Abstrak Cudraflavone B ( 1 ) adalah flavonoid terprenilasi yang ditemukan dalam jumlah besar di akar Morus alba , tanaman yang

digunakan untuk anti -inflamasi yang terkenal . Masa kini Studi menunjukkan bahwa senyawa ini menyebabkan penghambatan yang signifikan terhadap mediator inflamasi yang di dipilih dalam model in vitro . Dengan demikian , 1 adalah diidentifikasi sebagai inhibitor potein dari tumor necrosis factor R ( TNFR ) ekspresi gen dan sekresi dengan menghalangi translokasi nuklir Faktor kB ( NF -kB ) dari sitoplasma ke inti macrophages berasal dari garis THP - 1 sel monosit manusia . Kegiatan pengurangan NF kB mengakibatkan penghambatan siklooksigenase 2 ( COX - 2 ) gen ekspresi . Senyawa 1 bertindak sebagai COX - 2 dan COX - 1 inhibitor dengan selektivitas tinggi terhadap COX - 2 daripada indometasin . pretreatment sel dengan 1 bergeser puncak dalam protein seng - jari gen peraturan 36 ( ZFP36 ) ekspresi assay . Produk alami ini memiliki antiinflamasi terlihat properti , menunjukkan bahwa 1 berpotensi dapat digunakan untuk pengembangan sebagai lead obat anti inflamasi nonsteroid . pendahuluan murbei Putih ( Morus alba L. , Moraceae ) dikenal sebagai bahan baku untuk ulat sutra Selain itu , ekstrak buah-buahan , daun , dan ranting digunakan secara luas di pengobatan Asia tradisional sebagai Obat anti -inflamasi , karena kemampuan mereka untuk mengatur tingkat gula darah , dan diuretik , antitusif ,dan sifat antipiretik . Kegiatan antioksidan ekstrak dan senyawa yang diisolasi dari murbei putih juga telah didokumentasikan. ekstrak ini menunjukkan kemampuan untuk mengurangi produksi NO dan prostaglandin E2 ( PGE2 ) dalam lipopolisakarida Macrophages tikus ( LPS ) - dirangsang . Senyawanterisolasi dari akar M. alba menunjukkan sifat anti inflamasi. Salah satu senyawa tersebut adalah cudraflavone B ( 1 ) yang pertama diperoleh dari kulit akar Cudrania tricuspidata ( Moraceae ) , tetapi kemudian dari Morus dan Artocarpus spp. flavon terprenilasi ini telah menunjukkan aktivitas hepatoprotektif , sitotoksisitas terhadap sel karsinoma lambung manusia pada garis BGC - 823 dan selsel melanoma tikus B16 , efek moderat penghambatan pada otak tikus monoamine oxidase ( MAO ) , dan aktivitas antiproliferatif yang disebabkan oleh downregulation yang berasal dari pRb phosphorylation. Di sisi lain , 1 memiliki terbukti kurang dalam aktivitas sebagai antioksidan. Makrofag adalah sel yang memainkan peran penting dalam regulasi peradangan . Aktivasi mereka mengarah ke produksi berbagai faktor pertumbuhan , sitokin , dan zat lainnya , yang berpartisipasi dalam proses inflamasi . Proses ini dikendalikan terutama pada tingkat transkripsi , seperti yang telah ditinjau oleh Medzhitov dan Horng.17 Tindakan cepat dari impuls pro - inflamasi diikuti dengan reaksi regulasi negative yang mengembalikan jaringan yang terkena untuk homeostasis . salah satu seperti umpan balik protein regulator adalah ZPF36 . Protein ini berikatan dengan Daerah AU - kaya beberapa mRNA pro - inflamasi (seperti TNFR ) , mendestabilkan mereka , dan akibatnya produksi mereka menurun Faktor nuklir kB ( NF -kB ) memainkan peran penting dalam mengaktifkan respon inflamasi dengan melepaskan produksi sitokin pro - inflamasi, seperti tumor necrosis factor R ( TNFR ) atau CCL2 , dan enzim , seperti siklooksigenase ( COX - 2 ) dan diinduksi NO - synthase ( iNOS atau NOS2 ) . NF -kB

