Kloning Langsung dari Gen Xilanase dari Mata Air Panas PAWAN - RIAU

Sebuah gen fungsional yang mengandung Open Reading Frame (OR?) Encoding 0-1, -
endo!ylanase glycosyl "eluarga hidrolase 11 di"loning langsung mengguna"an me#agenomic
$%R-"loning me#ode dari sampel &usim Semi $a'an (o# di Riau) *en #erdiri dari +,
nu"leo#ida, di"ode"an un#u" ,1- asam amino) .ru#an analisis asam amino mengguna"an
/01S2 menun3u""an bah'a gen memili"i homologi yang #inggi (4-5) dengan gen !ilanase
dari /acillus sub#ilis) *en menun3u""an fungsinya "e#i"a subcloned men3adi 6e"#or e"spresi dan
die"spresi"an pada E) coli) E"s#ra" "asar en7im re"ombinan memili"i a"#i6i#as un#u" 180 .lml
pada 90 :%) (asil ini 'or"sho'ed bah'a pende"a#an me#agenomic adalah me#ode cu# "ua#
pende" un#u" mendapa#"an re"ombinan bio"a#alis yang berguna un#u" apli"asi indus#ri)
PENDAHULUAN
;-1, -Endo!ylanases (<ylanases) (E% -),)1)=)) adalah en7im yang meng"a#alisis
pembelahan #ulang punggung !ilan pada usia 1- #au#an "arbon secara #era#ur un#u"
menghasil"an !ilosa dan !ylooligosaccharides) <ilanase adalah en7im pen#ing un#u"
bio#e"nologi, "arena merupa"an salah sa#u en7im !ilanoli#i" yang dapa# menurun"an !ilan,
men3adi 7a# yang berguna seper#i !ylose) <ilan adalah second ma3or limbah dunia polimer
berlimpah) <ilanase 3uga merupa"an en7im yang men3an3i"an un#u" menggan#i penggunaan
ling"ungan berbahaya "imia di indus#ri "er#as (>ul"arni e# al) 1444))
/eberapa peneli#i #elah diisolasi, dimurni"an, dan di#andai !ylanases mi"roba dan 3uga
"loning gen mengguna"an pende"a#an "lasi" dengan 3enis mi"roba murni (2su3ibo e# al, 1448?)
%hang e# al ,00?)) (uang e# al ,009)) Sayangnya, me#ode "on6ensional, ba#as analisis
mi"roorganisme yang #umbuh di ba'ah "ondisi labora#orium (%o'an e# a @) ,009)) Aumlah sel
mi"roorganisme pro"ario#i" di bumi diper"ira"an mencapai 10
-0
, dan #erdiri dari an#ara 10
+
dan
10
=
spesies #erpisah (%o'an ,000)) Bari "eragaman ini, hanya 15 dapa# dibudidaya"an dan #elah
sudah dipela3ari dengan mengguna"an pende"a#an budidaya "lasi" (1mann e# al) 1449)) Oleh
"arena i#u, "ami "ehilangan mi"roorganisme uncul#urable yang menempa#"an 445 dari populasi
mi"roorganisme dalam biosfer) &ere"a #e#ap sebagai sumber daya yang belum dimanfaa#"an
un#u" gen baru yang berguna un#u" indus#ri (%o'an e# a @) ,009)) >e#i"a #arge# a"hir adalah
un#u" mendapa#"an en7im arecombinan#, s#andar me#ode mi"robiologi "on6ensional "adang-
"adang men3adi rumi#) (al ini disebab"an para peneli#i harus mela"u"an :penyaringan ganda:
yai#u, penyaringan #arge# isola# dii"u#i dengan penyaringan gen #arge#, beruru#an) Balam #ulisan
ini, mengambil gen !ilanase re"ombinan fungsional mengguna"an pende"a#an me#agenomic
