Aktivitas Sitotoksik Natural Killer Cell: Pengukuran terhadap Mekanisme Apoptosis Abstrak Aktivitas sitotoksik Natural Killer cell

(sel NK) sangat penting untuk membersihkan virus dan sel-sel yang berubah menjadi ganas. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meneliti mekanisme apoptosis dari sel NK yang bertujuan untuk melakukan pengukuran tambahan terhadap fungsi efektor sel NK. 1 kontrol yang sehat (umur ! "1 # $%& tahun) berpartisipasi dalam penelitian ini. Flow cytometric protocols menilai aktivitas sitotoksik sel NK mela'an sel tumor K()&% protein litik% degranulasi dan produksi interferon gamma. *elepasan perforin berkorelasi se+ara signifikan dengan aktivitas sitotoksik (r ! -,.-)% p .,%,() dan degranulasi (r ! -,.),% p .,%,(). /asil ini menunjukkan bah'a perforin mungkin digunakan sebagai pengukuran tambahan terhadap fungsi efektor sel NK sitotoksik. Kata kunci: Aktivitas 0itotoksik% *rotein 1itik% 2egranulasi PENDAHULUAN Natural Killer cell (sel NK) merupakan sel imun ba'aan yang melisiskan sel-sel yang terinfeksi dan dan berubah menjadi ganas melalui aktivitas sitotoksik 31,4. 0el NK sitotoksik mengandung banyak granul sekretori yang menyimpan dan melepaskan death-inducing protein seperti perforin dan gran5yme 3164. *rotein litik ini disimpan dalam granul yang dikelilingi oleh lipid bilayer yang mengandung lisosom yang berkaitan dengan membran glikoprotein% meliputi 721,$a% 721,$b dan 72)" 3&(4. 8alur sekresi granula adalah jalur utama yang digunakan untuk aktivitas sitotoksik sel NK 3&-4. *engenalan sel NK terhadap sel target mengaktifkan eksositosis protein litik dalam proses yang dikenal sebagai degranulasi% pelepasan perforin dan gran5yme ke immune sinaps 31&4. *erforin memfasilitasi pengiriman serin protease yang dikenal sebagai gran5yme ke sel target dengan membentuk pori pada endosome dan membran plasma sel target 31(% "14. *elepasan gran5yme mengaktivasi tiga jalur apoptosis yang berbeda pada sel target. *ada manusia% gran5yme 9 (:r59) dan gran5yme A (:r5A) adalah aktivator apoptosis yang paling poten 3(% 1-4. :r59 menginduksi

apoptosis melalui aktivasi kaskade caspase atau jalur mitokondria yang se+ara kinetis lebih lambat untuk mengaktivasi 3-% 1(4. Kedua jalur mengarah pada aktivasi deoxyribonuclease (2Nase)% yang memotong 2NA berantai ganda% yang menyebabkan lisis sel se+ara +epat 3(4. :r5A menginduksi apoptosis sel target se+ara independen dari aktivasi +aspase dengan menargetkan kompleks yang berkaitang dengan retikulum endoplasma untuk proteolisis% yang mengaktivasi 2Nase menyebabkan pe+ahan rantai tunggal dalam 2NA 3-%1(4. 2Nase bekerja melalui kombinasi dengan 3 'repair exonuclease (T;<=1)% men+egah perbaikan 2NA dengan memblokir akhir 2NA dari re-annealing dan menyebabkan lisis sitotoksik pada sel target 3(4. 0el NK juga memulai apoptosis sel target melalui death receptor pathway 3&-4. 1igan tumor necrosis factor ( TN> ) diekspresikan pada sel NK dengan mengikat >as ( 72 (?Apo-1 ) dan TNF -related apoptosis inducing ligand (T;A@1) pada sel target untuk menginduksi apoptosis 3& % "&4 . Death receptor pathway meningkatkan produksi sel NK dari sitokin interferon gamma ( @>N - A ) 3&6 % & 4 . @>N B A meningkatkan ekspresi permukaan sel pada ligan terhadap T;A@1 dan >as dan mensensitisasi sel target terhadap efek sitotoksik death receptor pathway dengan bertindak sebagai target transkripsi untuk gen pro-apoptosis 31" % &6 % & 4. Kemampuan untuk mengukur aktivitas sitotoksik sel NK memiliki implikasi penting se+ara klinis dimana penurunan aktivitas berkaitan dengan kerentanan terhadap infeksi berat 3",4. *emeriksaan tradisional yang mengukur aktivitas sitotoksik sel NK meliputi Chromium elease !ssay ( 7;A ) dan flow cytometric based cytotoxic assay yang mengukur lisisnya sel target yang diinduksi aktivitas sitotoksik sel NK 31&4. *enelitian lebih lanjut terhadap jalur aktivitas sitotoksik sel NK dapat menjadi pengukuran tambahan terhadap fungsi efektor sel NK yang berperan dalam induksi apoptosis pada sel target 3&14. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki mekanisme induksi apoptosis sel NK untuk menentukan pengukuran tambahan terhadap aktivitas sitotoksik sel NK. Aktivitas sitotoksik sel NK dibandingkan melalui sampel sel mononuklear darah tepi? peripheral blood mononuclear cells ( *9C7 ) dan sel NK terisolasi untuk menentukan apakah selsel NK yang terisolasi mengalami peningkatan sensitivitas terhadap aktivitas sitotoksik.