juga disebut " mediator tengah sistem kekebalan tubuh manusia " , atau lebih tepatnya " mediator pusat respon stres manusia " . Seiring dengan modulasi respon inflamasi dijelaskan , faktor ini juga terlibat dalam regulasi apoptosis dan dapat dihubungkan dengan kanker development.22 Tujuan dari laporan ini adalah untuk menggambarkan sifat anti inflamasi 1 dan memperkenalkan sebagai potensi baru nonsteroid obat anti - inflamasi . hasil dan pembahasan Cudraflavone B ( 1 ) diisolasi dari akar M. alba sebagai bubuk amorf kecoklatan . Ekstrak etanol dari akar dibagi dalam campuran pelarut bercampur , seperti yang dijelaskan dalam Bagian Eksperimental . Bagian kloroform - larut adalah dipisahkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi fase-balik untuk mendapatkan cudraflavone murni dalam satu langkah pemisahan tunggal. Identitas dari sampel terisolasi dikonfirmasi sebagai cudraflavone dengan membandingkan Data yang diukur diperoleh dari 1H dan 13C NMR spektroskopi dan HRMS dengan nilai-nilai dalam literature. Untuk menilai efek dari Cudraflavone B awal pada kelangsungan hidup dan pertumbuhan sel , sel THP - 1 yang terkena untuk meningkatkan konsentrasi ( 1-50 M) dari senyawa ini selama 24 jam , patri untuk kelangsungan hidup , dan dihitung . Nilai LD50 akhir untuk cudraflavone B menjadi 47,6 M . Untuk membandingkan sitotoksisitas 1 dengan hasil klinis digunakan agen antiinflammatory, meningkatkan konsentrasi indometasin ( 1-100 M) ditambahkan ke THP - 1 sel . The LD50 nilai indometasin berasal dari data ini dinilai sebagai > 100 M . Sebuah pemeriksaan awal dari prenyl dan geranyl flavonoid yang diisolasi dari akar M. alba dan buah Paulownia tomentosa ( Paulowniaceae ) ( beberapa flavonoid ini telah dijelaskan dalam sebelumnya paper24 ) menunjukkan bahwa Cudraflavone B merupakan inhibitor poten dari gen TNFR transkripsi setelah stimulasi LPS ( data tidak ditampilkan ) . berikut rinci eksperimen waktu -kursus dikonfirmasi pengamatan ini ( Gambar 1 ) . Cudraflavone B ( 1 ) , pada konsentrasi 10 M , menurun secara signifikan ofTNFR transkripsi di hampir setiap titik dalam waktu pengukuran . efek Efek penghambatan ditemukan 2 jam setelah stimulasi LPS , ketika 1 dikurangi mRNA yang dari TNFR dengan faktor 5,8 dibandingkan dengan kendaraan only sel diobati. Cudraflavone B ( 1 ) menurun TNFR transkripsi lebih efektif daripada indometasin ( Gambar 1 ) . penghambatan dari TNFR transkripsi disebabkan oleh 1 adalah dalam konser dengan sekresi TNFR menghambat ke dalam media ( Gambar 2 ) , yang produksi sitokin ini oleh sel praperawatan dengan 1 adalah dikurangi dengan faktor 20 . Ditemukan bahwa 1 berkurang secara signifikan transkripsi gen COX - 2 4 jam setelah stimulasi LPS ( Gambar 3 ) . Kemampuan 1 untuk menghambat COX - 2 fungsi juga diukur . Flavon ini memberi nilai IC50 COX - 2 sebesar 2,5 ( 0,89 M (rata-rata ( SE untuk empat percobaan independen dengan setidaknya dua ulangan ) . Hal serupa nilai yang diperoleh untuk indometasin , yang merupakan COX dikenal inhibitor . Nilai IC50 COX - 2 yang ditemukan menjadi 1,9 ( 0,61 M (rata-rata ( SE untuk empat percobaan independen dengan setidaknya dua ulangan ) . Banyak merugikan efek samping dari NSAID

