ABSTRAK

Artemisinin merupakan obat antimalaria yang potensial efektif terhadap bentuk-bentuk

resisten multidrug dari malaria Parasit. itu produksi saat artemisinin tidak cukup untuk
memenuhi global permintaan. Pada saat ini studi mikroba biotransformasi arteannuin B,
prekursor biogenetis artemisinin untuk kemudian memiliki diteliti. Skrining studi yang
dilakukan pada beberapa ditanggung tanah mikroorganisme telah menghasilkan satu spesies
baru dengan kemampuan biokonversi. Sel bebas ekstrak kasar budaya lama 72 jam dari
isolat menunjukkan aktivitas biokonversi. Pada inkubasi dengan substrat arteannuin B, sel
mentah ekstrak bebas dari isolat memiliki menunjukkan biokonversi 18,54% menjadi
artemisinin secara molar dengan aktivitas spesifik 0,18 unit / mg.

pendahuluan
MALARIA adalah salah satu yang paling dahsyat menular penyakit penting global dengan
perkiraan jumlah dari 225 juta episode klinis dengan 781.000 kematian pada tahun 2009 [ 1 ]
. Ini penyakit menular merusak manusia disebabkan oleh empat spesies parasit protozoa
genus Plasmodium : Plasmodium falciparum Plasmodium malariae Plasmodium ovale dan
Plasmodium vivax . Plasmodium falciparum merupakan parasit yang paling ganas , dan
menyebabkan besar sebagian besar kasus klinis dan mortalitas [ 2 ] . The mengkhawatirkan
penyebaran resistensi obat telah membuat terapi kombinasi sebaiknya terapi kombinasi
berbasis artemisinin ( ACT ), sebuah pilihan strategis dan layak untuk lebih besar daripada
penyakit [ 3 ] . Artemisinin merupakan obat antimalaria yang potensial dihasilkan dari bagian
udara dari Artemisia annua L ( quinghao ) tanaman milik untuk Asteraceae , herbal aromatik
tahunan , asli dari China [ 4 ] . Artemisinin dan turunannya antara internasional obat diterima
pilihan dalam terapi kombinasi karena mereka cepat bertindak , sangat ampuh dan
melengkapi kelas-kelas lain pengobatan .
Struktur artemisinin ditentukan dengan X-ray analisis pada tahun 1979 [5].
Artemisinin adalah sesquiterpene teroksidasi lakton dengan jembatan endoperoxide unik.
Kegiatan unik yang ditemukan terkait dengan alkilasi malarialspecific protein [6]. Artemisia
annua., L, satu-satunya alam sumber artemisinin menghasilkan jumlah yang sangat rendah
artemisinin dibandingkan dengan itu prekursor biogenetis asam artemisinic dan Arteannuin
[7], [8].
Konsentrasi artemisinin di Artemisia annua sangat rendah, di kisaran 0,01-0,8% [9].
Ini pendek jatuh di produksi artemisinin dapat diatasi dengan alternatif pendekatan seperti
biotransformasi [10]. terdahulu biotransformasi arteannuin-B, untuk artemisinin dilakukan
dengan homogenat daun mentah dari Artemisia annua [11]. itu Penelitian ini berorientasi
pada pencapaian sumber mikroba untuk biokonversi arteannuin-B (Gambar .2), seskuiterpen
a dengan biasa -methylene--lakton [12], [13] untuk artemisinin. Artikel ini terutama
berfokus pada isolasi dan identifikasi peran tanah baru ditanggung Streptomyces sp dalam
biokonversi arteannuin-b terhadap artemisinin.

Metodologi
A. Isolasi Mikroorganisme
Sampel tanah telah dikumpulkan dari rumput dari kampus Institut Teknologi Nasional,
Warangal, Andhra Pradesh, India. Isolasi mikroorganisme dari sampel tanah yang dilakukan
secara terpisah pada media selektif seperti agar nutrien menengah (pH 7,2), potato dextrose
agar media (pH 4,5) dan media ekstrak ragi gliserol (pH 6,8) untuk bakteri, jamur dan
actinomycete budaya masing-masing dengan metode pour plate. Biakan murni isola
dipertahankan dalam gliserol saham. Budaya shake flask dari isolat diuji untuk mereka
kemampuan untuk mengubah arteannuin-B terhadap artemisinin, oleh protokol yang
dijelaskan secara rinci pada bagian selanjutnya. Dari beberapa isolat dipelajari, spesies baru
telah dipamerkan aktivitas biokonversi. Isolat dinobatkan sebagai DBT-5 di laboratorium
kami. Ciri-ciri morfologi dan biokimia karakteristik budaya telah dipelajari.