digambar"an) Balam s#udi ini, saya langsung mencapai gen !ilanase dari sampel BC1
ling"ungan dari ma#a air panas $1D1C (Riau, Endonesia), yang merupa"an sumber daya
po#ensial dari gen en7im #ermofili") *en i#u diambil melalui sua#u $olymerase %hain Reac#ion
($%R)-"loning, ma"a subcloned "e dalam 6e"#or e"spresi pE2101@B-2O$O dan a#as disa3i"an
dalam E)coli)
BAHAN DAN METDE
S#rain /a"#eri, $lasmid, dan &enengah) Aenis ba"#eri yang diguna"an sebagai hos# un#u"
amplifi"asi plasmid dan e"spresi adalah E) coli B(9 sebuah (Sony Suhandono, Bepar#emen
/iologi, Ens#i#u# 2e"nologi /andung) dan E) coli /0,1 bin#ang (ln6i#rogen), masing-masing)
$lasmid yang diguna"an dalam peneli#ian ini adalah p*E&-2 mudah ($romega) dan pE2101@B-
2O$O 6e"#or e"spresi (En6i#rogen)) $ara agar-agar 1,95 0/ medium yang mengandung
an#ibio#i" dan <-gal@E$2* diguna"an un#u" sele"si E) coli menyimpan plasmid re"ombinan)
1gar 0/ medium yang mengandung an#ibio#i" dan 0,95 Oa#-spel# !ilan diguna"an un#u"
"onfirmasi dari e"spresi gen pada E) coli)
!a"#ling dan E$stra$si DNA Ling$ungan%
Sampel yang diguna"an dalam pe"er3aan ini adalah campuran lumpur dan air yang
di"umpul"an dari ma#a air panas $a'an di Riau dengan suhu se"i#ar 99 F % dan p( se"i#ar =)
Sampel diambil dimasu""an "e dalam bo#ol s#eril) Sampel disimpan pada suhu F%, a#au - =0F%
un#u" penyimpanan lama) BC1 &e#agenomic die"s#ra"si dari 9 (basah) me#ode sampel sayap yg
diusul"an oleh Ghou (Ghou e# al)144+) dengan beberapa modifi"asi) $rosedur ini dimodifi"asi
oleh pembe"uan dan pencairan sebelum e"s#ra"si) Sampel dicair"an dicampur dengan buffer
e"s#ra"si BC1 (mengandung 100 m& 2ris-(%E, 100 m& na#rium EB21, dan 100 m& na#rium
fosfa#, 1,9 & Ca%l, dan %21/ 15), panas, dan "emudian die"s#ra"si dengan SBS 105)
>on#aminan pro#ein dihapus oleh "loroform @ isoamyl al"ohol, ma"a BC1 men#ah
diendap"an dengan isopropanol) BC1 men#ah die"s#ra" "emudian dimurni"an lebih lan3u#
mengguna"an *ene /ersih >i# (H-/iogene, .S1), rendah leleh agarosa (En6i#rogen), a#au "olom
car#ridge ($romega)) BC1 die"s#ra"si dianalisis mengguna"an ele"#roforesis gel agarosa 0,=5)
Selain e"s#ra"si me#hd diusul"an oleh Ghou e# al) (144+), e"s#ra"si BC1 mengguna"an 2anah
persiapan >i# (H-/iogene) 3uga dila"u"an) Re"ayasa *ene#i" $ercobaan) $ro#o"ol dalam
percobaan re"ayasa gene#i"a dila"u"an berdasar"an pro#o"ol s#andar (Sarnbroo" I Russel
,001)) Sebelum analisis !ilanase, amplifi"asi rBC1-1+ dila"u"an un#u" memeri"sa "emampuan
dari BC1 die"s#ra"si sebagai #empla#e) BC1 die"s#ra"si dan dimurni"an "emudian diguna"an
sebagai #empla#e un#u" $%R mengguna"an 9J-112*%* *%% *%112* 22211* 222111
11*11222% 2-- Jsebagai primer for'ard dan 9J-*% 2%21*1 221 %%1 %1% 2*2 1%