disebabkan oleh COX - 1 penghambatan . Oleh karena itu, nilai COX- 1 IC50 ditentukan untuk 1 , yang adalah 1,5 ( 0,65 M ( mean ( SE untuk empat percobaan independen dengan setidaknya dua ulangan ) . untuk indometasin , nilai IC50 COX-1 adalah sama dengan 0,3 ( 0,14 M (rata-rata ( SE untuk empat percobaan independen dengan setidaknya dua ulangan ) . Selektivitas in vitro dari kedua 1 dan indometasin kemudian dihitung sebagai rasio penghambatan COX-2/COX-1 . Nilai-nilai dihitung untuk 1 dan indometasin adalah 1,70 dan 6.45 , masing-masing. Dengan demikian , 1 bertindak sebagai COX - 2 dan COX - 1 inhibitor dengan selektivitas tinggi terhadap COX - 2 daripada indometasin . transkripsi maksimum ZFP36 diamati 2 jam setelah induksi LPS ( Gambar 4 ) . Pada titik waktu ini , sel-sel pra-perawatan dengan 1 menunjukkan efek transkripsi gen dari ZFP36 5,8 kali lebih rendah dari sel diperlakukan dengan kendaraan saja. Di sisi lain , 4 jam setelah stimulasi LPS , 1 mampu meningkatkan transkripsi dari ZFP36 dengan faktor 2 . Hanya efek lemah indometasin di dibandingkan dengan kendaraan diamati . Ketika cudraflavone B ( 1 ) mempengaruhi ekspresi gen proinflamasi , pengaruhnya terhadap aktivitas transkripsi Faktor NF -kB , yang mengontrol produksi mRNA , dievaluasi . Bentuk aktif dari NF -kB disimpan di sitoplasma , sedangkan bentuk aktif terletak di nucleus. Rasio antara sitoplasma dan nuklir NF kB diukur untuk mengevaluasi kemampuan dari 1 dalam menjaga protein dalam sitoplasma ( Gambar 5 ) . Hasil yang diperoleh dalam konser dengan pengamatan di atas, di mana 1 turun-diatur transkripsi gen pro - inflamasi . sel pretreated dengan 1 menunjukkan terjadinya NF -kB di inti mereka 3,2 kali mlebih rendah daripada di kendaraan - hanya sel-sel diobati . Hasil yang sama yang diamati untuk sel diobati indometasin. Beberapa flavonoid sebelumnya telah menunjukkan kemampuan untuk memerangi peradangan menggunakan dalam model in vivo . Penghambatan siklooksigenase ( COX ) dan lipoxygenase ( LOX ) merupakan tes rutin untuk mengungkapkan senyawa baru dengan potensi dampak pada metabolit inflamasi aktif dari asam arakidonat . banyak tes lainnya , termasuk tes in vivo , telah digunakan untuk menunjukkan agen antiphologistic baru , dan beberapa flavonoid memiliki aktivitas relatif kuat. Perlu disebutkan bahwa flavonoid lipofilik yang lain telah ditampilkan memiliki aktivitas anti-inflamantory yang lebih baik . flavonoid dengan satu atau lebih substituen prenyl milik sekelompok metabolit sekunder lipofilik sering hadir pada permukaan tanaman sebagai agen pembela . Karakter lipofilik dari terprenilasi flavonoid memungkinkan senyawa ini menembus membran sel hewan dan mudah masuk ke dalam sel dan mempengaruhi metabolisme , lebih baik daripada nonprenylated yang analog . seperti metabolit sekunder menggabungkan dua jalur biosintesis , senyawa ini telah menarik perhatian phytochemists karena structural Parameter mereka dapat menampilkan banyak kemungkinan untuk aktivitas biologis . Potensi anti inflamasi dari senyawa ini diketahui, misalnya , dari studi tentang Chi et al . , 26 yang mengungkapkan kegiatan anti - COX dan anti - LOX dari beberapa flavonoid prenyl . Namun, morusin , senyawa flavonoid prenyl memiliki struktural mirip dengan 1 , memiliki nilai IC50 untuk COX - 1 , COX - 2 , 5 - LOX , dan 12 - LOX dari 100 pM atau lebih tinggi dalam penelitian ini . Dengan demikian , posisi prenyl rantai samping siklik padakerangka flavonoid bisa menjadi penting untuk aktivitas anti - COX . Sebaliknya , Wei et al.27 menemukan bahwa cudraflavone A ( seperti 1 , cudraflavone A memiliki fungsi tambahan dari B - dan C - cincin oleh prenyl di B -ring dan hidroksil di C ring ) mampu memicu produksi moderat anion superoksida dan dengan demikian menampilkan Efek pro - inflamasi , tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi ( 30 dan 90 M) daripada yang digunakan di sini ( 10

