1

PENENTUAN V
maks
DAN K
M
ENZIM TRIPSIN DALAM MENGKATALISIS
HIDROLISIS KASEIN
Kadek Anggra Suprapta
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha
Email: Dekanggra5@gmail.com
Abstract
The purpose of this lab is to determine Vmax and KM for incubation time 20 minutes and 0
minutes is determined by using the graph the relationship between enzymatic reaction rate and
substrate concentration. In this experiment, the measurement of enzyme levels is to measure the
speed of the reaction dikatalisisnya. Enzyme reaction velocity is highest when the reaction
product is not yet formed. The reaction proceeds through the formation of enzyme-substrate
complex. If all enzymes are in a state of the enzyme is saturated with substrate, the reaction rate
reaches a maximum value (V
max
). The method used is a quantitative analysis method which
provided ten test tubes already containing casein solution, trypsin, phosphate buffer and TCA
with different compositions. From the experimental results and analytical calculation of K
M
and
for V
maks
enzymatic reaction with the enzyme trypsin and casein substrates with t = 0 min and t
= 20 min, respectively, 0.0436 mg/mL and 1.343 mol/min
Keywords: Enzyme, V
max
, K
M
, casein.
1. PENDAHULUAN
Enzim merupakan suatu protein yang
mempunyai struktur tiga dimensi tertentu
yang mampu mengkatalisis reaksi biologik
(aktivitas biokatalitik). Enzim dapat
meningkatkan laju reaksi karena dengan
adanya enzim maka reaksi yang terjadi akan
mempunyai energi aktivasi lebih rendah
daripada reaksi biasanya. Enzim membantu
reaksi dalam menyediakan jalur reaksi yang
memiliki energi aktivasi lebih rendah untuk
transisi substrat menjadi produk dibandingkan
dengan proses tanpa katalis, sehingga enzim
sering disebut sebagai katalisator.
Enzim sebagai katalisator mempunyai
sifat-sifat seperti katalis pada umumnya.
Enzim ikut bereaksi namun pada akhir reaksi
enzim kembali dalam bentuk semula. Hal
tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai
kembali setelah melaksanakan aktivitasnya,
sehingga tubuh tidak memerlukan enzim
dalam jumlah besar. Jumlah atau kadar enzim
yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan
tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar
enzim, sehingga memerlukan teknik yang
rumit. Secara klinis, pengukuran kadar enzim
sangat penting untuk dilakukan (Tika, 2010).
Laju reaksi awal (V
0
) dari reaksi
yang dikatalisis oleh enzim meningkat dengan
bertambahnya konsentrasi substrat hingga
tercapai keadaan dimana penambahan substrat
tidak lagi meningkatkan laju reaksi awal.
Keadaan dimana laju reaksi awal maksimum
(V
maks
) dicapai pada kondisi substrat jenuh.
Hal ini dapat dijelaskan dengan postulat reaksi
sebagai berikut, dimana E, S, dan P masing-
masing adalah enzim, substrat, dan produk
reaksi