ME !DE Sub"ek Pene#itian 1 sukarela'an sehat (terdiri dari 1, pria% 'anita% usiaD "1 # $%& tahun) mendonorkan sampel darahnya. Analisa darah lengkap? full blood count (>97) termasuk lima jenis diferensiasi dan uji C-reacti"e protein dimasukkan sebagai kriteria inklusi pada peserta penelitian ini. Se# :radasi densitas sentrifugasi >i+oll-/ypaEue digunakan untuk mengisolasi *9C7 (:< /ealth 7are% Fppsala). *eralatan CA70 NK +ell negative isolation (Ciltenyi 9iote+% Tetero') memisahkan sel-sel NK dari *9C7 sesuai dengan instruksi. 0etelah isolasi% *9C7 dan sampel sel NK terisolasi disesuaikan pada konsentrasi 1G1,)sel?ml dengan ;*C@-1)-, (@nvitrogen 1ife Te+hnologies% 7arlsbad) ditambah dengan 1,H fetal bo"ine serum (>90 ) (@nvitrogen 1ife Te+hnologies% 7arlsbad)% 1H streptomyo+in?penisilin (@nvitrogen 1ife Te+hnologies% 7arlsbad)% larutan sodium piruvat (@nvitrogen 1ife Te+hnologies% 7arlsbad) dan larutan buffer #-$%-hydroxyethyl&-'-pipera(ineethanesulfonic acid (/<*<0) (@nvitrogen 1ife Te+hnologies% 7arlsbad). Pemeriksaan aktivitas se# NK sitotoksik Kemampuan sel NK untuk melisiskan sel-sel tumor K()& diukur pada sampel *9C7 dan 0el NK terisolasi dengan flo' +ytometer sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya 3)4. *ada a'alnya% sel-sel efektor diberi label *aul Karl /oran (*K/) -&) (0igma-Aldri+h% 0t 1ouis) dan dikombinasikan dengan sel target K()& ( 1G1,( sel ? ml) pada tiga efektor dengan rasio target (&(D1% (,D1 dan 1,,D1) untuk menentukan hubungan respon dosis antara jumlah sel K()& yang dilisiskan oleh sel NK efektor. 0etiap sampel dibuat duplikat dan sampel kontrol K()& disertakan. 0el-sel diinkubasi selama - jam pada suhu "$I 7 dengan (H 7J &. 0etelah inkubasi% ) amino - actinomycin D ($ - AA2) (92 9ios+ien+es % 0an 8ose) dan fluorescein isothiocyanate (>@T7) AnneGin K (92 9ios+ien+e % 0an 8ose ) ditambahkan untuk menentukan jumlah sel-sel K()& yang apoptosis pada >A70 B 7alibur flo' +ytometer (9e+ton 2i+kinson 3924 >A707alibur% 0an 8ose). 0ebanyak 1,.,,, kejadian dianalisis dan jumlah kejadian di masing-masing regio