*22 1*11%2 2 --J sebagai membali""an primer) $rimer dan 2aKpolymerase yang dibeli dari
En6i#rogen dan primer yang spesifi" un#u" endo!ylanase "eluarga hidrolase glycosyl 11 sebagai
hasil dari "eselarasan "eluarga !ilanase dari /acillus 11) 2aK polimerase "ondisi $%R adalah 4
F% selama #iga meni# un#u" mulai panas, ma"a 9 de#i", 9, F % 1 meni#, 8, meni# ,F% selama -0
si"lus mengguna"an pengendara sepeda 2ermal (Eppendorf)) BC1 plasmid yang mengandung
gen di"onfirmasi di family !ilanase 11 dari /acilluslicheniform #egang 19 di p/1B @ g1EE 6e"#or
#erpilih sebagai "on#rol posi#if) $enanda BC1 yang diguna"an adalah 1 "b BC1 #angga dengan
berbagai u"uran dari 100 bp - 1, "bp (En6i#rogen)) Bo"umen#asi ele"#roforesis agarosa dila"u"an
dengan mengguna"an perala#an *eldoc (>oda"))
$rodu" $%R dengan u"uran dipredi"si "emudian dipo#ong dan dimurni"an dengan *ene
/ersih >i#, incuba#eda# 8, :% selama -0 meni# un#u" menambah"an adenines #ambahan (1) pada
a"hir -J-produ" $%R, "emudian diligasi "e 6e"#or p*E&-2 mudah di F % semalam) %ampuran
ligasi diguna"an un#u" men#ransformasi E)coli B(9 L mengguna"an ampisilin dan pu#ih @ biru
penyaringan)
>lon posi#if ma"a dianalisis dengan mengguna"an en7im res#ri"si EcoRE dibeli dari
En6i#rogen) >lon posi#if menyembunyi"an u"uran dipredi"si dise"uensing dan dianalisis) Sa#u
seKuencing gen "emudian, subcloned "e 6e"#or 3uara pE2101@B-2O$O mengguna"an bu"#i
membaca amplifi"asi $%R dengan polimerase $F. ($romega) di ba'ah "ondisi $%R yang sama
#api #anpa lang"ah mulai panas) $rimer ma3u diguna"an dalam membaca bu"#i $%R 9J-%1%%
12* 22211* 22211111*112-- J, sedang"an primer sebali"nya adalah sama dengan
amplifi"asi 2aK-$%R per#ama) 0igasi "emudian di#ransformasi"an "e E) coli B(9 L, dan gen
!ilanase penampungan posi#if plasmid dipilih) $lasmid ini "emudian berubah lagi "e E) coli /0,
saya bin#ang mengguna"an ele"#roporasi (*ene pulser, /iorad)) >oloni posi#if dengan 7ona
bening diperi"sa di 0/ Spel# mengandung Oa# !ilan (0,95) un#u" mengama#i a"#i6i#as !ilanase)
Bioin&or"ati$a Analisis Gene Xilanase%
BC1 plasmid dise"uensing di $usa# $eng"a3ian /io#e"nologi, /$$2) .ru#an BC1
!ilanase peng"odean dianalisis mengguna"an "roma dan *ene#y! soil'are) $encarian un#u"
"esamaan dalam nucleb#ides dan asam amino dila"u"an mengguna"an program /01S2 di
h##pM@@l''')ncbi)nlm)nih)go6) *en "emudian diserah"an "e *en/an", 1meri"a Seri"a#) 1nalisis
beberapa uru#an dila"u"an melalui h##pM@@''')genome)ad)3p ser6er) *en-gen !ilanase yang
diguna"an dalam analisis "eselarasan beberapa adalahM /)lichenformis (1ccessionCumber 11GE
8-=8), $aenibacillus macerans (menuru# /il 11G18-=+)), /acillus amyloliKuefaciens (menuru#
/il 11GE 8-==)), 9) circulans (menuru# /il) 11&0=-+0), /) sub#ilis (menuru#