E + S
k
1
k
2
ES
k
3
k
4
E + P
Reaksi berlangsung melalui pembentukan
kompleks enzim-substrat (ES). Kompleks ES
dapat berdisosiasi lagi untuk membentuk
enzim ataupun substrat atau membentuk
enzim dan produk. Konstanta kecepatan K
1
,
K
2
dan K
3
menunjukkan kecepatan yang
berhubungan dengan masing-masing tahap
proses katalitik. Dari pengamatan terhadap
2
beberapa sifat-sifat enzim, diketahui bahwa
kecepatan awal (V
o
) pada konsentrasi substrat
yang rendah akan berbanding lurus dengan
[S]. Namun pada kondisi dimana kecepatan
substrat yang tinggi, maka akan memiliki nilai
maksimum dimana kecepatan tidak lagi
bergantung pada substrat. Bila semua enzim
berada dalam keadaan ES (enzim dijenuhkan
oleh substrat atau semua sisi aktif enzim
sudah mengikat substrat), maka laju reaksi
akan mencapai nilai maksimum (V
maks
).
Kecepatan disosiasi produk dari enzim dan
penambahan substrat lebih lanjut tidak akan
mempengaruhi V
0
(Tika, 2010).
Pengaruh konsentrasi substrat adalah jika
konsentrasi substrat dinaikkan dua kali, maka
kecepatan reaksi awal (V
o
) meningkat dua kali
lipat. Pada konsentrasi tinggi, peningkatan
konsentrasi substrat akan menyebabkan
perubahan V
o
sangat kecil dan pada
konsentrasi substrat yang sangat tinggi,
peningkatan konsentrasi substrat tidak akan
mempengaruhi harga V
o
(harga V
o
konstan).
Keadaan ini disebabkan karena enzim telah
dijenuhkan oleh substrat. Kecepatan reaksi
meningkat sesaat konsentrasi substrat
ditingkatkan sampai pada suatu titik dimana
enzim dikatakan jenuh dengan substrat.
Kecepatan reaksi secara keseluruhan
tergantung pada kecepatan disosiasi produk
dari enzim, dan penambahan substrat tidak
akan mempengaruhi V
o
. Plot V
o
terhadap [S]
berbentuk hiperbolik. Biasanya enzim diuji
pada pH tinggi (optimum), pada suhu kisaran
25
o
C sampai 35
o
C dan pada konsentrasi
substrat mendekati jenuh. Pada keadaan ini
laju reaksi biasanya sebanding dengan
konsentrasi enzim, sedikitnya pada kisaran
tertentu (yaitu linier kurva laju reaksi sebagai
fungsi dari konsentrasi enzim). Perhatikan
gambar 1.
Gambar 1. Hubungan Konsentrasi Enzim dan V
o
Plot Langsung
Kecepatan maksimum (V)
Kinetic Zero-order (Fase II)
Campuran kinetic zero dan
first-order
V
0
V
max
V
max
Kinetic Zero-order (Fase I)
K
S
3
Gambar 2. Hubungan 1/V
o
dan 1/[S] plot Lineweaver Burk
Menurut Michaelis dan Menten, dan
kemudian Briggs dan Haldane, reaksi tersebut
digunakan untuk menurunkan persamaan
matematik yang menggambarkan hubungan
antar laju reaksi awal dan konsentrasi substrat.
Adapun persamaan Michaelis dan Menten, V
adalah Kecepatan reaksi enzim dengan kadar
substrat [S], K
M
adalah tetapan Michaelis
(mol/Liter), dan V
maks
adalah kecepatan
maksimum enzim. yang dimaksud adalah
sebagai berikut.
j
j S K
S V
V
M
maks
+
=
0
, maka
j
maks maks
M
V S V
K
V
1 1 1
0
+