M) yang digunakan dalam studi mereka . Menurut literatur , satu-satunya studi yang berhubungan dengan assay dari aktivitas anti - inflamasi dari 1 adalah analisis gen ekspresi iNOS dan produksi NO di RAW 264,7 sel , yang menunjukkan aktivitas dalam ketergantungan konsentrasi Pada penelitian ini , kami telah menemukan bahwa cudraflavone B ( 1 ) terisolasi dari akar murbei putih menurunkan respon inflamasi dalam makrofag LPS - dirangsang . Ekspresi pro - inflamasi sitokin TNFR khas menurun signifikan oleh 1 kedua tingkat transkripsi dan translasi . Sebelumnya, penurunan tingkat TNFR transkripsi telah diamati untuk ekstrak yang diperoleh dari kulit batang dan daun murbei putih, tetapi studi ini tidak memiliki identifikasi dari senyawa yang hadir dalam ekstrak . Oleh karena itu, konstituen anti inflamasi spesies Morus masih belum diketahui , dan sebagai titik awal dianggap bahwa senyawa ini bisa menjadi diwakili oleh cudraflavone B ( 1 ) , yang hadir dalam jumlah besar di ekstrak akar M. alba. Ditemukan bahwa cudraflavone B ( 1 ) menghambat translokasi nuklir NF -kB pada tingkat mikromolar . Cudraflavone B ( 1 ) menurunkan transkripsi CCL2 kemokin dan inducible NO - synthase ( iNOS ) , yang juga berada di bawah kendali transkripsi NF -kB , tetapi tanpa signifikansi statistic ( data tidak ditampilkan ) . Ini telah diamati pada penelitian sebelumnya yang Air daun M. alba dan ekstrak bark, yang juga mengandung 1 , mampu memperbaiki aktivitas NF -kB . Sebuah demonstrasi lebih lanjut dari potensi anti inflamasi 1 ditunjukkan oleh transkripsi dari enzim kunci dari jalur biosintesis prostaglandin, COX - 2 , yang dilemahkan oleh 1 . Senyawa ini memiliki kemampuan nyata untuk menghambat dalam sintesis vitro dari prostaglandin E2 ( PGE2 ) , produk COX 2 . Efek ini sebanding dengan inhibitor COX ,indometasin ( COX - 2 IC50 = 2,5 ( 0,89 M untuk 1 dan 1,9 ( 0,61 M untuk indometasin ) , menunjukkan bahwa 1 merupakan inhibitor kuat COX 2, namun 1 juga dipamerkan COX - 1 aktivitas penghambatan ( COX 1 IC50 = 1,5 ( 0,65 M) . Selain 1 , beberapa senyawa lainnya dengan aktivitas penghambatan COX - 2 telah ditemukan di kulit akar murbei, tetapi nilai-nilai IC50 mereka sekitar 40-50 M. Jalur COX - 2 adalah salah satu target utama untuk obat anti inflammatory drugs ( NSAID ) , sedangkan konstitutif COX - 1 menghasilkan prostaglandin rumah tangga , dan inhibisi yang tidak diinginkan . Karena beberapa obat anti inflamasi memiliki efek samping yang merugikan , misalnya , toksisitas gastrointestinal , yang disebabkan oleh penghambatan COX - 1 , obat anti - inflamasi dengan preferensial aktivitas penghambatan COX - 2 yang diinginkan . Satu-satunya protein diuji dengan kemampuan untuk memodulasi tingkat mRNA adalah ZFP36 . sel pra-perawatan dengan Crudaflavone B hanya menunjukkan pergeseran puncak transkripsi , sementara sel diperlakukan dengan indometasin atau hanya DMSO mencapai maksimal 2 jam setelah stimulasi LPS . Sel praperawatan dengan 1 menunjukkan puncak pada 4 jam setelah perawatan LPS . Pergeseran pada gen transkripsi ZFP36 ini tidak bisa dijelaskan dengan baik , tetapi mungkin memiliki dampak pada beberapa ekspresi gen pro - inflamasi, seperti TNFR tersebut . Penelitian ini telah menunjukkan bahwa cudraflavone B ( 1 ) memiliki beberapa potensi sebagai obat anti - inflamasi baru , tapi lebih lanjut analisis dan dalam tes vivo diperlukan untuk pemahaman yang lebih baik mekanisme yang tepat dari aksinya .

