P u r e & A p p ! . C h e m . , V o l . 5 9 , N o . 2 , p p . 2 5 7 2 6 8 , 1 9 8 7 .

P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n .
1 9 8 7 I U P A C
I N T E R N A T I O N A L U N I O N O F P U R E
A N D A P P L I E D C H E M I S T R Y
A P P L I E D C H E M I S T R Y D I V I S I O N
C O M M I S S I O N O N B I O T E C H N O L O G Y *
M E A S U R E M E N T O F
C E L L U L A S E A C T I V I T I E S
P r e p a r e d f o r p u b l i c a t i o n b y
T . K . G H O S E
B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t r e ,
I n d i a n I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , N e w D e l h i - 1 1 0 0 1 6 , I n d i a
* M e m b e r s h i p o f t h e C o m m i s s i o n d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f t h e r e p o r t ( 1 9 8 1 1 9 8 5 ) w a s a s
f o l l o w s :
C h a i r m a n : 1 9 8 1 8 3 H . D e l i w e g ( F R G ) ; 1 9 8 3 8 5 C . L . C o o n e y ( U S A ) ; V i c e - C h a i r m a n : 1 9 8 1 8 3
C . L . C o o n e y ( U S A ) ; 1 9 8 3 8 5 M . R i n g p f e i l ( G D R ) ; S e c r e t a r y : 1 9 8 1 8 3 R . C . R i g h e l a t o ( U K ) ;
1 9 8 3 8 5 G . G . S t e w a r t ( C a n a d a ) ; T i t u l a r a n d A s s o c i a t e M e m b e r s : H . T . B l a c h r e ( F r a n c e ;
T i t u l a r 1 9 8 1 8 3 ) ; V . K . E r o s h i n ( U S S R ; A s s o c i a t e 1 9 8 1 8 3 ) ; A . F i e c h t e r ( S w i t z e r l a n d ; A s s o -
c i a t e 1 9 8 1 8 3 ) ; T . K . G h o s e ( I n d i a ; T i t u l a r 1 9 8 1 8 5 ) ; P . P . G r a y ( A u s t r a l i a ; A s s o c i a t e 1 9 8 3 8 5 ) ;
J . H o l l ( H u n g a r y ; T i t u l a r 1 9 8 1 8 3 ) ; A . E . H u m p h r e y ( U S A ; A s s o c i a t e 1 9 8 1 8 3 ) ; M . L i n k o
( F i n l a n d ; A s s o c i a t e 1 9 8 3 8 5 ) ; R . C . R i g h e l a t o ( U K ; A s s o c i a t e 1 9 8 3 8 5 ) ; G . G . S t e w a r t
( C a n a d a ; A s s o c i a t e 1 9 8 1 8 3 ) ; J . T a k a h a s h i ( J a p a n ; T i t u l a r 1 9 8 1 8 3 ) ; J . E . Z a j i c ( U S A ;
A s s o c i a t e 1 9 8 1 8 3 ) ; N a t i o n a l R e p r e s e n t a t i v e s : R . J . E r t o l a ( A r g e n t i n a ; 1 9 8 1 8 5 ) ; P . P . G r a y
( A u s t r a l i a ; 1 9 8 1 8 3 ) ; H . J . G . W u t z e l ( A u s t r i a ; 1 9 8 1 8 5 ) ; W . B o r z a n i ( B r a z i l ; 1 9 8 1 8 5 ) ;
M . M o o - Y o u n g ( C a n a d a ; 1 9 8 3 8 5 ) ; B . S i k y t a ( C z e c h o s l o v a k i a ; 1 9 8 1 8 5 ) ; K . V o n M e y e n b u r g
( D e n m a r k ; 1 9 8 1 8 5 ) ; H . D e l l w e g ( F R G ; 1 9 8 3 8 5 ) ; M . L i n k o ( F i n l a n d ; 1 9 8 1 8 3 ) ; L . P e n a s s e
( F r a n c e ; 1 9 8 3 8 5 ) ; M . R i n g p f e i l ( G D R ; 1 9 8 1 8 3 ) ; J . H o l l ( H u n g a r y ; 1 9 8 3 8 5 ) ; V . J a g a n n a t h a n
( I n d i a ; 1 9 8 3 8 5 ) ; L . G o l d s t e i n ( I s r a e l ; 1 9 8 3 8 5 ) ; F . P a r i s i ( I t a l y ; 1 9 8 3 8 5 ) ; S . F u k u i ( J a p a n ;
1 9 8 1 8 5 ) ; B . G . Y e o c h ( M a l a y s i a ; 1 9 8 3 8 5 ) ; 0 . I l n i c k a - O l e j i n i c z a k ( P o l a n d ; 1 9 8 1 8 3 ) ; E . G a l a s
( P o l a n d ; 1 9 8 3 8 5 ) ; A . F i e c h t e r ( S w i t z e r l a n d ; 1 9 8 3 8 5 ) ; V . J o h a n i d e s ( Y u g o s l a v i a ; 1 9 8 1 8 5 ) .