.
|

\
|
=
y =
0
1
V
, x =
j S
1
, a =
maks
M
V
K
, dan b =
maks
V
1
2. METODE
Pada praktikum kinetika reaksi enzim
yang dilakukan pada tanggal 4 April 2012 di
Laboratorium Kimia Organik Universitas
Pendidikan Ganesha. Adapun alat yang
digunakan terdiri dari pipet tetes, gelas kimia
100 mL, gelas kimia 500 mL, batang
pengaduk, gelas ukur 250 mL, pipet volumetri
5 mL, corong, erlenmeyer 100 mL, spatula,
termometer 100
o
C, penjepit kayu, kaca arloji,
rak tabung reaksi, 1 buah alat sentrifugasi dan
1 buah alat instrument UV-VIS. Sedangkan
bahan yang digunakan terdiri dari larutan
TCA 20%, larutan kasein, larutan buffer fosfat
0,1 M, larutan tripsin, larutan NaOH 0,5 M,
reagen folin coicalteu, aquades, kertas saring
secukupnya dan kertas indikator secukupnya.
Prosedur kerja darlam eksperimen ini
adalah sebagai berikut: Disediakan 10 buah
tabung reaksi. Setiap tabung ditambahkan
larutan kasein, buffer dan tripsin dengan
konsentrasi yang berbeda yang ditentukan
berdasarkan tabel di bawah ini.
[S]=0,5 K
M
Slope=K
M
/V
max
[S]= K
M
1/V
Max
-1/K
M
1/[S]
1/V
0
4
Tabel 1. Komposisi tabung reaksi
Larutan /
tabung
1 (mL) 2 (mL) 3 (mL) 4 (mL) 5 (mL)
t= 20 menit
Kasein 0,1 0,5 1 3 5
Buffer posfat 5,9 5,5 5,0 3 1
Tripsin 1 1 1 1 1
T= 0 menit
Kasein 0,1 0,5 1 3 5
Buffers
posfat
5,9 5,5 5,0 3 1
Tripsin 1 1 1 1 1
Waktu Inkubasi 20 Menit
Larutan kasein 1% diinkubasi dalam
tabung reaksi selama 5 menit pada 35
o
C,
kemudian ditambahkan larutan buffer pospat
dan larutan tripsin sambil diaduk perlahan-
lahan. Kemudian diinkubasi selama 20 menit
pada penangas air dengan suhu 35
o
C dihitung
mulai enzim ditambahkan. Reaksi dihentikan
dengan 3 mL penambahan larutan TCA 20%
yang disertai dengan pengadukan yang kuat.
Selanjutnya, didiamkan selama 30 menit
dalam air es agar pengendapan protein dan
tripsin dapat berlangsung dengan sempurna.
Setelah itu, larutan disentrifugasi selama 10
menit lalu disaring. Filtrat yang diperoleh lalu
dikerjakan menurut metode Anson, dimana
filtrate diambil sebanyak 2 mL lalu
ditambahkan 4 mL NaOH 0,5 M dan reagen
cioceltau. Kemudian didiamkan selama 10
menit. Masing-masing larutan yang berada
pada tabung reaksi diukur absorbansinya
dengan menggunakan spektrofotometer.
Waktu Inkubasi t = 0 menit
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan
larutan buffer dan larutan enzim. Kemudian
ditambahkan 3 mL larutan TCA 20% lalu
diaduk kuat dan terakhir ditambahkan larutan
kasein 1% sebanyak 5 mL. Kemudian,
diinkubasi selama 20 menit pada penangas air
dengan suhu 35
o
C dihitung mulai enzim
ditambahkan. Setelah itu, diambil sebanyak 2
mL filtrat kemudian ditambahkan 4 mL
NaOH 0,5 mL lalu ditambahkan reagen folin-
cioceltau dan diamkan selama 10 menit.
Selanjutnya, masing-masing larutan dalam
tabung diukur absorbansinya dengan
menggunakan alat spektrofotometer.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam percobaan ini dilakukan pengujian
kinetika reaksi enzim. Kinetika reaksi enzim
ini ditentukan dengan harga V
maks
dan K
m
.
Harga V
maks
dan K
m
ini ditentukan dengan
cara membuat grafik hubungan antar laju
reaksi terhadap konsentrasi substrat. Dalam
percobaan ini yang digunakan sebagai substrat
adalah larutan kasein dan menggunakan
enzim tripsin. Tripsin merupakan enzim
proteolitik, dimana enzim ini akan
mengkatalisis hidrolisis ikatan peptida pada
kasein.
5
Gambar 3. Aktivitas Enzim Proteolitik
Sebelum dilakukan pengujian terlebih
dahulu disedikan sepuluh tabung reaksi yang