B.penanaman Of DBT-5
Isolat DBT-5 dikultur dalam ekstrak malt-ragi menengah (ragi ekstrak-4 g, ekstrak malt-10 g,
dan glukosa-4 g suling air 1000 ml pH 7,2) pada suhu 30oC dalam orbital shaker pada
120 rpm untuk 72 jam.

C. Pertumbuhan Versus Biokonversi Kegiatan
The isolate DBT-5 cultured in malt-yeast extract medium (pH-7.2) at 30oC in an orbital
shaker at 120 rpm was harvestedat 8 h interval and the crude cell free extract was assayed for
bioconversion activity.

D. Pembuatan Crude Sel Ekstrak bebas
Proses sel bebas persiapan ekstrak dilakukan pada suhu 4oC. Budaya 72 h tua dipanen
dengan sentrifugasi pada 12000rpm selama 10 menit. Pelet itu dihomogenisasi dengan
penyangga ekstraksi (50mm Tris (PH 7,2), 10mm -mercaptoethanol, 2mm EDTA, 5%
Gliserol dan 10m PMSF) dalam mortar dan alu dengan asam dicuci steril pasir laut sebagai
abrasif. Homogenat disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC.
Supernatan diperoleh pada sentrifugasi digunakan sebagai ekstrak total protein untuk
melaksanakan reaksi biokonversi. Konsentrasi protein dalam ekstrak kasar diperkirakan
dengan metode Lowry [14] dengan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar.

E. Evaluasi AKTIVITAS Enzim
1. Inkubasi Sistem
Pengujian kemampuan biokonversi sel mentah gratis ekstrak dilakukan dengan menginkubasi
campuran 2ml minyak mentah larutan protein, 100g dari arteannuin-B (prekursor), dan co-
faktor 0.1mm ATP, 1.0mm Mg +2 & 1.0mm Mn +2. Itu total volume dari campuran reaksi
dibuat hingga 3 ml dengan Tris (pH 7,2) dan diinkubasi selama 180 menit pada suhu 30oC.
Sebuah kontrol negatif dijalankan paralel ini dengan semua komponen lain kecuali substrat
yaitu prekursor arteannuin-B [11].
2. Ekstraksi artemisinin
Reaksi dihentikan dengan menambahkan etanol dan kloroform di Proporsi 01:01 pada saat
penyelesaian waktu inkubasi. dari campuran reaksi, artemisinin diekstraksi dua kali dengan
heksana dalam corong pisah. Fraksi heksana dikumpulkan dalam gelas pengumpulan terpisah
dan dibiarkan menguap. itu Residu dilarutkan dalam metanol diuji lebih lanjut untuk
kehadiran artemisinin.
3. Deteksi Artemisinin
Artemisinin terdeteksi dengan melakukan lapisan tipis kromatografi (TLC) di piring silika gel
dengan fase gerak etil asetat dan heksana di 02:08 rasio. Artemisinin dan arteannuin-B
terdeteksi dengan menyemprotkan uap yodium.
4. Kuantifikasi Artemisinin
Analisis kuantitatif artemisinin yang dihasilkan oleh biokonversi arteannuin B dilakukan oleh
HPLC [15]. HPLC dilakukan pada Shimadzu - LC-10AT VP Series menggunakan kolom
gerak dari 1% TFA di air: asetonitril (30: 70), dengan laju alir 1 ml / menit. Artemisinin
dimonitor pada 220 nm dengan UV-VIS detektor (Shimadzu UV-Visible SPD-LC 10A VP
Series). itu Sistem kromatografi dikendalikan oleh Spinchrom CFR (versi 2.2) software.
Sampel disaring standar artemisinin (Sigma-Aldrich) (1mg/ml), standar arteannuin B
(1mg/ml) dan ekstrak metanol eksperimental sampel dimuat ke kolom. Waktu retensi untuk
artemisinin adalah antara 6,9 dan 7,1 menit dan dari arteannuin B adalah antara 5,7 dan 5,9
min.

