isolasi bakteri dan uji akti%itas protease termofilik dari sumber air panas #ipoholon Tapanuli .tara #umatera .tara! Tesis! .ni%ersitas #umatera .tara! 7edan! Rao, 7!7!, Tanksale, A!7!, )at&e, 7!#!, and ;esphande, F!F! +>>0! 7olecular and biotechnolo&ical aspects of microbial proteases! Micro)iol And Mol Biol *ev "2:/>?*"$/! Richardson, T!, and ' slop, ;!B! +>0/! :n- me! In 4ennema, O!R 6:ds)! (ood +hemistry! 7ac 8erel Bekker, <ew Nork! #uhartono 7T! +>0>! En im dan Bioteknologi! 2usat Antar .ni%ersitas Bioteknolo&i I2B*;epdikbud! Bo&or! FO-Cue-, #!3!, 'ernOnde-, :!, and 3ormack, D!2!7! 2,,0! :(tracellular proteases from the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp! 2>"*1? strain! *evista Argentina Micro)iologia 1,:"$*?+! Dah untari, B!, #uhartono, 7!T!, and 2 un, N! 2,,,! 2roperties of e(tracelullar protease from an e(treme thermophilic microor&anism isolated from Tan&kupan 2rahu crater! 'ayati ?: "*+,! Don&, ;!D!#! +>>/! (ood En ymes$ structure and mechanism! 3hapman P 'all!, <ew Nork!

#eminar <asional 2en&olahan 2roduk dan Bioteknolo&i 8elautan dan 2erikanan II, =akarta > A&ustus 2,+,

+?