R e p u b l i c a t i o n o f t h i s r e p o r t i s p e r m i t t e d w i t h o u t t h e n e e d f o r f o r m a l I U P A C p e r m i s s i o n o n c o n d i t i o n t h a t a n
a c k n o w l e d g e m e n t , w i t h f u l l r e f e r e n c e t o g e t h e r w i t h I U P A C c o p y r i g h t s y m b o l ( 1 9 8 7 I U P A C ) , i s p r i n t e d .
P u b l i c a t i o n o f a t r a n s l a t i o n i n t o a n o t h e r l a n g u a g e i s s u b j e c t t o t h e a d d i t i o n a l c o n d i t i o n o f p r i o r a p p r o v a l f r o m t h e
r e l e v a n t J U P A C N a t i o n a l A d h e r i n g O r g a n i z a t i o n .
M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a s e a c t i v i t i e s
F e r m e n t a t i o n C o m m i s s i o n , I U P A C , ( c h a n g e d t o C o m m i s s i o n o n B i o t e c h n o l o g y ,
J U P A C , J u l y 1 9 8 0 ) p u t i n a c o n s i d e r a b l e e f f o r t a n d t i m e s i n c e J u l y 1 9 7 6 t o p r e p a r e
a d o c u m e n t p r e s c r i b i n g s t a n d a r d a s s a y p r o c e d u r e s f o r c e l l u l a s e e n z y m e s y s t e m .
T h e s u b j e c t a r e a w a s c o n s i d e r e d s i g n i f i c a n t l y i m p o r t a n t b e c a u s e t h e n u m b e r o f
g r o u p s e n g a g e d i n t h e s t u d i e s o f e n z y m a t i c b r e a k - d o w n o f c e l l u l o s e o f v a r i o u s
s o u r c e s w e r e o n s t e a d y i n c r e a s e . A t l e a s t n i n e C o m m i s s i o n m e e t i n g s h e l d d u r i n g
t h e l a s t s e v e r a l y e a r s ( B e r l i n , J u l y 1 9 7 6 ; W a r s a w , J u n e 1 9 7 7 ; M u n i c h , S e p t . 1 9 7 8 ;
D a v o s , S e p t . 1 9 7 9 ; L o n d o n ( O n t a r i o ) , J u l y 1 9 8 0 ; L e u v e n , A u g . 1 9 8 1 ; M I T
( B o s t o n ) , A u g . 1 9 8 2 ; L y n g b y , A u g . 1 9 8 3 & N e w D e l h i , F e b . 1 9 8 4 ) g a v e c o n s i d e r -
a b l e a t t e n t i o n t o t h i s p r o j e c t . S e v e r a l a s p e c t s o f t h e p r o p o s e d s t a n d a r d p r o c e -
d u r e s a v a i l a b l e t o w o r k e r s f o r e n z y m e a n d s u b s t r a t e e v a l u a t i o n w e r e c o n s i d e r e d .
T h e d e t a i l e d t e x t o f t h e d r a f t p r e p a r e d d u r i n g m i d 1 9 8 0 a n d p a r t i a l l y m o d i f i e d i n
e a r l y 1 9 8 2 w e r e d i s c u s s e d b y t h e C o m m i s s i o n a t t h e M I T w o r k s h o p i n 1 9 8 2 . A t
t h e L y n g b y m e e t i n g t h e C o m m i s s i o n g a v e i t s f i n a l r e c o m m e n d a t i o n s o n t h e m a n -
u s c r i p t w h i c h a f t e r s o m e a d d i t i o n a l r e v i e w w a s a d o p t e d a t t h e N e w D e l h i m e e t i n g
i n F e b r u a r y 1 9 8 4 f o r r e l e a s e . S e v e r a l p r o c e d u r e s w e r e s u g g e s t e d i n t h e d r a f t f o r
c o n s i d e r a t i o n o f t h e m e m b e r s o f t h e C o m m i s s i o n a n d o t h e r e x p e r t s i n t h e f i e l d .
