BAB I PENDAHULUAN

1.1 Tujuan Praktikum Untuk mengetahui cara memurnikan isolate campuran menjadi isolate murni menggunakan metode cawan gores kuadran 1.2 Dasar Teori Mikroorganisme terdapat dimana-mana di dalam lingkungan kita mereka ada pada tubuh kita, didalam tubuh kita, dan di sekeliling kita. Mereka merupakan komponen penting dalam ekosistem. Mereka hidup di habitat alamiahnya dalam suatu komunitas yang terdiri dari berbagai jenis mikroorganisme, bersama spesies-spesies biologi lainnya. Satu spesies mikroba didalam komunitas ini dapat mempengaruhi spesies lain dengan berbagai cara-cara beberapa bersifat

menguntungkan beberapa merugikan. Oleh karena itu, dalam mempelajarinya, bakteri harus diambil dari alam lalu diisolasikan dalam suatu biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya berisi satu jenis bakteri (Pelczar, 1986). Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerlukan banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat-alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar-beanr steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikroba lain yang tidak diinginkan sehinggabiakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar-benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1980). Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisahpisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrient denganmetode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak

diri secara cepat sehingga dalam waktu 18-24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Pelczar, 2007). Isolasi adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Mikroba dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton, 2006). Ada beberapa metode untuk menginokulasi mikroba sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan mikroba. (Harley, 2002). Untuk metode streak plate misalnya, mikroba diletakan didalam pada ujung palte mengguanakan ose, lalu digoreskan pada permukaan medium agar tersebut dengan pola tertentu yang khas. Ada pula metode Pour Plate atau penuanga. Metode ini dapat digunakan untuk penghitungan bakteri secara langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut diencerkan terlebih dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media terdapat 30-300 koloni dapat terpenuhi (Prescott, 2008).

Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) : 1. Metode cawan gores Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya

mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaikbaiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores. 2. Metode cawan tuang Cara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan cawan tersebut mengandung kolonikoloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Pelczar, 1988) : a) Isolasi pada agar cawan Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut

setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel. Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan. b) Isolasi pada medium cair Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. c) Isolasi sel tunggal Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis. Pertama kali mengadakan piaraan biasanya diperoleh dari piaraan campuran, piaraan pertama disebut primary culture dan sifatnya murni.Piaraan semacam ini dapat disimpan tetapi harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru yang disebut piaraan turunan (Sub-culture) yaitu piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama (Dwidjoseputro, 1992).

BAB II METODE 2.1 Alat dan Bahan Alat 1. Cawan petri 2. Tabung reaksi 3. Jarum ose 4. Bunsen 5. Gelas kimia 6. Spidol 7. Penggaris 8. Label 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah Jumlah 1 buah 2 buah Bahan 1. Media NA 2. Media NA Jumlah 6 cawan 45 tabung

agar miring 3. Alkohol 4. Aquades 5. Isolate Bakteri Secukupnya Secukupnya 3 macam

2.2 Cara Kerja Jarum ose Hasil Dimasukkan ke dalam alkohol Dipijarkan diatas api Di dinginkan

Media NA dalam cawan petri Di buat kuadran 0, I, II, III pada bagian luar permukaan cawan

Dibuka tutupnya tidak terlalu lebar

Diletakkan satu jarum ose penuh kultur di atas permukaan agar

Dipijarkan didinginkan

jarum

ose

dan

Ditarik jarum ose kurang lebih sejajar Diputar cawan 900 Ditarik lurus kembali setelah menyentuuh ujung area I

memenuhi area II Dipijarkan kembali

0

lup

dan

cawan diputar 90 masuk area III setelah menyentuh area II Hasil Koloni terpisah S. marcescens (merah), M. luteus (kuning), dan E. coli (Putih) Hasil Diberi label Diinkubasikan pada suhu 250C

Lup Dipijarkan Di sentuhkan pada permukaan koloni Hasil

Tabung reaksi berisi media agar miring Dibuka tutup tabung Dipanaskan leher tabung Diinokulasikan media Hasil Dipanaskan kembali leher tabung Ditutup kembali ke permukaan

BAB III HASIL PENGAMATAN

(Pembuatan kuadran pada cawan) (Bakteri mulai tumbuh disetiap kuadran)

(Isolat murni pada media miring)