Cum)%11=,8+), dan 2hermobacillus!ylanily#icus (menuru# /il %1A=8-,9))) $ep#ida sinyal
seper#i yang diper"ira"an mengguna"an h##pM@@''')cbs)d#u)d"ser6er
Re$o"'inan Persia#an En(i" dan En()"e Assa)%
>oloni E) coli /0,1 bin#ang yang berisi !ilanase re"ombinan posi#if dibudidaya"an pada
90 0/ ml mengandung ampisilin, dan pada OB
+00
N 0,+, E$2* di#ambah"an dan budidaya
dilan3u#"an selama empa# 3am) Sel adalah pelle# dengan sen#rifugasi dan disuspensi"an dalam 9
,0 m& p( fosfa# ml penyangga 8 mengandung 1 mercap#oe#hanol m&, dan #erganggu dengan
soni"asi on-off selama lima meni#) E"s#ra" "asar yang mengandung en7im re"ombinan diperoleh
"embali dengan sen#rifugasi (1-)000 rpm)) <ilanase a"#i6i#as diu"ur (sampel dalam rang"ap dua)
berdasar"an me#ode &iller mengguna"an asam diii#rosalicilic un#u" mende#e"si gula peredu"si
(&iller 1494?) /ailey e# al 144,) pada "isaran suhu an#ara -0 dan 80 O %) Sa#u uni# a"#i6i#as
!ilanase didefinisi"an sebagai 3umlah en7im un#u" menghasil"an 1 umol dari !ilosa per meni# di
ba'ah "ondisi percobaan)
HA!IL
>eberhasilan pende"a#an me#agenomic #ergan#ung pada "emurnian BC1 die"s#ra"si dari
ling"ungan) BC1 die"s#ra"si dari $a'an-Riau air panas #anpa pemurnian lebih lan3u# #ida" bisa
memberi"an produ" amplifi"asi $%R) /eberapa pro#o"ol pemurnian seper#i mengguna"an
"ar#rid "olom a#au agar-agar pencairan dila"u"an, namun pemurnian hanya dengan *ene /ersih
>i# memberi"an hasil yang "onsis#en) E"s#ra"si BC1 dari sampel ling"ungan yang sama dengan
mengguna"an 2anah >i# BC1 E"s#ra"si, #anpa perala#an lisis dire"omendasi"an, memberi
bersih BC1 (*ambar 1a)) Camun, #anpa menghasil"an BC1 u"uran besar dan memberi"an
amplifi"asi nega#if dalam percobaan 1+S rBC1 amplifi"asi "arena u"uran #erfragmen#asi)
E"s#ra"si BC1 dari ling"ungan b sampel) mengguna"an me#ode yang diusul"an oleh BC1 Ghou
ga6egenomic bai" dalam bera# mole"ul #inggi dan dalam u"uran #erfragmen#asi (*ambar 1b))
Camun, diberi"an pi#a amplifi"asi $%R produ" #eru#ama pada u"uran yang sama dengan predi"si
sa#u (se"i#ar +90 bp) (Ed *ambar)) Aadi, un#u" con#oh ini, Ghou e# al) (144+) me#ode memberi"an
hasil yang lebih bai" dibanding"an dengan "i# BC1 #anah e"s#ra"si) Sebuah gen yang disebu#
!yn $D= di"loning langsung dari sampel ini "emudian berhasil subcloned "e dalam 6e"#or
e"spresi pE2101@B-2O$O) Eni #elah di"onfirmasi sebagai gen fungsional, yang memberi"an
re"ombinan posi#if E) coli /0,1s#ar dengan a"#i6i#as !ilanase (*ambar ,)) 1"#i6i#as !ilanase
re"ombinan dalam e"s#ra" "asar se#elah gangguan sel adalah 180 . @ ml pada suhu 90 O %
(*ambar -)) *en ini $D= !ilanase memili"i OD mengandung +, bp nu"leo#ida yang
di"ode"an ,1 - asam amino (*ambar )) *en yang diperoleh dalam pe"er3aan ini #elah
