BAB I

PENDAHULUAN
1. A. Latar Belakang
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-
komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida yang terdapat pada tahu, tempe,
bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis, Linderniaanagalis, dan Torenia violacea. Yang pada
senyawa isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelebihan senyawa isoflavon yang potensial
bagi kesehatan manusia,di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker,
antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi
bekerja berdasarkan metode kromatografi.
Kromatografi juga merupakan pemisahan camuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian bahan atau komposisi campuran dengan kandungan
yang berbeda dapat dianalisis dengan benar. Tidak hanyakontrol kualitas, analisis bahan makanan
dan lingkungan, tetapi juga kontrol danoptimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan
analitik dari kuantitasmaterial. Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada
campuran bahan adalah prinsip dasar kromatografi.
Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. Pemilihan teknik
kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan
fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalirmelalui fase diam dan membawa
komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak
pada laju yang berbeda.
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia.
Metode kromatografi, karena pemanfaatannya, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan
preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan
secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari
molekul. Sifat utama yang terlibat ialah :
1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)
2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan)
3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian).
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan dilakukan dengan menggunakan salah satu dari
empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah :
Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (GC) dan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung
pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi
kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam amino dan senyawa fenolat),
KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid,
karotenoid, kinon sederhana dan klorofil), GC penggunannya terutama untuk senyawa atsiri (asam
lemak, mono- dan seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang), cara lain yaitu HPLC, dapat
memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. HPLC adalah suatu metode yang menggabungkan
keefisienan kolom dan kecepatan analisis.
1. B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:
1. Pengertian kromatografi
2. Kromatografi Kertas
3. Kromatografi Lapis Tipis
4. Kromatografi Gas (GC)
5. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
6. C. Tujuan Penulisan
Adapun tujuan penulisan makalah ini adalah:
1. Untuk memenuhi tugas kuliah kimia analitik
2. Untuk mengetahui jenis-jenis kromatografi
3. D. Manfaat Penulisan
1. Untuk menjelaskan kepada pembaca tentang kromatografi
2. Untuk menjelaskan kepada pembaca tentang prinsip kerja setiap jenis kromatografi
3. Untuk memperlihatkan kepada pembaca bentuk dari setiap jenis kromatografi


BAB II
KAJIAN TEORI
1. A. Pengertian Kromatografi
Kromatografi secara harfiah terdiri dari dua kata yaitu cromos yang berarti warna dan graphos yang
berarti tulis. Jadi, kromatografi merupakan suatu metode pemisahan fisik senyawa organik dan
anorganik, yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel di antara dua fase.
Menurut pengertian ini kromatografi selalu melibatkan dua fase, yaitu fase diam (stationary phase)
dan fase gerak (gerak phase atau fase mobil. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang
terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben), sedangkan fase gerak dapat berupa
cairan disebut eluen atau pelarut, atau gas pembawa yang inert. Gerakan fase gerak ini
mengakibatkan terjadinya migrasi differensial komponen-komponen dalam sampel.kromatografi
dibagi diklasifikasikan menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa gerak yang terlibat,
pasangan fasa gerak dan fasa diam, mekanisme pemisahan dan teknik kerja yang digunakan.
1. B. Kromatografi Kertas (KKt)
Kromatografi kertas merupakan bentuk kromatografi yang paling sederhana, mudah dan murah.
Banyak digunakan untuk identifikasi kualitatif penemunya adalah Martri, Consden
dan Gordon.Fasa diam dalam kromatografi ini berupa air yang terikat pada selulosa kertas
sedangkan fasa geraknya berupa pelarut organic nonpolar. Berdasarkan kedua hal itu kromatografi
kertas dapat digolongkan ke dalam kromatografi partisi. Dalam kromatografi kertas fasa gerak
merembes ke dalam kertas karena efek kapiler. Rembesan fasa gerak pada kertas dapat dilakukan
dengan teknik menaik ( ascending ) atau dengan teknik menurun (descending). Pada teknik menaik
rembesan fasa bergerak kea as sedangkan pada pada tekik menurun rembesan fasa gerak bergerak
ke bawah. Pada teknik menurun fasa gerak disamping bergerak karena efek kapiler juga dibantu oleh
efek gravitasi sehingga rembesan berjalan lebih cepat.
