BORANG

No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman


I. PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Kultur jaringan(Tissue culture) adalah membudidayakan suatu jaringan
tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya. Juga
Merupakan metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplas, sel,
jaringan dan organ (daun,batang, akar, biji,bunga,buah) dan menumbuhkan dalam
kondisi aseptik (Rahardja 1989). Menurut Nugroho dan Sugito (2004) Bagian
tanaman yang akan dikulturkan disebut eksplan. Jadi eksplan bisa berupa mata
tunas, anthera, batang, daun dan akar yang masih muda dan terdiri dari sel-sel
meristematis, yang mana sel-selnya masih aktif membelah-belah dan apabila
dikulturkan pada media tumbuh yang sesuai secara in vitro, maka eksplan tersebut
akan tumbuh dan berkembang biak menjadi banyak.
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan
diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik
makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat
pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak
buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif
untuk kasus tertentu untuk tanaman. Media Dasar Murashige Skoog (MS) termasuk
media kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap dibandingkan media dasar
lainnya,walaupun demikian perlu ditambah suplemen seperti air kelapa untuk
mendorong pertumbuhan jaringan. Kisaran indeks keasaman (pH) media adalah 5,5
sampai 5,8.
Komposisi dalam media Murashige Skoog meliputi unsur-unsur makro,mikro,
vitamin, gula, asama mino dan zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penting untuk
differensiasi sel. Menurut Marlina (2004) komposisi media yang digunakan dalam
kultur jaringan dapat berbeda jenis bahan kimia atau konsentrasinya. Perbedaan
komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan
eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro. Media Murashige dan Skoog (MS) sering

BORANG
No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman


digunakan karena cukup memenuhi unsure hara makro, mikro, an vitamin untuk
pertumbuhan tanaman

1.2 Permasalahan

Medium MS terdiri dari berbagai macam komponen kimia yang diperlukan
untuk pertumbuhan kimia yang diperlukan untuk pertumbuhan tanaman. Komponen
yang diperlukan tersebut ada yang dibutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit da
nada yang diperlukan dalam jumlah besar. Untuk membuat larutan MS diperlukan
tata cara tertentu untuk mendapatkan medium yang baik dan efisien. Oleh karena itu
perlu dipelajari tentang tata cara pembuatan medium MS yang baik dan sesuai
dengan prosedur yang ada.

1.3 Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari cara pembuatan medium MS
sehingga dapat meningkatkan pemahaman dalam mengembangkan protocol
pembuatan medium MS yang efisien dan aman.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Medium yang baik digunakan untuk kultur jaringan dapat dinilai dari kualitas
fisik zat kimia yang terkandung didalamnya. Beberapa kandungan zat kimia sebagai
komponen utama dapat dibagi menjadi empat kategori yaitu : garam mineral,
substansi organic, zat pengatur tumbuh, dan senyawa alami kompleks. Medium MS
merupakan salah satu jenis medium yang memiliki kandungan senyawa-senyawa
tersebut dan sering digunakan dalam berbagai penelitian kultur jaringan tumbuhan
karena sering memberikan hasil yang memuaskan. Meskipun tidak selalu
memberikan hasil terbaik. Medium MS memiliki banyak macam kandungan garam
mineral yang dapat dibuat secara terpisah, sehingga dapat diatur komposisi yang
diinginkan sesuai dengan jenis tanaman dan tujuan penelitian. Namun pada
kenyataannya, untul menentukan komposisi larutan mineral yang cocok untuk kultur

BORANG
No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman


jaringan tumbuhan, beberapa peneliti yang telah melakukan berusaha membuat
medium kultur yaitu : Gamborg, Heller, Murashige dan Skoog, Knudson dan White.
Medium yang mereka memiliki nama yang sesuai dengan nama penelitinya. (Auge
et al, 1995)
Kualitas fisik yang suatu medium kultur jaringan tumbuhan ditentukan dari
kepadatan medium. Untuk membuat medium yang padat biasanya digunakan agar
dalam jumlah tertentu. Konsentrasi agar yang tinggi akan menyebabkan medium
yang lebih padat daripada medium dengan konsentrasi lebih rendah. Penambahan
konsentrasi agar disesuaikan dengan jenis tanaman dan juga penelitian. Selain itu,
kepadatan medium sangat dipengaruhi oleh keadaan pH medium. Bila pH medium
terlalu rendah, mka medium yang akan terbentuk lebih cair dan bila pH terlalu basa,
maka medium akan keras. Biasanya sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit
asam, berkisar antara 5,5-5,8. (Auge et al, 1995)
Media Murashige & Skoog (media MS)
Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam
anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau.
Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk
NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media
Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi
dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM.
Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur
makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini
sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling
banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah
penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan
media MS tersebut, antara lain media : (Suryowinoto,1991)
1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro
MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM,
sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan
senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk
penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin

BORANG
No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman


& Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam
Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan
1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi
konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi
NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea
glabra.
Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan
persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan
yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit
adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang
mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan,
maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983).
Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur
tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya
belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya
menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang
tetap.
Komposisi dan Fungsi Dasar dalam Media MS : (Sasnawaria, 2005)
a. Air
Air merupakan komponen yang penting di dalam pengkulturan eksplan
karena 95% dari medium mengandung air. Air yang digunakan yaitu air destilasi,
dimana air tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang
dapat merusak proses perkembangan eksplan.
b. Larutan garam anorganik
Tiap tanaman memerlukan setidaknya 6 elemen mikronutrien N, P, K, Mg,
Ca, S, dan elemen yaitu Fe, Mn, B, Mo, Cl. Pereduksi CU
2-
menjadi Cu
-
bermanfaat
pada perkembangan dan perbaikan vitamin adalah bahan yang perlu ditambahkan

BORANG
No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman


sebab tumbuhan yang dikulturkan belum mampu membuat vitamin sendiri, biasanya
yang ditambahakan yaitu vitamin B, asam nukleat, pridosin (vitamin B6).
c. Zat-zat organic
Senyawa organic yang dipakai yaitu karbohidrat yang tersusun atas unsur-
unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama karbohidrat mempunyai fungsi
utama yaitu sebagai sumber energy untuk keseimbangan tekanan osmotic.
Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media : (Sriyanti, 1994)
a. Sterilisasi peralatan
Sterilisasi peralatan (glassware dan logum) dan aquades dilakukan dengan
sterilisasi kering (oven 130
0
c-170
0
c selama 2-4 jam).
Sterilisasi peralatan dengan autoclave dilakukan pada suhu 121
0
c takanan 15 PSI
selama 1 jam.
Sterilisasi peralatan logam (pinset, gunting, jarum) yang digunakan dengan
merendam perakitan tsb dalam alcohol 95% diikuti dengan pembakaran dan
pendinginan.
b. sterilisasi medium kultur
Metode autoclave
Medium dalam botol kultur ditutup dengan alumunium foil pada suhu 121
0
C,
tekanan PSI selama 15-40 menit dari waktu medium mencapai suhu yang
diperlukan.
Metode Filtrasi
Yaitu sterilisasi menggunakan membrane filter berukuran 0,45-0,22 mm di
dalam kontiener steril.
Medium MS yang banyak mengandung senyawa-senyawa organic akan
sangat mudah ditumbuhi berbagai macam mikroorganisme kontaminan seperti jamur
dan bakteri. Oleh karena itu, dalam pembuatan medium ini diperlukan proses
sterilisasi dan cara penyimpanan yang dapat mencegah dan meminimalisasikan
kontaminan tersebut. Untuk itu sterilisasi medium biasanya digunakan aotuclave
dengan suhu 121C dengan tekanan 15psi (1 atm) selama 15 menit (Lestari, 2008)

BORANG
No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman



III. METODE
3.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan yang digunakan yaitu tabel formula dan
bahan-bahan kimia untuk medium MS, universal indikator pH, HCl 1N, dan atau
KOH 1N, Alumunium foil, kertas timbang, tissue, dan tabel, Erlenmeyer 100ml dan
50ml, gelas piala 600ml, gelas ukur 1000ml, Erlenmeyer 1000ml, botol ukur, pipet,
pengaduk, magnetic stirrer dengan hot plate dan magnet, timbangan analitik, dan
autoclave.
3.2 Cara kerja
Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 Liter.
Disiapkan Erlenmeyer 1000ml yang berisi 500ml akuades. Ditimbang setiap
komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan tabel) dan bahan dimasukkan
satu persatu sambil diaduk. Untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu dengan
magnetic stirrer. Kemudian dimasukkan 5ml stok besi, masukkan 1ml stok
makronutrien, masukkan 4ml larutan stok vitamin. Ditimbang 100mg Myo-inositol
dan dimasukkan dalam Erlenmeyer sambil dilarutkan. Ditimbang 30mg sukrosa,
dimasukkan dalam Erlenmeyer dan dilarutkan. Setelah itu ditambahkan akuades
hingga volume mencapai 1000ml. pH diukur hingga berada pada 5,6-6,3 dengan
penambahan HCL atau KOH. Ditimbang agar-agar sebanyak 8gr, dimasukkan
dalam Erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk hingga larut. Dalam keadaan
masih cair, medium tersebut dibagi kedalam botol-botol sekitar 20ml/botol.
Selanjutnya botol ditutup rapat dengan alumunium foil dan diberi label sesuai
perlakuan. Botol dimasukkan kedalam autoclave dan disterilisasi dengan suhu
121C selama 15 menit dengan tekana 15 psi
(1 atm). Setelah tekanan turun sampai 0 atm, medium yang sudah steril segera
dikeluarkan dari autoclave. Jangan menunggu hingga medium dingin dalam
autoclave, karena pemanasan yang berlebih akan merusak medium.


BORANG
No.Dokumen FO-UGM-BI-07-13
Berlaku sejak 03 Maret 2008
LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 00
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI Halaman


DAFTAR PUSTAKA
Auge, R., G.Beaischesne., J. Boccon-Gibbon., L. Decourte., B. Digat., R. Jalouzot.,
R. Minier., J-Cl. Morand., J.P. Reynoird., D.G. Strullu., and H. Vidalie. 1995.
In vitro culture and its application in holtikulture. Science Publishers,Inc. New
Hampshire.
Lestari, E.G. 2008. Kultur jaringan. Penerbit Akademia. Bogor.
Sasnawaria, 2005. Mikrobiologi dasar. Papa sinar sinantris. Jakarta.
Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.
Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi.
Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.