digunakan untuk menentukan aktivitas sel NK sitotoksik sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya 3)4. Pe$arnaan %ntrase#u#er Protein Litik *e'arnaan intraseluler digunakan untuk mendeteksi keberadaan perforin% :r5 A dan :r59 di dalam sel NK 3 1$ 4. 0ampel kontrol dan sel K()& yang distimulasi (&(D1) dengan *9C7 atau sel NK ( 1G1, ) sel?ml) dibuat duplikat dan dimasukkan dalam inkubator pada suhu "$I 7 dengan (H 7J& selama - jam. 0etelah inkubasi* fluorochromecon+ugated monoclonal antibodi ditambahkan untuk pe'arnaan permukaan 72 (+luster differentiation) yang spesifik untuk sel NK . Fntuk sampel perforin dan :r5A % ditambah 721) >@T7 dan 72() phy+oerythrin (*<) ditambahkan ke sampel :r59. Antibodi monoklonal% perforin *< % *< dan :r5A :r59 >@T7 (929ios+ien+es% 0an 8ose) ditambahkan ke setiap sampel untuk dianalisa pada flo' +ytometer. 0ebanyak 1,.,,, kejadian dianalisis pada setiap sampel untuk menentukan persentase gated lymphocytes 72() L ?721) L dan protein-protein litik. Pengukuran Degranu#asi dan %nter&eron 'amma <kspresi sel NK pada 721,$a diukur sebagai marker untuk degranulasi dan pe'arnaan intraseluler yang menentukan produksi @>N - A 3&4. 721,$a dan @>N B A memerlukan penambahan monensin (92 9ios+ien+e % 0an 8ose) untuk men+egah degradasi 721,$a dan 9refeldin A (92 9ios+ien+e % 0an 8ose) untuk menghambat eksositosis @>N - A 3& % 64. *9C7 dan sel NK (1G1, )+ells?ml) distimulasi dengan sel-sel K()& (1G1,(?ml) dengan rasio &(D1 atau 1,ng?ml phorbol 1& - miristat 1" B asetat (*CA) (0igma - Aldri+h % 0t 1ouis) dan 1Mg?ml ionomy+in (@) (0igma - Aldri+h %0t 1ouis) 31 % &4 . 721,$a >@T7 ditambahkan ke semua sampel untuk mendeteksi sel NK yang terdegranulasi . 0ampel dibuat duplikat dan diinkubasi pada suhu "$I 7 dengan (H 7J & selama ) jam . 0etelah inkubasi% ditambah 72() *< (92 9ios+ien+e %0an 8ose) dan pe'arnaan intraseluler menentukan produksi @>N -A. 0ebanyak 1,.,,, kejadian dikumpulkan dan dianalisis pada aliran flo' +ytometer untuk menentukan persentase gated lymphosytes positi"e 721,$a dan @>N - A .