disampai"an "e *en/an" dengan 1cc) /il) BH===,-,) $ara of#hegene "on#en *% adalah 1
sedang"an massa mole"ul dihi#ung dan #i#i" isoele"#ri" ($E) dari produ" gen adalah ,-)-,- Ba
dan 4,=9 (#ermasu" pep#ida sinyal), masing-masing) (omologi asam amino ini !ilanase
re"ombinan dengan o#her!ylanases dianalisis sebagai sho'nin *ambar 9) Eni gen !ilanase $D=
memili"i perbedaan dalam 1- asam amino dari yang !ilanase /) sub#ilis a#au memili"i homologi
iden#i#as 4-5) 1cidnumber amino 1 sampai dengan -0 orang seper#i yang diper"ira"an sebagai
pep#ida sinyal didasar"an pada ser6er predi"si sinyal pep#ida (h##pM@@''')cbs)d#u)d"))
PEMBAHA!AN
E"s#ra"si BC1 ling"ungan dan "loning gen !ilanase langsung fungsional dila"sana"an)
Bua me#ode pende"a#an me#agenomic dila"u"an, yang per#ama adalah pende"a#an uru#an-based
($%R-"loning) dengan hasil se"uens BC1, dan yang "edua adalah pende"a#an berbasis
fungsional (me#agenome perpus#a"aan) dengan hasil "lon fungsional (%o'an e# al ,00))) Balam
"arya ini, "ami memilih pende"a#an per#ama un#u" menemu"an gen !ilanase dari sampel pegas
Riau panas, "arena memili"i beberapa "eunggulan) $ercobaan $%R-"loning pende"a#an #ida"
#erlalu rumi# dibanding"an dengan perpus#a"aan me#agenome) E#u nyaman dan rela#if bu"an
me#ode mema"an 'a"#u) Camun, hanya mendapa#"an gen parsial dan banya" pu#a#if gen en7im
#anpa a"#i6i#as en7im #erbu"#i, men3adi "erugian dari pende"a#an "loning $%R) /ah"an, ada
"urang me#agenomic BC1 3umlah di habi#a# yang lebih e"s#rim) Oleh "arena i#u, saya saran"an
bah'a "loning $%R adalah pilihan #erbai" un#u" pemanfaa#an gene#i" ling"ungan dari sumber
air panas) $ende"a#an me#agenomics dapa# diguna"an un#u" menge"splorasi menemu"an en7im
dan me#aboli# se"under seper#i amilase, es#erase, dan an#ibio#i" (*illespie e# al ,00,?) Pun e# al
,00?) Rhee d"" ,009))) Balam peneli#ian, sampel berlimpah diguna"an un#u" e"s#ra"si BC1
me#agenomic) Balam "arya ini, Saya mela"u"an $%R-"loning gen !yEanase langsung dari
$a'an-Riau sampel air panas ling"ungan)
Saya #erfo"us pada gen !ilanase "arena memili"i apli"asi bio#e"nologi banya" dengan
rela#i6e #inggi nilai-nilai e"onomis (>ul"ami e# al) 1444)) 0angsung "loning gen !ilanase dari
nyali manusia dila"u"an oleh (ayashi e# al) (,009) dan dari usus rumen oleh 0iu eral) (,009))
Sunnah and/ergKuis# (,00-) menggambar"an $%R-"loning dari BC1 ling"ungan dari "olam
panas di Selandia /aru) $eneli#ian mere"a dilapor"an langsung "loning gen !ilanase dari sampel
me#agenomic mengguna"an $%R-mirip "loning pende"a#an) Camun, dalam ma"alah mere"a,
mere"a melapor"an berbagai 3enis !ilanase) Sunnah dan /ergKuis# (,00-1, dan also0iu e# al
(,009) gen !ilanase #erpencil mili" "eluarga hidrolase glycosyl 10 mengguna"an primer