Pelaksanaan teknik ini terbagi pada 3 tahap , yaitu :
1. Penotolan cuplikan
2. Tahap pengembangan
3. Identifikasi atau penampakan noda.
Pada tahap penotolan cuplikan, prertama-tama siapkan kertas kromatografi dengan ukuran tertentu .
buatlah garis awal dengan jarak 2-3 cm dengan salah satu ujung kertas dengan menggunakan pensil
( karena pensil terdiri dari satu komponen yaitu kabon sehingga tidak mengganggu migrasi dan
pemisahan komponen sampel). Selanjutnya totolkan larutan cuplikan dengan menggunakan
mikropipet atau pipa kapiler pada garis awal tadi, kemudian keringkan.
Pada tahap pengembangan, ujung kertas kromatogram dekat garis awal berisi totolan cuplikan
dicelupkan ke dalam pelarut ( eluen ) yang terdapat di dalm bejana kromatografi . pencelupan
diusahakan tidak merendam totolan cuplikan atau garis awal. Biarkan eluen merembes melalui
totolan cuplikan. Komponen-komponen cuplikan akan terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan
kelarutan komponen-komponen cuplikan dalam eluen akan mengakibatkan kecepatan bergerak
komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak komponen-
komponen ini lebih umum disebut migrasi diferensial. Hasil pemisahan akan Nampak sebagai noda-
noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda dari garis awal. Noda-noda ini
selanjutnya disebut sebagai kromatogram. Perembesan eluen dihentikan setelah eluen hamper
mencapai ujung kertas. Pekerjaan selanjutnya adalah member tanda batas gerakan eluen, dan
kemudian kertas diangkat dari cairan pengelusi untuk seterusnya dikeringkan. Pada tahap identifikasi
atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan
harga Rf nya. Besaran ini (kependekan dari rate of flow) menyatakan derajat retensi atau factor
refensi. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang
ditempuh oleh eluen (fasa gerak). Rf = jarak yang ditempuh komponen/jarak yang ditempuh eluen.
Setiap komponen mempunyai harga Rf sendiri-sendiri. Bila noda tidak berwarna dapat dilakukan hal-
hal sebagai berikut:
1. Menyemprot kertas dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat,
ammonium sulfide dll.
2. Menyinari kertas dengan sinar ultraviolet
3. Mendedahkan kertas pada uap iodium
4. Menentukan harga Rf nya
Kromatografi kertas sangat berguna untuk pemisahan zat anorganik, organik dan biokimia dalam
jumlah yang sedikit. Sebagai fasa diam umumnya air yang terserap oleh pori-pori kertas. Oleh Karena
itu fasa diam bersifat sedikit polar. Bila diinginkan fasa diam yang lain, maka biasanya kertas akan
dikeringkan, kemudian menggunakan fasa diam seperti glikol, alcohol dll. Jika kertas dilapisi dengan
zat-zat hidrofobik maka kromatografi yang dilakukan adalah kromatografi fasa terbalik ( reversed-
phase-chromatography). Sistem ini berguna untuk pemisahan asam-asam lemak, dan senyawa-
senyawa non polar lainnya, yang mungkin akan terelusi terlalu cepat jika digunakan fasa diam polar
kelarutannya yang rendah.
1. C. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Menurut Rohman, Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada
tahun 1983. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan
elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform)
pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik.
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena
pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi
pada pengembangan secara menurun (descending).
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan
kromatografi kolom. Demikian juga dengan peralatan yang digunakan, dalam kromatografi ini
peralatan yang digunakan lebih sederhana.
Keuntungan kromatografi planar adalah:
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau
dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi
2 dimensi
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan
bercak yang tidak bergerak.
Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu adsorben yang disalutkan pada suatu
lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan kromatogram terjadi ketika fase mobil
tertapis melewati adsorben itu. Seperti dikenal baik, kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan
yang nyata dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan cepatnya, ketajaman pemisahan
yang lebih besar dan kepekaannya tinggi.