Ana#isa Statistik Analisis statistik telah diselesaikan pada :raph*ad *;@0C (versi )). Fji independent sample T digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan yang signifikan antara pria dan 'anita pada >97 dan uji 7-rea+tive protein. 0ebuah pengukuran analisis varian berulang (ANJKA) pada dua variabel dependen dilakukan pada kumpulan data dari pengukuran lisis K()&% protein litik dan 721,$a?@>N-A. 9onferroniiNs multiple +omparison mengidentifikasi signifikansi dimana nilai * kurang dari ,%,( . Korelasi 0pearman mengidentifikasi setiap hubungan yang signifikan antara mekanisme yang merangsang apoptosis dan aktivitas sitotoksik yang ditentukan oleh lisis K()&. HAS%L Karasteristik partisipan Kriteria inklusi dari studi ini telah ditentukan oleh tes >97 dan 7 reaktif protein. *eningkatan yang signifikan (p.,.,() dari sel darah putih% mono+ytes% sel darah merah% haemoglobin% haematokrit dan konsentrasi +orpus+ular haemoglobin yang dibandingkan antara laki-laki dan perempuan (table 1) Peningkatan aktivitas NK (e## ("toto)ic di P*M(s Aktivitas NK +ell +ytotoGi+ telah ditentukan oleh jumlah dari sel K()& yang apoptosis dan lisis. 2i dalam sampel *9C7% peningkatan effe+ter rasio target% menyebabkan peningkatan yang signifikan (p.,.,1) dari aktivitas NK +ell +ytotoGi+ ketika rasio &(D1% yang dibandingkan dengan (,D1 dan 1,,D1 (figure 13A4). Tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada aktivitas +ytotoGi+ dalam sampel NK sel yang diisolasi (figure &394). *erbandingan aktivitas +ytotoGi+ dengan perbedaan rasio di *C97 dan NK sel yang diisolasi menunjukan tidak adanya perbedaan yang signifikan (data tidak ditunjukan). *erkurangn"a #isis protein NK se# di PM*( *erforin% :r5A dan :r59 dalam NK sel telah ditemukan di sampel (>igure & 394) dan NK sel yang diisolasi (>igure & 374). *rotein lisis telah dibandingkan di kontrol dan sampel yang distimulasi K()&% dan hasilnya tidak ada perubahan yang signifikan. <kspresi dari protein lisis lebih tinggi pada NK sel yang diisolasi.

Peningkatan degranu#asi NK se# dan Stimu#asi ikutan %+N,NK sel telah distimulasi untuk degranulasi dan menghasilkan @>N-A. *erbandingan antara sel yang distimulasi K()& dan sampel +ontrol menunjukan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ekspresi 721,$a dan @>N-A (>igure "394). Ketika hasil dari sel yang distimulasi *CA?@ dibandingkan dengan sampel +ontrol% didapatkan peningkatan yang signifikan (p.,.,() dalam ekspresi 721,$a dan @>N-A baik dalam *9C7 maupun sampel NK sel yang diisolasi. Kore#asi antara mekanisme apoptosis NK se# dan aktivitas c"toto)ic Korelasi yang signifikan ditemukan antara NK sel perforin dan aktivitas +ytotoGi+ di &(D1 (table &). *ada NK sel yang distimulasi dengan K()&% korelasi yang dignifikan juga ditemukan antara protein lisis (perforin% :r5A and :r59) dan ekspresi 721,$a. PEM*AHASAN Aktifitas sitotoksik merupakan suatu proses yang penting untuk menjaga kesehatan karena menjamin terhapusnya sel Bsel yang terinfeksi kuman patogen dan sel B sel yang berubah menuju keganasan. *enelitian terbaru yang dilakukan menguji mekanisme induksi apoptosis pada jalur aktivitas sitotoksik sel NK% untuk menentukan sebuah tolok ukur tambahan mengenai fungsi efektor sel NK. /asilnya menunjukkan bah'a perforin se+ara signifikan berkorelasi dengan aktivitas NK. *emeriksaan kesehatan rutin yang dilakukan pada populasi peserta tidak mengidentifikasi adanya variabel pengganggu yang dapat mempengaruhi proses pengukuran aktivitas sitotoksik dari sel NK. 0ementara itu terdapat beberapa perbedaan signifikan rerata antara pria dan 'anita yang diamati menggunakan parameter B parameter >97% hal ini mungkin dapat terjadi karena adanya perbedaan gender yang disebabkan oleh variasi genetik dan adanya tiga orang 'anita pada populasi yang menderita anemia. Aktifitas sitotoksik sel NK pada populasi yang sehat dalam penelitian ini konsisten pada nilai -1%1# 1(H seperti yang telah dilaporkan dalam literatur. ;espon dosis tersebut berkorelasi dengan peningkatan rasio target disebabkan oleh meningkatnya *9C7 yang signifikan. /al ini juga berhubungan dengan sitotoksik dan degranulasi% sehingga kita mungkin dapat menggunakannya sebagai tolok ukur tambahan untuk aktivitas sitotoksik dari sel