BAB IV PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi pada mikroba lebih tepatnya pada tiga jenis bakteri yaitu bakteri berwarna merah, kuning dan putih. Pemurnian isolat bekteri dilakukan pada cawan petri berisi media NA yaitu media untuk bakteri. Bakteri-bakteri tersebut asalnya merupakan biakan murni yang ditempatkan pada media NA miring. Menurut Fobisher (1974), untuk menumbuhkan mikroba ada berbagai macam medium yang digunakan. Untuk mudahnya medium mikroba

diklasifikasikan berdasarkan sifat, komposisi dan fungsinya. Berdasarkan sifat fisiknya, medium dibagi menjadi 3, yaitu solid medium, semi solid medium, dan broth medium. Sedangkan berdasarkan komposisi penyusunnya juga dibedakan menjadi medium sintetis, medium semi sintetis, medium non-sintetis. Berdasarkan fungsinya sendiri medium terbagi menjadi medium umum, medium selektif, medium diferensial, medium uji dan medium diperkaya. Penanaman ketiga bakteri tersebut pada cawan petri dilakukan agar untuk mencampurkan bakteri-bakteri tersebut dan mendapatkan koloni bakteri yang masing-masing berbeda dan ditanam pada media miring kembali. Cawan dibuat 4 daerah yang masing-masing akan di buat goresan bakteri yaitu kadran 0, I, II dan III. Hal ini dilakukan untuk mengurangi jumlah bakteri sedikit demi sedikit agar nantinya jumlah bakteri menjadi beberapa koloni. Penggoresan pada kuadran 0 dilakukan selama 3 kali dengan saling bertumpuk dengan metode zigzag, hal ini disebabkan agar dapat membentuk koloni campuran pada kuadran 0. Dibuat goresan hingga mencapai kuadran III sebagai zona terakhir, kemudian setelah dilakukan penggoresan cawan ditutup dan diberi seal agar tidak terkena kontaminan. Setelah ketiga jenis bakteri yang ditanam pada cawan telah tumbuh, maka proses selanjutnya adalah membuat isolat murni. Siapkan terlebih dahulu media miring pada tabung reaksi, kemudian ambil satu jenis bakteri yang bentuknya berkoloni dan goreskan secara zig-zag pada media miring tadi, ditutup dengan

penyumbat tabung reaksi dan simpan sampai bakteri itu tumbuh. Setiap media miring tabung reaksi hanya ada satu jenis bakteri saja. Berdasarkan hasil yang didapat dari pengamatan selama 3 hari terlihat bahwa pada kuadran III terdapat beberapa koloni bakteri yang berbeda dan kebanyakan berwarna merah. Setiap goresan yang dilakukan mengurangi jumlah bakteri menuju kuadran III hingga menyisakan beberapa koloni saja yaitu berwarna merah. Menurut Pelczar (1986), Untuk mempelajari kehidupan dan keragaman bakteri, diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan mereka dalam skala laboratorium. Pengembangbiakan ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat, seperti tanah, udara, sisa makanan, dll, dalam media yang mengandung nutrisi. Dalam dunia mikrobiologi, dikenal beberapa istilah seperti inokulasi, kultur dan isolasi. Inokulasi adalah suatu usaha menumbuhkan mikroorganisme dari satu sumber ke media pertumbuhan steril. Biakan yang tumbuh disebut dengan kultur. Isolat adalah biakan murni dari mikroorgansime yang diharapkan berasal dari satu jenis, sedangkan isolasi adalah usaha untuk mendapatkan isolat. Sumber isolasi Inokulasi Kultur/biakan Isolasi Isolat. Media pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur, media diferensial.

BAB V KESIMPULAN
Setelah dilakukan pengamatan dapat disimpulkan bahwa proses isolasi dilakukan untuk memsahkan satu mikroorganisme dari berbagai macam mikroorganisme (dalam hal ini bakteri berwarna merah, putih dan kuning). Bakteri yang berhasil diisolasi kembali adalah bakteri berwarna merah dan ditempatkan kembali pada media miring.

DAFTAR PUSTAKA
Brooks, dkk. 2007. Medical Microbiology. New York : Mc Graw Hill Dwidjoseputro.1990 . Dasar-Dasar Microbiologi. Malang : Djambatan Frobisher, 1974. Fundamentals Of Microbiology. London : Saunders Company Hadioetomo, R. S., 1993, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : Gramedia Jay, J.M., 2000. Modern Food Microbiology. Maryland: Aspen Publisher, Inc. Jawetz.1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: EGC. Pelczar. 1986 .Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press. Tortora. 2004. Microbiology an Introduction. San Fransisco: Benjamin Cumming. Talaro K.P.1999. Foundation Mikrobiologi Third Edition. New York : MC Graw Hill Supardi. 1999. Mikrobiologi dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan. Bandung : Alumni.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LANJUT Pemurnian Isolat

Disusun Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Praktikum Mikrobiologi Lanjut Dosen : Ukit Rosita, M, Si.

Nama NIM Kelompok Tanggal Praktikum Tanggal Pengumpulan

: Deydra Fitria Nur R : 1127020011 :6 : 14 April 2014 : 21 April 2014

PROGRAM STUDY BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN GUNUNG DJATI BANDUNG 2014