PENGECATAN GRAM

Oleh: Shofyatul Yumna Triyana

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu pengecatan Gram! dapat digunakan untuk identifikasi a"al. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta# dalam kasus tertentu# dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh $hristian Gram pada tahun %&&'. (engan metode pengecatan Gram# bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua# yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. )eaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu# pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. PERSIAPAN Sebelum dilakukan pengecatan Gram# tentu harus disiapkan bahan spesimen! yang akan diperiksa. *ahan yang akan diperiksa# dapat berasal dari : %! langsung dari penderita dapat berupa sputum dahak!# pus nanah!# discharge telinga, discharge hidung# urin dan cairan serebrospinal. Spesimen yang akan dicat# sebelumnya dibuat sediaan atau preparat smear! terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek object glass! atau slides# dengan atau tanpa pe"arnaan# yang selanjutnya dapat diamati di ba"ah mikroskop. a. Pembuatan preparat +lat dan bahan yang diperlukan adalah : +lat : Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek ,ampu spiritus *ahan : *ahan yang akan diperiksa. -ntuk bahan yang berbeda# memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. *erikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. a.%. *ahan langsung dari penderita *ahan disentrifuge terlebih dulu# kemudian endapannya dibuat preparat. *ahan yang berupa endapan pellet! hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya jarak preparat sampai nyala api kira.kira /0 cm!# sampai preparat tersebut kering. Setelah kering# teteskan formalin % 1 tunggu selama 2 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul.betul kering# preparat siap dicat. a./. *ahan dari biakan cair

+mbil gelas obyek yang bersih dan steril# bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. +mbil kuman dari biakan cair yang sebelumnya telah diaduk secara steril! dengan menggunakan ose steril# ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira.kira %./ cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. a.3. *ahan dari media pertumbuhan padat +mbil gelas obyek yang bersih dan steril# bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau 4a$l pada gelas obyek tersebut. (engan ose steril# ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter % 5 / cm# campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah : Selalu mensterilkan ose# pada saat akan dipakai dan setelah dipakai. ,etakkan ose pada tempatnya# jangan diletakkan di sembarang tempat misal di atas meja! 6angan memegang mata ujung! ose dengan tangan. -sahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

b. Cat Gram $at Gram yang digunakan terdiri dari ' macam# yaitu cat Gram +# *# $ dan (. Masing.masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. 7omposisi dan fungsi masing.masing cat Gram# adalah sebagai berikut : %. $at Gram + $at ini terdiri atas : 7ristal 8iolet : / gram 9til alkohol :2 : /0 ml +mmonium oksalat : 0#& gram +kuades : &0 ml $at Gram + ber"arna ungu karena mengandung kristal 8iolet!. $at Gram + merupakan cat primer yang akan memberi "arna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini# semua mikroorganisme akan ber"arna ungu sesuai "arna cat Gram +. /. $at Gram * $at ini terdiri atas : Yodium : % gram 7alium Yodida : / gram +kuades : 300 ml $at Gram * ber"arna coklat. $at Gram * merupakan cat Mordan# yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. +kibat pemberian cat Gram *# maka pengikatan "arna oleh bakteri akan lebih baik lebih kuat!. 3. $at Gram $ $at ini terdiri atas : +seton : 20 ml 9til alkohol :2 1 : 20 ml $at Gram $ tidak ber"arna. $at ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. +kibat pemberian cat $ akan terjadi / kemungkinan :

Mikroorganisme bakteri! akan tetap ber"arna ungu# karena tahan terhadap alkohol. ;katan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. *akteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. *akteri akan tidak ber"arna# karena tidak tahan terhadap alkohol. ;katan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. *akteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. '. $at Gram ( $at Gram ( terdiri atas : Safranin : 0#/2 gram 9til alkohol :2 1 : %0 ml +kuades : :0 ml $at ini ber"arna merah. $at ini merupakan cat sekunder atau kontras. $at ini berfungsi untuk memberikan "arna mikroorganisme non target. $at sekunder mempunyai spektrum "arna yang berbeda dari cat primer. +kibat pemberian cat Gram (# akan terjadi / kemungkinan : *akteri Gram positif akan tetap ber"arna ungu# karena telah jenuh mengikat cat Gram + sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram (. *akteri Gram negatif akan ber"arna merah# karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram $ maka akan mampu mengikat cat Gram (. (asar teori cat Gram *erdasarkan sifat terhadap cat Gram# bakteri dapat dikelompokkan menjadi / yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu : %. Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi /0 1! di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. <at lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori.pori pada dinding sel membesar# sehingga =at "arna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak ber"arna. *akteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku# pori.pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang ber"arna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap ber"arna ungu. /. Teori permeabilitas dinding sel Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. *akteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang# dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar. *akteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis# hanya % 5 / lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium. CARA PENGECATAN GRAM Sebelum melakukan pengecatan Gram# siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. 6angan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan "aktu. +lat dan bahan yang diperlukan adalah : +lat : )ak pengecatan

 7ran>sumber air yang mengalir *ahan : $at Gram +# *# $ dan ( Preparat yang telah siap untuk dicat Skema cara pengecatan Gram : Preparat yang telah siap dicat# digenangi dengan cat Gram + selama % 5 3 menit

$at dibuang# lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi cat Gram * selama 0#2 5 % menit

$at dibuang# lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat ditetesi dengan cat Gram $ sampai "arna cat tepat dilunturkan.

$at dibuang# lalu preparat dicuci dengan air mengalir

Preparat digenangi dengan cat Gram ( selama % 5 / menit

Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara

Preparat siap diamati diba"ah mikroskop

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM Kelebihan %. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman a"al untuk memutuskan terapi antibiotik# sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik!. ?al ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. /. 7adang.kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus nana! uretral# maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Ke!uran"an Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari %0' per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal# memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet endapan hasil sentrifuge! kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. Pu#ta!a a$uan 4ir"ati# ?era# @@@@@@@# Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi# ,aboratorium Mikrobiologi Aakultas 7edokteran -ni8ersitas Gadjah Mada# Yogyakarta Strohl# Billiam +# )ouse#?# Aisher# *(# /00%# Lippincotts Illustrated Reviews Microbiology, ,ippincott Billiam C Bilkins# -S+