BAGIAN EKSPERIMEN Prosedur Eksperimental Umum . Spektrum NMR direkam menggunakan spektrometer Bruker Avance 300 yang beroperasi pada frekuensi dari 300,13 MHz ( 1H ) dan 75,48 MHz ( 13C ) . Spektra diukur dalam shift DMSO - d6 atau CDCl3 pada 303 K. 1H dan 13C NMR kimia ( dalam ppm ) yang direferensikan ke sinyal dari pelarut [ 2,50 ( 1H ) dan 39.43 ( 13C ) untuk DMSO - d6 dan 7.26 ( 1H ) dan 77,00 ( 13C ) untuk CDCl3 ] . 2D NMR , gs - COSY , gs - HSQC , dan gs - HMBC digunakan untuk menetapkan 1H individu dan 13C resonansi .percobaan HSQC telah disesuaikan untuk kopling 1JHC = 150 Hz dan percobaan HMBC untuk longrange kopling 7,5 Hz . Sebuah workstation Mariner PE Biosystem dengan APITOF digunakan untuk mengumpulkan HRMS . Spektrum ini dikumpulkan di mode negatif . HPLC preparatif dilakukan pada LCP 4100 instrumen, dengan lingkaran injeksi 100 uL , kolom block LCO 101 , dan UV detektor LCD 2084 ( Ecom , CR ) . Sebuah Agilent 1100 aparat dilengkapi dengan detektor diode -array digunakan untuk kromatografi yang penentuan kemurnian ( Supelcosil ABZPlus , 150 mm ? 4.6 mm id , ukuran partikel 3 pm ) . RPMI 1640 medium , campuran penisilin - streptomisin , dan tripsin 170 U / mL ditambah dengan EDTA 200 mg / mL yang dibeli dari Lonza ( Verviers , Belgia ) . Manusia rekombinan enzim COX-2 adalah diperoleh dari Sigma - Aldrich ( St Louis , MO ) , dan COX - 1 enzim terisolasi dari ram vesikula seminalis adalah dari Cayman Kimia ( Ann Arbor , MI ) . Fosfat - buffered saline ( PBS ) , hematin babi , janin bovine serum ( FBS ) , phorbol miristat asetat ( PMA ) , indometasin ( 99 % ) , Erythrosin B , L - epinefrin , sodium EDTA , dan Escherichia coli 0111 : B4 lipopolisakarida ( LPS ) yang dibeli dari Sigma Aldrich ( Steinheim , Jerman ) . Dua langkah kuantitatif transkripsi terbalik PCR ( RT qPCR ) dicapai dengan Expression TaqMan Gene Sel - to- Ct kit ( Ambion , Austin , TX ) dan TaqMan Gene Expression Master Mix dari Applied Biosystems ( Foster City , CA ) . spesifik primer dan probe ( tes ) yang lyophilized dalam array TaqMan piring ( Applied Biosystems ) . Alat tes berikut dipilih untuk kuantifikasi ekspresi gen : Hs00174128_m1 untuk TNFR , Hs00185658_m1 untuk ZFP36 , Hs01573471_m1 untuk COX - 2 , dan Hs99999903_m1 untuk - aktin , yang berfungsi sebagai kontrol internal ekspresi gen . A PARIS kit ( Ambion , Austin , TX ) digunakan untuk mengisolasi protein nuklir . EZ - Mendeteksi NF -kB p65 faktor transkripsi kit ( Thermo Scientific , Rockford , IL ) ini digunakan untuk mendeteksi NF -kB . sebuah AlphaLISA TNFR kit ( PerkinElmer , Boston , MA ) digunakan untuk mengevaluasi produksi TNFR . The EIA kit yang digunakan untuk mengukur konsentrasi prostaglandin E2 dibeli dari Assay Desain ( Ann Arbor , MI ) . Ekstraksi dan Isolasi . Sejumlah 537 g kering akar M. alba diproses sesuai dengan literature.24 dengan Ekstrak CHCl3 adalah dipisahkan menggunakan fase terbalik HPLC preparatif ( Supelcosil ABZ Plus, 250 ? 21.2mmi.d. , ukuran partikel 5 m ) . Elusi gradien digunakan 0,2 % HCOOH dan campuran MeCN dan MeOH , 08:02 ( v / v ) ( A) , di gradien : komposisi awal 20 % A , komposisi akhir 100 % A di 40 menit; laju alir 25 mL / menit . Fraksi yang diperoleh sesuai dengan respon detektor pada = 280 nm . Setelah penghapusan pelarut organic dan curah hujan , fraksi dengan HPLC tR dari 2425 min dihasilkan cudraflavone B ( 1 ) ( 680 mg ) . Identitas 1 dikonfirmasi oleh membandingkan data spektroskopi dengan yang dilaporkan sebelumnya.23 kemurnian senyawa 1 didirikan untuk lebih dari 98 % menggunakan HPLC Analisis DAD . Pemeliharaan dan Persiapan Makrofag . The THP - 1 manusia garis sel leukemia monocytic diperoleh dari Eropa Koleksi Cell Budaya ( ECACC , Salisbury , Inggris ) . Sel-sel yang dibudidayakan pada 37 ? C di medium RPMI 1640 ditambah dengan 2 mM L - glutamin , 10 % FBS , 100 U / mL penisilin , dan 100 mg /

