Deteksi DNA dan Protein

Deteksi DNA Deteksi DNA

(Elektroforesis gel agarosa)
Prinsip : migrasi partikel DNA pada medan
listrik
Pemisahan berdasarkan ukuran (massa
molekul) DNA atau compactness
Gel Agarosa digunakan sebagai media
pergerakan (running) DNA
gumilar
Parameter yang mempengaruhi
laju migrasi DNA
Ukuran molekul : Mr 1/log (Mw) g ( )
Konsentrasi agarosa : log (Mr) 1/[gel]
Konformasi DNA :
l d i l DNA (f I) t i ll closed circular DNA (form-I) - typically
supercoiled (plg cepat)
nicked circular (form-II)
linear DNA (form-III) (plg lambat)
Voltase yang diterapkan (biasanya 5 volt per cm
panjang gel
gumilar
panjang gel
Komponen elektroforesis gel
agarosa
Sampel DNA
A ( l) li k id k l k di k t k Agarosa (gel): polisakarida komplek yang diekstrak
dari rumput laut. Konsentrasi: 0.5 sd 2%
Etbr : agen pengkhelat DNA Etbr : agen pengkhelat DNA
Loading buffer, mengandung pemberat ex : gliserol
Running Buffer: memfasilitasi hantaran arus,
biasanya TAE atau TBE
Marker (penanda DNA)
gumilar
Perlengkapan Perlengkapan
Alat elektroforesis (chamber) ( )
Power suppy
Gel casting trays
Transilluminator (an ultraviolet lightbox),
gumilar
Prosedur elektroforesis Prosedur elektroforesis
Simpan gel pada alat elektroforesis, lalu
tuangkan buffer tuangkan buffer
Mix sampel dengan loading buffer, lalu
masukkan ke sumur yang ada pada gel (hal y g p g (
yg sama dilakukan untuk marker)
Set voltase
Running
Periksa dibawah lampu uv
gumilar
p
Contoh hasil elektroforesis
Deteksi Protein
gumilar
PAGE PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Cara termudah untuk menguji kemurnian protein
Pada PAGE protein dijaga dalambentuk native dan
ktif aktif
Pemisahan didasarkan pada muatan dan ukuran
protein protein
gumilar
A lik i PAGE Aplikasi PAGE
PAGE sangat sensitif thd proses-proses yang PAGE sangat sensitif thd proses proses yang
mempengaruhi konformasi dan muatan dari protein.
Sehingga native PAGE dapat dimanfaatkan sbg alat
t k d t k i untuk mendeteksi:
Perubahan muatan akibat degradasi kimia (ex: deaminasi)
Unfolded atau peristiwa perubahan konformasi lainnya
Oligomer atau agregat
Binding event (protein-protein atau protein ligan)
gumilar
SDS PAGE SDS-PAGE
SDS:
Protein terdenaturasi selama proses
elektroforesis
gumilar
Pemisahan berdasarkan ukuran (BM)
Penentuan berat molekul protein dengan SDS-PAGE