peningkatan aktifitas sitotoksik yang signifikan. *ada sel NK yang terisolasi% peningkatan efektor pada target rasiotidak berpengaruh signifikan terhadap aktifitas sitotoksik. /al ini mungkin dapat dijelaskan dengan adanya pengaturan ketat pada sel NK untuk berhenti sesaat % yang mana hal ini akan men+egah pe'arisan penyakit autoimun. *rotein litik adalah mekanisme yang mengaktivasi apoptosis% yang dilepaskan oleh butiran B butiran sitotoksik sel NK. 9ila dibandingkan dengan sampel B sampel *9C7% pada sel NK terisolasi terdapat peningkatan perforin% :r5A dan :r59 yang signifikan. *enurunan level protein litik pada sampel *9C7 mungkin karena mun+ulnya limfosit lain termasuk makrofag% sel T dan sel 9. 72() dari sel NK meliputi 1(#6H dari total limfosit dalam darah% yang mana hal ini juga meneyebabkan penurunan protein litik dalam sampel *9C7 Jleh karena itu% bila dibandingkan dengan total populasi limfosit dalam peredaran darah perifer% hanya ada beberapa sel NK yang tersedia yang dapat berubah menjadi lebih sedikit lagi protein litik. Fntuk memperoleh efek sitotoksik%sel-sel NK ini butuh diaktifkan dari fase istirahat. 2egranulasi merupakan suatu langkah penting yang diperlukan untuk melepaskan protein litik dari granul sekresi dalam sel NK. Tidak ada perbedaan yang signifikan. Aktivitas sitotoksik sel NK Telah diamati antara ekspresi 721,$a dan produksi @>N gamma dalam sampel *9C7 dan sel NK terisolasi. 0timulasi sel NK oleh *CA ?@ yg diregulasi oleh 721,$a dan @>N gamma. *CA adalah pengganti diasilgliserol (2A: ) %salah satu protein adaptor yang dibutuhkan untuk aktivasi protein kinase 7. @onomy+in adalah kalsium ionofor selektif yang meningkatkan kadar kalsium intraseluler. Jleh karena itu% kombinasi *CA ?@ memfasilitasi aktivasi protein kinase 7 dan masuknya kalsium intraseluler% yang merupakan signaling untuk degranulasi. *erforin dalam sel NK se+ara signifikan berkorelasi dengan aktifitas sitotoksik dan degranulasi. Kedua korelasi tersebut bersifat negatif% menunjukkan bah'a penurunan perforin berhubungan dengan peningkatan degranulasi dan aktivitas sitotoksik. 1iteratur mendukung adanya korelasi antara ekspresi 721,$a dan pengeluaran perforin% lebih jauh lagi menekankan pentingnya ekspresi 721,$a sebagai penanda untuk aktifitas sitotoksik dari sel NK. Tidak ada korelasi yang ditemukan antara ekspresi 721,$a dan lisis sel NK pada sel B sel K()&. 1iteratur juga menyebutkan adanya korelasi positif antara ekspresi 721,$a dengan aktifitas sitotoksik dari sel NK. <kspresi 721,$a pada sel NK dari

populasi penelitian ini mungkin tidak berhubungan dengan aktifitas sitotoksik% menga+u pada rasio &(D1 yang digunakan. *ada kisaran rasio yang lebih rendah% mulai dari 1D1 dan 1,D,1 telah dilaporkan sebagai rasio yang optimal untuk mendeteksi ekspresi 721,$a. Korelasi antara pelepasan perforin dengan lisis sel tumor dan degranulasi menunjukkan bah'a perforin mungkin dapat digunakan sebagai indikator tambahan terhadap fungsi efektor sel NK. 2imana perforin adalah sebuah protein litik yang dilepaskan oleh sel NK untuk menginduksi apoptosis terhadap sel target% pengukuran perforin mungkin bermanfaat dalam kepentingan klinis untuk mengidentifikasi defisiensi ? kelemahan ? penyakit yang mempengaruhi aktifitas sitotoksik.