mL streptomisin dalam suasana lembab yang mengandung 5 % CO2 . Media berubah dua kali seminggu , ketika sel-sel telah mencapai konsentrasi 5-7 ? 105 sel / mL . Viabilitas sel lebih besar dari 94 % di seluruh percobaan . Sel stabil dibagi menjadi piring 96-baik untuk membeli konsentrasi 300 000 sel / mL , dan diferensiasi menjadi makrofag diinduksi oleh phorbol miristat asetat ( PMA ) , seperti yang dijelaskan .31 Sitotoksisitas Test. Cudraflavone B ( 1 ) dan indometasin adalah dilarutkan dalam dimetilsulfoksida ( DMSO ) pada lima konsentrasi meningkat dan ditambahkan ke suspensi monosit dalam medium kultur . itu konsentrasi akhir DMSO dalam media kultur adalah 0,1 % . inkubasi selama 24 jam pada 37 ? C dengan 5 % CO2 diikuti . Jumlah sel dan viabilitas ditentukan pewarnaan berikut dengan Erythrosin B. noda The ( 0,1 % Erythrosin B ( w / v ) ) dalam phosphate-buffered saline ( PBS ) , pH 7,2-7,4 , dicampur dengan jumlah yang sama dari suspensi sel , dan jumlah Sel-sel yang layak dan nonviable dihitung secara manual menggunakan hemositometer . Sel yang tetap tidak dicemarkan dianggap layak dan cahaya sel darah merah sebagai nonviable . Setiap senyawa ditandai oleh LD50 nilai , konsentrasi senyawa mematikan untuk 50 % dari sel-sel , seperti dihitung dari kurva dosis-respons yang diperoleh . The sitotoksik LD50 konsentrasi senyawa yang diuji ditentukan dengan menggabungkan data dari persamaan yang dihasilkan oleh KURV software versi 4.4b ( Conrad Tombol Software , Arlington , WA ) , dengan analisis statistik menggunakan GraphPad Prism 5,02 software ( GraphPad Software , San Diego , CA ) , yang digunakan untuk data LD50 berasal dari nilai-nilai diplot pada graph . Pengobatan Obat dan Induksi Peradangan . Makrofag yang berbeda diobati sebelumnya selama 1 jam dengan 10 pM 1 dilarutkan dalam DMSO . Sebagai perbandingan dengan obat konvensional , 10 Mindomethacin dalam DMSO terlarut digunakan . Konsentrasi ini tidak memiliki efek sitotoksik, dan viabilitas sel ditemukan lebih dari 90 % . Kendaraan diperlakukan Sel-sel yang terkandung kendaraan ( DMSO ) saja, dan sel kontrol yang tanpa Pengobatan LPS . Konsentrasi DMSO adalah 0,1 % pada setiap sumur . Efek dari 1 pada modulasi ekspresi gen inflamasi adalah diuji dengan menambahkan 1 mg / mL LPS dilarutkan dalam air steril untuk makrofag pra-perawatan dengan obat . LPS dapat memicu reaksi inflamasi melalui mengikat TLR - 4 dan kemudian mengaktifkan theNF -kB signaling pathway.32 Media budidaya disedot pada 2 , 4 , 6 , dan 10 jam setelah yang cellswere LPS treatment.Adherent kemudian langsung segaris dalam budidaya lisat sumur, dan sel dikumpulkan . Sampel dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada -80 ? C untuk pengolahan berikutnya . Isolasi RNA dan Evaluasi Gene Expression . Dalam rangka untuk mengevaluasi ekspresi TNFR , COX - 2 , ZFP36 , dan - aktin mRNA , total RNA diisolasi langsung dari sel-sel di piring budidaya menggunakan TaqMan Gene Expression Cell- to- Ct kit , sesuai dengan instruksi dari pabriknya . Konsentrasi dan kemurnian RNA ditentukan dengan menggunakan spektrofotometri UV . Ekspresi gen dihitung dengan dua langkah mundur transkripsi kuantitatif ( real-time ) PCR ( RT - qPCR ) dengan Expression TaqMan Gene Sel - to- Ct kit dan piring berbagai TaqMan . Ini mengandung spesifik primer dan probe TaqMan yang mengikat persimpangan ekson - ekson untuk menghindari kontaminasi DNA . Parameter untuk pekerjaan qPCR dengan TaqMan