degenera#e), Sedang"an (ayashi e# al) (,009) gen #erisolasi dari "eluarga !ilanase = yang mere"a
dinya#a"an sebagai !ilanase baru) Saya primer spesifi" yang dirancang dan diguna"an un#u"
"eluarga !ilanase 11) Eni primer spesifi" gen menu#upi "eseluruhan (OD) dari gen !ilanase
Sebenarnya, yang lain meroso# primer un#u" gen !ilanase lain 3uga dirancang dan di#erap"an "e
dalam amplifi"asi $%R)) Camun, hanya primer spesifi" !ilanase "eluarga 11 (!yn 11)
memberi"an hasil posi#if dalam percobaan) %on#oh penggunaan se# primer spesifi" yang "husus
un#u" lipase ba"#eri dan ni#ril hydra#ase subuni#-uru#an dalam memper"ua# e"s#ra" BC1
me#agenomic dan mendapa#"an fragmen gen pu#a#if digambar"an oleh %o'an "elompo"
sebelumnya (%o'an e# al) ,009)) Camun, mere"a hanya berhasil sampai dengan gen pu#a#if
#e#api #ida" mela"u"an gen fungsional e"sperimen) uru#an BC1 dari s#udi ini memberi"an ORF
penuh #anpa pergeseran frame dan memili"i inisiasi ser#a s#op "odon Oleh "arena i#u,) dari uru#an
BC1 dapa# dipredi"si bah'a BC1 adalah gen fungsional) $redi"si ini #erbu"#i bah'a e"s#ra"
"asar en7im re"ombinan menun3u""an a"#i6i#asnya pada "isaran suhu an#ara -0-80 F % dan
a"#i6i#as #er#inggi pada 99 F % (*ambar -)) suhu op#imum adalah sama dengan suhu habi#a#
$emurnian dan "ara"#erisasi lebih lan3u# dari !ilanase re"ombinan seper#i #hemos#abili#y dan
profil p( adalah masih) (asil peneli#ian menun3u""an bah'a "eluarga endo!ylanase 11 mung"in
en7im mana-mana) dan disebar"an secara luas di an#ara mi"roorganisme dihuni ma#a air panas)
Se3a" homologi ini !ylanases me#agenomic sanga# #inggi un#u" !ilanase dari /) subfilis (se"i#ar
iden#i#as asam amino 4-5), i#u meramal"an bah'a di mana-mana i#u se#ida"nya di an#ara
spesies /acillus) mana-mana gen encoding lipase1 an#ara spesies /acillus yang hidup di habi#a#
#anah digambar"an oleh Rui7 e# al) (,00-) Bengan demi"ian, fenomena yang sama dapa#
di#emu"an dalam "eluarga !ilanase 11 spesies /aciCus)) (ipo#esis ini 3uga didu"ung oleh hasil
/01S2 yang menun3u""an ini gen !ilanase "eluarga 11 sudah sanga# sanga# diles#ari"an di
daerah C-#erminal (a#au 'ilayah pep#ida sinyal) dan %-#erminal maupun di uru#an asam amino
in#ernal yang an#ara spesies /aciCus (*ambar 9)) S#udi "loning langsung !ilanase gen dari
sampel ling"ungan masih #erba#as, dan ini s#udi saa# ini mung"in men3adi con#oh per#ama dari
"loning langsung gen !ilanase dari habi#a# #ermal bahasa Endonesia) Bengan mengguna"an
pende"a#an "loning langsung dari sampel ling"ungan af, saya berhasil mendapa#"an !ilanase
re"ombinan cepa# dari i#u dari pende"a#an "on6ensional "arena i#u,) #erbu"#i bah'a pende"a#an
me#agenomic adalah cara yang sanga# po#ensial dan lebih cepa# un#u" mendapa#"an gen baru
"eduanya dan produ" mere"a)