telah diisi dengan larutan kasein, tripsin dan
buffer asetat dengan konsentrasi yang
berbeda-beda. Kemudian diberi dua macam
perlakuan berbeda. Lima dari sepuluh tabung
reaksi diberikan waktu inkubasi 0 menit dan
lima tabung reaksi lainnya diberi perlakukan
inkubasi selama 20 menit.
Kemudian untuk tabung reaksi dengan
perlakuan inkubasi selama 20 menit, terlebih
dahulu dilakukan inkubasi awal selama 5
menit pada suhu 35
o
C. Tujuan dari proses
inkubasi ini adalah untuk mengkondisikan
substrat pada suhu yang optimal (35
o
C).
Setelah itu ditambahkan dengan buffer pospat
(pH =8,0) dan larutan tripsin. Penambahan
buffer pospat ini bertujuan untuk memberikan
faktor psikologis agar enzim dapat bekerja
secara maksimum, dan penambahan larutan
tripsin ini bertujuan untuk mengkatalisis
reaksi hidrolisis ikatan peptida yang ada pada
albumin. Larutan selanjutnya diinkubasi
selama 20 menit, dimana pada inkubasi ini
memungkinkan terikatnya enzim tripsin
dengan substrat. Setelah proses inkubasi
selesai dilakukan, larutan ditambahkan larutan
TCA 20% dan disertai dengan pengadukan.
Tujuan dari penambahan larutan TCA ini
adalah untuk menghentikan aktivitas enzim
tersebut, sehingga dapat dianalisis pengaruh
konsentrasi substrat terhadap laju reaksi
enzimatis. Terhentinya aktivitas enzim karena
penambahan TCA ini dibuktikan dengan
terbentuknya warna kuning kecoklatan pada
kelima tabung reaksi yang merupakan hasil
denaturasi protein dari albumin dan enzim
tripsin. Kemampuan TCA untuk
menghentikan aktivitas enzim ini disebabkan
karena larutan TCA bersifat asam dan mampu
menurunkan pH larutan sehingga dapat
mendenaturasi protein baik pada tripsin
maupun kasein.
Setelah endapan terbentuk, larutan
disentrifugasi selama 10 menit dan kemudian
dilakukan penyaringan. Filtrat yang diperoleh
kemudian dikerjakan dengan metode Anson
dimana sebanyak 2 mL filtrat diambil lalu
ditambahkan dengan 4 mL larutan NaOH 0,5
M dan reagen folin cioceltau. Reagen ini
dapat direduksi oleh gugus fenolik pada asam
amino tirosin yang ada pada filtrat
menghasilkan tungstat dan molibdat yang
berwarna biru. Kemudian dilakukan
pengukuran absorbansi dengan menggunakan
alat instrument UV-VIS.
Untuk larutan dengan waktu inkubasi
selama 0 menit, ada sedikit perbedaan
prosedur kerja. Dimana dalam kelima tabung
reaksi ini terlebih dahulu ditambahkan buffer
posfat kemudian larutan tripsin dan larutan
TCA. Setelah mengalami proses inkubasi baru
kemudian ditambahkan dengan larutan kasein
dengan volume yang berbeda-beda. Setelah
itu dilakukan pengukuran absorbansi dengan
menggunakan UV-VIS. Adapun hasil
pengukuran absorbansi disajikan dalam tabel
di bawah ini
6
Tabel 1. Absorbansi pada masing-masing tabung reaksi
No Tabung A
A
(A
t=20menit
A
t=0menit
)
I
t = 0 menit
0,114
0,012
t = 20 menit
0,126
II
t = 0 menit
0,101
0,02
t = 20 menit
0,121
III
t = 0 menit
0,113
0,012
t = 20 menit
0,125
IV
t = 0 menit
0,074
0,068
t = 20 menit
0,142
V
t = 0 menit
0,151
0,05
t = 20 menit
0,201
Larutan albumin telur 1% dibuat dengan
melarutkan 5 mL albumin telur ke dalam 500
mL akuades. Massa 5 mL albumin telur
adalah 5175 mg, sehingga konsentrasi
albumin telur adalah:
mL mg
mL
g
kasein / 10
100
1
] [ = =
Konsentrasi kasein pada masing-masing
tabung reaksi dapat dihitung dengan
menggunakan rumus pengenceran yaitu V
1
M
1
= V
2
M
2
Tabung I
mg mL
S
mL mg S
mL mg
mL
mL mg mL
M
/ 993 , 6
] [
1
/ 0,143 ] [
/ 0,143
7
/ 10 1 , 0
2
=
=
=