Gene Expression Cell- to- Ct kit yang disesuaikan dengan rekomendasi pabrikan : ( a) step reverse transcription - 37 ? C selama 1 jam dan kemudian 95 ? C selama 5 menit , ( b ) polymerase langkah -50 ? C 2 menit , kemudian 95 ? C selama 10 menit , diikuti dengan 40 siklus pada 95 ? C selama 15 s dan 60 ? C selama 1 menit . Hasil dinormalkan dengan jumlah ROX dye referensi , dan perubahan dalam ekspresi gen ditentukan oleh CT method.33 Transkripsi sel kontrol ditetapkan sebagai 1 , dan kelompok eksperimen lainnya adalah kelipatan dari nilai ini . Penentuan Nuklir NF - KB Translokasi . pretreatment Makrofag dirangsang LPS dipanen oleh trypsinization dan menggores 1 jam setelah perawatan LPS . Sel berputar turun , beku dalam nitrogen cair , dan disimpan pada -80 ? C untuk pengolahan berikutnya . cytoplasmatic dan fraksi protein nuklir diisolasi dari sel-sel yang dikumpulkan menggunakan kit PARIS . Kehadiran NF -kB subunit p65 diukur dalam kedua fraksi oleh EZ - Mendeteksi NF -kB faktor transkripsi p65 kit , dan sitoplasma / rasio nuklir dihitung . Batas deteksi yang lebih rendah adalah 25 pg / mL .Evaluasi Sekresi TNFR . Makrofag yang telah pretreatment selama 1 jam dengan senyawa uji diinkubasi dengan LPS untuk berikutnya 24 jam. Setelah periode ini , media dikumpulkan dan konsentrasi TNFR diukur menggunakan kit AlphaLISA TNFR pada perangkat Enspire ( PerkinElmer , Boston , MA ) . Waktu eksitasi adalah 80 ms , dan emisi diukur selama 120 ms . Batas deteksi yang lebih rendah adalah 3,2 pg / mL . Penentuan COX - 1 dan COX - 2 efek inhibitor . Pengujian dilakukan menurut prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya oleh Reininger dan Bauer34 dengan rekombinan manusia COX - 2 atau COX - 1 dari ram vesikula seminalis . Secara singkat , COX - 2 ( 0,5 Unit / reaksi ) atau COX - 1 ( 1 unit / reaksi ) ditambahkan ke dalam campuran inkubasi terdiri dari 0,1 M Tris / HCl (pH 8,0 ) , 5 M hematin babi , 18 mM L - epinefrin , dan 50 mM natrium EDTA . Zat uji terlarut inDMSOor pureDMSO ( dalam kasus kosong ) ditambahkan untuk reaksi dan preincubated selama 5 menit pada suhu kamar . itu Reaksi dimulai dengan menambahkan asam arakidonat dan kemudian diinkubasi selama 20 menit pada 37 C. Konsentrasi PGE2 , produk utama dari reaksi , ditentukan dengan menggunakan kit PGE2 EIA berdasarkan kompetitif immunoassay enzim . Intensitas warna kuning yang dihasilkan , yang berbanding terbalik dengan konsentrasi PGE2 di sampel , diukur pada lempeng pembaca Tecan Tak Terbatas M200 ( Tecan Group, M annedorf , Swiss ) pada 405 nm. Nilai-nilai IC50 yang ditentukan oleh analisis regresi dari setidaknya tiga konsentrasi . Analisis Statistik . Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga , dan hasilnya disajikan sebagai nilai rata-rata , dengan bar error mewakili standard error ( SE ) dari mean . Sebuah tes ANOVA satu arah adalah digunakan untuk analisis statistik , dilanjutkan dengan uji Newman - Keuls posthoc untuk beberapa perbandingan . Sebuah nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik . GraphPad Prism 5.02 ( GraphPad Software Inc , San Diego , CA ) digunakan untuk melakukan analisis .