Prinsip kromatografi Menurut Stahl mengemukakan kaidah dasar kromatografi jerap yaitu
Hidrokarbon jenuh terjerap sedikit atau tidak sama sekali, karena itu ia bergerak paling cepat.
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina)
merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi
yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan
gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yangberwarna
hijau dan kuningan.
Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yangmerupakan sebuah
campuran dari beberapa zat pewarna.Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis: Sebuah garis
menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran
pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk
menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan
bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan
ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.
Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan
untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan
oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan
beberapa kertas saring yang terbasahioleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-
komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan
akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan
maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase
diam.

Fase Diam KLT
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina)
merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi
yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet.Fase gerak merupakanpelarut atau
campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium
oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang
jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
Fase Gerak KLT
Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan
umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi
antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab
itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan
jumlah umpan.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut
tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina
atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut
yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut
yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika).

Deteksi Bercak
Bercak pemosahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk
penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan
adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga
bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan
pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk
senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat
berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian
bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnyaa akan kelihatan berfluoresensi.
Perhitungan nilai Rf
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan
untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada
jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.Ketika
pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi
pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
1. D. Kromatografi Gas (GC)
GC (Gas Chromatography) yang biasa disebut juga Kromatografi gas (KG) merupakan teknik
instrumental yang dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an. GC merupakan metode yang dinamis
untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-
senyawa gas anorganik dalam suatu campuran Perkembangan teknologi yang signifikan dalam
bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta
identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi
yang meningkat.GC menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya. Ada 2 jenis
kromatografi gas, yaitu :
1. Kromatografi gascair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada suatu
pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam.
2. Kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa
polimerik.
Kromatografi gas mempunyai prinsip yang sama dengan kromatografi lainnya, tapi memiliki beberapa
perbedaan misalnya proses pemisahan campuran dilakukan antara stasionary fase cair dan gas fase
gerak dan pada oven temperur gas dapat dikontrol sedangkan pada kromatografi kolom hanya pada
tahap fase cair dan temperatur tidak dimiliki.
Secara rinci prinsip kromatografi adalah udara dilewatkan melalui nyala hydrogen (hydrogen flame)
selanjutnya uap organik tersebut akan terionisasi dan menginduksi terjadinya aliran listrik pada
detektor, kuantitas aliran listrik sebanding dengan ion.
SISTEM PERALATAN KROMATOGRAFI GAS (GC)
1. 1. Fase gerak
Fase gerak pada GC juga disebut dengan gas pembawa karena tujuan awalnya adalah untuk
membawa solut ke kolom, karenanya gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas
pembawa adalah: tidak reaktif; murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada
detektor; dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (biasanya merah untuk hidrogen, dan abu-
abu untuk nitrogen).
1. 2. Ruang suntik sampel
Lubang injeksi didesain untuk memasukkan sampel ecara cepat dan efisien. Desain yang populer
terdiri atas saluran gelas yang kecil atau tabung logam yang dilengkapi dengan septum karet pada
satu ujung untuk mengakomodasi injeksi dengan semprit (syringe). Karena helium (gas pembawa)
mengalir melalui tabung, sejumlah volume cairan yang diinjeksikan (biasanya antara 0,1-3,0 L) akan
segera diuapkan untuk selanjutnya di bawa menuju kolom. Berbagai macam ukuran semprit saat ini
tersedia di pasaan sehingga injeksi dapat berlangsung secara mudah dan akurat. Septum karet,
setelah dilakukan pemasukan sampel secara berulang, dapat diganti dengan mudah. Sistem
pemasukan sampel (katup untuk mengambil sampel gas) dan untuk sampel padat juga tersedia di
pasaran.
Pada dasarnya, ada 4 jenis injektor pada kromatografi gas, yaitu:
1. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang diinjeksikan akan diuapkan dalam
injector yang panas dan 100 % sampel masuk menuju kolom.
2. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan diuapkan dalam injector
yang panas dan selanjutnya dilakukan pemecahan.
3. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana hampir semua sampel diuapkan dalam
injector yang panas dan dibawa ke dalam kolom karena katup pemecah ditutup; dan
4. Injeksi langsung ke kolom (on column injection), yang mana ujung semprit dimasukkan langsung
ke dalam kolom.
Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap;
karena kalau penyuntikannya melalui lubang suntik secara langsung dikhawatirkan akan terjadi
peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi atau pirolisis.
1. 3. Kolom
Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh
karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada GC. Ada 3 jenis kolom pada GC yaitu kolom
kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column); dan kolom preparatif (preparative
column). Perbandingan kolom kemas dan kolom kapiler dtunjukkan oleh gambar berikut :
Kolom Kemas Kolom Kapiler
Kolom kemas terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium.
Panjang kolom jenis ini adalah 15 meter dengan diameter dalam 1-4 mm. Kolom kapiler sangat
banyak dipakai karena kolom kapiler memberikanefisiensi yang tinggi (harga jumlah pelat teori yang
sangat besar > 300.000 pelat). Kolom preparatif digunakan untuk menyiapkan sampel yang murni
dari adanya senyawa tertentu dalam matriks yang kompleks.
Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase
diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-
5) dan fenil 5%-metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL-8). Fase diam semi polar adalah
seperti fenil 50%-metilpolisiloksan 50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang
polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M) (6).
1. 4. Detektor
Komponen utama selanjutnya dalam kromatografi gas adalah detektor. Detektor merupakan
perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang
membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik
yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal
elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif
terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fase diam dan fase gerak.
Pada garis besarnya detektor pada KG termasuk detektor diferensial, dalam arti respons yang keluar
dari detektor memberikan relasi yang linier dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang
teresolusi. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik komponen-komponen oleh GC
disajikan oleh detektor sebagai deretan luas puncak terhadap waktu. Waktu tambat tertentu dalam
kromatogram dapat digunakan sebagai data kualitatif, sedangkan luas puncak dalam kromatogram
dapat dipakai sebagai data kuantitatif yang keduanya telah dikonfirmasikan dengan senyawa baku.
Akan tetapi apabila kromatografi gas digabung dengan instrumen yang multipleks misalnya GC/FT-
IR/MS, kromatogram akan disajikan dalam bentuk lain.
Beberapa sifat detektor yang digunakan dalam kromatografi gas adalah sebagai berikut :
Jenis detektor Jenis Sampel
Batas
Deteksi
Kecepatan Alir (mL/menit)
Gas
Pembawa
H
2

Udara
Hantaran
Panas
Senyawa
umum
5 100
mg 15 30 - -
Ionisasi
Nyawa Hidrokarbon
10
100 pg 20- 60
30

60
200
500
Penangkap
electron
Halogen
organik,
pestisida
0,05
pg 30 60 - -
Nitrogen
Fosfor
Senyawa
nitrogen
organik dan
fosfat
organic
0,1
10 g 20 40
1
5
700
100
Fotometri
Nyala (393
nm)
Senyawa-
senyawa
sulfur
10
100 pg 20 40
50

70
60
80
Fotometri
Nyala (526
nm)
Senyawa-
senyawa
fosfor
1 10
pg 20 40
120

170
100
150
Foto Ionisasi
Senyawa
yang
terionisasi
dengan UV
2 pg
C/detik 30 40 - -
Konduktivitas
Elektrolik
Halogen, N,
S
0,5 pg
C
12 pg S 20 40 80 -
4 pg N
Fourier
Transform-
Inframerah
(FTIR)
Senyawa-
senyawa
organic
1000
pg 3 10 - -
Selektif
Massa
Sesuai untuk
senyawa
apapun
10 pg
10 ng 0,5 30 - -
Emisi Atom
Sesuai untuk
elemen
apapungas
Pembasa
0,1
20 pg 60 70 - -
1. 5. Komputer
Komponen GC selanjutnya adalah komputer. GC modern menggunakan komputer yang dilengkapi
dengan perangkat lunaknya (software) untuk digitalisasi signal detektor dan mempunyai beberapa
fungsi antara lain:
Memfasilitasi setting parameter-parameter instrumen seperti: aliran fase gas; suhu oven dan
pemrograman suhu; serta penyuntikan sampel secara otomatis.
Menampilkan kromatogram dan informasi-informasi lain dengan menggunakan grafik berwarna.
Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan dengan statistik.
Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa tertentu.
Cara Kerja
Gas pembawa dialirkan dari tangki bertekanan tinggi melalui alat pengatur tekanan yang dapat
menentukan kecepatan aliran gas pembawa yang akan mengalir ke komponen yang lain. Sampel
dimasukkan dalam injektor yang dipanaskan agar sampel berubah menjadi gas dan mengalir ke
dalam kolom. Pada kolom campuran zat penyusun mengalami pemisahan proses partisi pada fase
cair melalui detekor yang mengirimkan signal ke recorder setelah mengalami amplifikasi. Bila sampel
berupa cairan dapat dimasukkan dengan syringe, bila berupa gas melalui katup. Sampel masuk
kedala injektor mengalir dengan gas pembawa masuk kedalam kolom.
Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Gas
Kelebihan
1. Waktu analisis yang singkat dan ketajaman pemisahan yang tingga
2. Dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi
3. Gas mempunyai vikositas yang rendah
4. Kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat sehingga analisis relatif cepat
dan sensitifitasnya tinggi
5. Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam
yang akan memisahkan hampir segala macam campuran.
Kekurangan
1. Teknik Kromatografi gas terbatas untuk zat yang mudah menguap
2. Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar.
Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan pada tingkat gram mungkin dilakukan,
tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika ada metode lain.
3. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat
terlarut.
1. E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
2. A. Prinsip Dasar HPLC
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui
kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di
dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.
Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan
keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas.
Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah
data hasil pengukuran HPLC.
B. Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi
Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu:
1. 1. Fasa Gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda
dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan
fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa
solute melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi
membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan
solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fasa gerak HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan
berikut:
1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.
2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu
interpretasi kromatogram.
3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5) Zat cair tidak kental.
6) Sesuai dengan detektor.
Jenis fasa gerak
Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa
gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat
dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non
interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi
fasa gerak.
1. 2. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk
mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan
dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
4. Bahan tahan korosi
Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu
pompareciprocating, displacement dan pneumatic.
1. Pompa reciprocating
Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut
yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston
berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.
2. Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung
tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan
tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan
pergantian pelarut.
3. Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas
pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi)
serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
4. 3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel
Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan
cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom
dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika
memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke
dalam sistem HPLC :
1. Injeksi Syringe
Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe
disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan
sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan
sering lebih jelek.
1. Injeksi stop-flow
Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara,
sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom.
Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
1. Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk
memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume
cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop, (b)
kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa
cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5
hingga 500L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan
pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5
hingga 5 L.
2. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas
berdinding tebal. Kolom utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi
komponen-komponennya.
3. Detektor
Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi
persyaratan berikut: (1) cukup sensitive; (2)stabilitas dan keterulangan tinggi;(3) respon linear
terhadap solute; (4) waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ;(5)realibilitas
tinggi dan mudah digunakan; (6) tidak merusak cuplikan. Detektor HPLC dikelompokan ke dalam tiga
jenis, yaitu: detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya
solute. Sebaliknya, detektor sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak
dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak
dihilangkan dengan penguapan. Detektor berdasarkan absorpsi UV merupakan detektor HPLC yang
paling banyak di pake. Detektor elektrokimia paling banyak dipakai terutama
dalam HPLC penukar ion.
1. C. Cara Kerja HPLC
Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi
berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan
ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil
pemisahan dideteksi oleh detektor, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat =
recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven
pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa
milliliter per menit.
Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel.
Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali
diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk
analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam
makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang
terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung
dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara
bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18
yang terikat pada silica gel.
D. Kelebihan HPLC
Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High
Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT
diantaranya ialah
1. Dapat dilaksanakan pada suhu kamar.
2. Cepat dan mudah melaksanakannya.
3. Peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik.
4. Pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion.
6. Mudah memperoleh cuplikan.
7. Daya pisahnya baik.
8. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.
9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.
10. E. Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan
HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran
yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi
golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-
komponennya.
HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa
jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di
daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.
Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm),
dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat
diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan.
Cuplikan dapat dipisahkan secara preparatif.
DAFTAR PUSTAKA
Hendayana, Sumar. 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektrolisis Modern,
Bandung: PT. Remaja Rosdakarya