=
Tabung II
mg mL
S
mL mg S
mL mg
mL
mL mg mL
M
/ 400 , 1
] [
1
/ 714 , 0 ] [
/ 0,714
7
/ 10 5 , 0
2
=
=
=

=
Tabung III
mg mL
S
mL mg S
mL mg
mL
mL mg mL
M
/ 700 , 0
] [
1
/ 1,428 ] [
/ 1,428
7
/ 10 0 , 1
2
=
=
=

=
Tabung IV
mg mL
S
mL mg S
mL mg
mL
mL mg mL
M
/ 234 , 0
] [
1
/ 4,286 ] [
/ 4,286
7
/ 10 0 , 3
2
=
=
=

=
Tabung V
mg mL
S
mL mg S
mL mg
mL
mL mg mL
M
/ 139 , 0
] [
1
/ 7,143 ] [
/ 7,143
7
/ 10 0 , 5
2
=
=
=

=
Untuk mengetahui V
0
pada masing-
masing tabung dapat diturunkan dari
persamaan berikut. Absorbansi dirumuskan
sebagai berikut.
bC A =
dengan b merupakan suatu konstanta
sehingga b = k. Oleh karena itu, A = k.C
7
dimana A merupakan absorbansi dan C adalah
konsentrasi. Berdasarkan persamaan tersebut,
maka A ~ C,
kecepatan dirumuskan sebagai
0
0
] [
t
C
V =
karena A ~ C, maka
0
0
t
A
V =
Karena t
0
adalah tetap (t = 0 menit dan t = 20
menit), maka V
0
= A sehingga
0
1 1
V A
=
Harga A, A, 1/A dan 1/[S] dapat
disajikan pada pada table 2
Berdasarkan data pada tabel 2, dapat
dibuat kurva hubungan 1/V
0
terhadap 1/[S].
Tabel 3. Nilai A, A, 1/A dan 1/[S]
No Tabung A A 1/A 1/[S]
I
t = 20 menit
0,126
0,012 83,333 6,993
t = 0 menit
0,114
II
t = 20 menit
0,121
0,020 50,000 1,400
t = 0 menit
0,101
III
t = 20 menit
0,125
0,012 83,333 0,700
t = 0 menit
0,113
IV
t = 20 menit
0,142
0,068 14,705 0,234
t = 0 menit
0,074
V t = 20 menit
0,201
0,050 20,000 0,139
Gambar 4. Kurva Hubungan 1/V
0
terhadap 1/[S]
Kurva yang dihasilkan antara 1/V
0
dengan 1/[S] menghasilkan garis lurus dengan
persamaan
y = 30,81x + 22,93 ..(1)
Persamaan ketika diidentikkan dengan
persamaan yang dinyatakan Lineweaver-Burk
yaitu
maks maks
M
o
V
1
[S]
1
V
K
V
1
+

.
|

\
|
=
83.333
50
83.333
14.705
20
y = 30.81x + 22.95
R = 0.314
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8
1
/
V
0
1/[S]
8
Berdasarkan persamaan (1), harga
maks
V
1
merupakan harga saat x = 0, sehingga
y = 30,81x + 22,93
y = 30,81 . 0 + 22,93
y = 22,93
dengan demikian
93 , 22
V
1
maks
=
menit mol V / 0436 , 0
22,93
1
max
= =
Sedangkan titik potong pada sumbu
[S]
1
adalah -
M
K
1
, nilai ini sama artinya dengan
harga saat y = 0, sehingga,
y = 30,81x + 22,93
0 = 30,81x + 22,93
30,81x = -22,93
x = -0,744
dengan demikian
-
M
K
1
= -0,744
K
M
=
0,744
1
= 1,343 mg/mL
Jadi harga V
maks
adalah sebesar 0,0436
mol/menit dan K
m
adalah 1,343 mg/mL.
4. SIMPULAN
Berdasarkan uraian pembahasan di atas
maka dapat disimpulkan harga K
M
dan
V
maks
untuk reaksi enzimatis dengan enzim
tripsin dan substrat kasein dengan t = 0 menit
dan t = 20 menit berturut-turut adalah 0,0436
mg/mL dan 1,343 mol/menit.
5. UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan
kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai
dosen pengampu mata kuliah Praktikum
Biokimia, Kadek Dewi Wirmandianthi, S.Pd,
M.Si, selaku asisten dosen, dan I Dewa
Subamia selaku laboran di Jurusan Pendidikan
Kimia atas masukan dan sarannya sehingga
percobaan ini dapat dilaksanakan dengan baik.
6. REFERENSI
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun praktikum
Biokimia. Singaraja: Universitas
Pendidikan Ganesha
Chairil Anwar, dkk. 1994. Pengantar
Praktikum Kimia Organik.
Yogyakarta: Departemen Pendidikan
dan Kebudayaan
Thenawijaya, Maggy. 1982. Dasar-Dasar
Biokimia jilid 1. Jakarta: Erlangga
Redhana. 2010. Penuntun Pratikum Biokimia.
Singaraja: Universitas Pendidikan
Ganesha
Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II.
Singaraja : Institut Keguruan dan
Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja.
Girindra, Aisyah dan Titin Supriyanti. 1994.
Dasar dasar Biokimia. Jakarta ;
Universitas Indonesia.
Ismono. 1978. Cara-cara Optik Dalam
Analisis Kimia. Diktat. Bandung:
Jurusan Kimia ITB.