F.Effect pH Dan Suhu Pada Kegiatan Enzim
PH optimum dari reaksi biokonversi dipelajari dengan menginkubasi campuran reaksi pada
pH berbeda dalam kisaran 5-10 dalam buffer sitrat, penyangga fosfat, Tris penyangga dan
sistem penyangga karbonat. optimal suhu untuk biokonversi dianalisis dengan menginkubasi
campuran inkubasi pada temperatur yang berbeda pada kisaran 0oC-60oC. Dalam kedua
kasus di atas aktivitas biokonversi diuji dengan protokol standar yang disebutkan sebelumnya
dan artemisinin yang dihasilkan dalam reaksi dihitung dengan HPLC.

HASIL DAN DISKUSI
Artemisinin merupakan antimalaria yang potensial tetapi penggunaan yang efektif adalah
terhalang oleh produksi yang cukup. Mikroba biokonversi arteannuin-B, prekursor biogenetis
dari artemisinin untuk kemudian akan membentuk satu potensi alternatif dalam meningkatkan
produksi artemisinin. Di antara berbagai isolat tanah dipelajari, spesies disebut sebagai DBT-
5 telah menunjukkan aktivitas biokonversi
Tabel.................................

Sel Crude ekstrak bebas dari budaya dipanen adalah diinkubasi dengan prekursor arteannuin-
B dan co-faktor di suhu 30oC selama 3 jam dalam sistem penyangga Tris (pH-7.2). Produk
akhir diekstraksi dari campuran reaksi yang kualitatif dideteksi dengan kromatografi lapis
tipis. Nilai Rf arteannuin B otentik dan artemisinin adalah 0,4 dan 0,5 masing-masing, yang
memungkinkan untuk resolusi mudah terlihat pada pelat TLC.Artemisinin yang dihasilkan
oleh enzim kasar dalam sampel uji selanjutnya diukur dengan HPLC. Analisis HPLC dari
artemisinin standar (1mg/ml) dan arteannuin B (1mg/ml) dan ekstrak metanol dari sampel uji
dilakukan. Di bawah kondisi percobaan yang ditentukan sebelumnya, waktu retensi dari
artemisinin dan arteannuin B adalah 6,9- 7.1min dan 5,7-5,9 min masing-masing. Profil
HPLC elusi sampel uji telah menunjukkan puncak melengkapi standar arteannuin B dan
artemisinin. HPLC kromatogram sampel percobaan dengan sel mentah ekstrak bebas dari
DBT-5 telah menunjukkan elusi arteannuin B dan artemisinin pada waktu retensi 5.840min
dan 7.13min masing-masing (Gambar 1).
SPQKRTUM/GRAFIK
Gambar. Profile 1 HPLC elusi ekstrak metanol sampel uji
diinkubasi dengan enzim kasar

Sel Crude ekstrak bebas dari DBT-5 telah menunjukkan 18,54% menjadi artemisinin secara
molar dengan aktivitas spesifik 0,18 unit / mg.
KESIMPULAN
Biotransformasi dengan enzim mikroba dapat dari alternatif yang potensial untuk
memproduksi artemisinin dari perusahaan prekursor. Sebuah konversi 18,54% dari
arteannuin-B untuk artemisinin ditunjukkan oleh ekstrak sel mentah bebas dari DBT-5.
Dhingra et al telah melaporkan biokonversi% dari 21,75 dari ekstrak kasar daun Artemisia
annua. Sedangkan di penelitian ini 18,54% biokonversi telah dilaporkan dari ekstrak bebas
sel kasar DBT-5 budaya. Sehubungan dengan jumlah bahan tanaman yang diperlukan untuk
ekstraksi enzim, waktu yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan panen enzim Artemisia
annua dari yang biokonversi 18,54% dilaporkan dari DBT-5 adalah pilihan yang layak untuk
meningkatkan produksi artemisinin.