Keterangan 'ambar :ambar 1D Aktivitas NK sel sitotoksik dalam sampel *9C7(A) dan sel NK yang terisolasi (9). *lot kotak menunjukkan lisisnya sel NK dari sel K()& pada tiga rasio. Kotak me'akili untuk setiap ratio interEuartile range (@O;)% dan menunjukkan distribusi data. :aris tengah di setiap kotak me'akili nilai median. P 2enotes 0ignifi+an+e (PP p.,%,1 dan PPPp .,%,,1). :ambar & D *rotein litik dalam sel NK. 7ytometry figures mengalir dari sampel sel NK yang terisolasi (A) me'akili jumlah 72()L?721)L sel NK yang mengekspresikan perforin% :r5A dan :r59. *rotein litik dalam sampel *9C7(9) dan sampel sel NK yang terisolasi (7) tidak menunjukkan perbedaan stimulasi patogen yang signifikan. 2ata disajikan sebagai mean#standard error mean. :ambar " D 721,$a dan @>N-A pada *9C7 dan 0el NK yang terisolasi. Aliran 7ytometry me'akili gambaran sel NK dari sampel *9C7 mengekspresikan 721,$a dan @>N-A (A). 2alam sampel kontrol% 1%&&H dari limfosit mengekspresikan721,$a dan @>N-A. Ketika sel-sel tersebut dirangsang dengan sel K()& dan *CA?@% jumlah sel NK yang mengekspresikan 721,$a dan @>N-A ditingkatkan menjadi 1(%6- dan 1 %),H se+ara berturut-turut. @O; pada sampel sel *9C7 dan sel NK meningkat dari kontrol ke sel K()& dan *CA? @ yang telah terangsang (9). Nilai rata-rata untuk sampel di'akili oleh garis ditengah kotak. P2enotes 0ignifi+an+e (p .,%,()

. :ambar 1

:ambar &

:ambar "

Tabel 1 D *arameter darah dan 7-rea+tive protein subyek penelitian. /asil disajikan sebagai sarana # standar deviasi dari analisis diferensial lima bagian dari leukosit% jumlah sel darah merah dan parameter hematologis. P Cenunjukkan perbedaan yang signifikan (p .,%,(). Ma#es 1, ).)-1 # 1.- ".)6" # ,. &6 &.,&6 # ,.-$,.((6 # ,.1&$ ,.&6- # ,."), ,.,6 # ,.,"$ (."$, # ,.-", 1().-,, # 6.161 ,.--( # ,.,&) 6".,6, # ".66 & .&-, #1.$", "(1. ,, # $.-$( 11.)), # ,."(" ,.( # ,."&+ema#es (.&1) # ,.)(" &. $$ # ,. (( 1.)") # ,.-$, ,."($ # ,.116 ,.1), # ,.,$ ,.1(6 # ,.&&, -.$)" # ,.&$$ 1"6.111 # 11.$"1 ,.-,$ # ,.,"6(.(() # ).)1 & .,$6 # &.- 1 "" .(() # ).( 6 1&.)11 # 1.1-, ,.6& # ,.) P .a#ue ,.,1$P ,.1&1 ,.,6 ,.,,&P ,.""1 ,."-, ,.,,&P ,.,,1P ,.,1"P ,."&6 ,.6$, ,.,,1P ,.," ,."6-

Total *arti+ipants (N) Qhite blood +ells (G1, ?1) Neutrophils (G1, ?1) 1ympho+ytes (G1, ?1) Cono+ytes (G1, ?1) <osinophils (G1, ?1) 9asophils (G1, ?1) ;ed 9lood 7ells (G1,1&?1) /aemoglobin (g?1) /aemato+rit (1?1) Cean +orpus+ular volume (f1) Cean +orpus+ular haemoglobin (pg) Cean +orpus+ular haemoglobin +on+entration (g?1) ;ed +ell distribution 'idth (H) 7 rea+tive protein (mg?1)

Tabel & D Korelasi signifikan diidentifikasi antara mekanisme apoptosis sel NK dan aktivitas sitotoksik. *erforin se+ara signifikan berkorelasi dengan aktivitas sel NK sitotoksik dan ekspresi 721,$a / -,.-)$ -,.($1 -,.()1 -,.(") P va#ue ,.,-,.,& ,.,,.,-&

*erforinR 7ytotoGi+ A+tivity *erforinR 721,$a :r5AR 721,$a :r59R 721,$a