T h e f i n a l v e r s i o n o f t h e C o m m i s s i o n ' s d r a f t i s e x p e c t e d t o b e u s e f u l a s a d o c u m e n t
o f s t a n d a r d p r o c e d u r e s f o r a s s a y a n d e v a l u a t i o n o f c e l l u l a s e e n z y m e s y s t e m .
A l t h o u g h f o r a s u b j e c t a r e a s o c o m p l i c a t e d a n d i n v o l v e d l i k e t h e a s s a y p r o c e -
d u r e s o f v a r i o u s e n z y m e s a s s o c i a t e d w i t h c e l l u l o s e - c e l l u l a s e s y s t e m , i t w a s e x -
p e c t e d t h a t t h e c o n c e r n e d g r o u p s a n d i n d i v i d u a l s m i g h t f i n d i t d i f f i c u l t t o a g r e e t o
a c o m m o f f d r a f t . H o w e v e r , t h e m e m b e r s o f t h e C o m m i s s i o n a s w e l l a s o t h e r s w h o
c o l l a b o r a t e d i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e d o c u m e n t f e l t t h e n e e d f o r a w o r k i n g
d o c u m e n t t o f o r m t h e b a s i s o f e x c h a n g e o f i d e a s a n d c o m p a r i s o n o f r e s u l t s . W i t h
t h i s i n v i e w t h e N e w D e l h i m e e t i n g o f t h e C o m m i s s i o n f i n a l l y a p p r o v e d t h e
r e c o m m e n d a t i o n s f o r c i r c u l a t i o n . N e c e s s a r i l y , t h e C o m m i s s i o n w i l l r e v i e w t h e
a s s a y p r o c e d u r e s a s a n d w h e n s o m e n e w i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e .
C o n t e n t s
P r e f a c e
I . I n t r o d u c t i o n
H . G e n e r a l I n f o r m a t i o n
I I I . F o l i n P r o t e i n D e t e r m i n a t i o n
I V . C e l l o b i a s e A s s a y
V . F i l t e r P a p e r A s s a y f o r S a c c h a r i f y i n g C e l l u l a s e
V I . C a r b o x y m e t h y l C e i l u l a s e A s s a y f o r E n d o - 3 - l , 4 - g l u c a n a s e
V I I . A d d i t i o n a l A s s a y P r o c e d u r e f o r E n d o g l u c a n a s e
V I I I . E v a l u a t i o n o f C e l l u l a s e u n d e r P r o c e s s C o n d i t i o n s
I X . G e n e r a l R e m a r k s
R e f e r e n c e s
I n t e r n a t i o n a l C o l l a b o r a t o r s
I . I N T R O D U C T I O N
T h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f c e l l u l a s e e n z y m e s p o s e s s p e c i a l p r o b l e m s t o t h e e n z y m o l o g i s t , w h i c h a r e r a r e l y
e n c o u n t e r e d i n t h e s t u d y o f o t h e r e n z y m e s . H e i s p r e s e n t e d w i t h a s i t u a t i o n w h e r e k i n e t i c s t u d i e s a r e
d i f f i c u l t s i n c e t h e n a t u r a l s u b s t r a t e i s b o t h i n s o l u b l e a n d s t r u c t u r a l l y v a r i a b l e , a n d t h u s r e l a t i v e l y u n d e -
f i n e d w i t h r e s p e c t t o c o n c e n t r a t i o n a n d c h e m i c a l f o r m ; w h e r e o f t e n a . m u l t i t u d e o f e n d o - a n d e x o -
g l u c a n a s e s a c t i n s y n e r g y a n d i n a c o m p l e x m a n n e r s t i l l p o o r l y u n d e r s t o o d ; ' a n d w h e r e a v a r i e t y o f
e n d - p r o d u c t s a n d t r a n s g l y c o s y l a t i o n s p e c i e s a r e f r e q u e n t l y f o r m e d , i n v o l v i n g v a r i o u s m e c h a n i s m s o f
f e e d b a c k c o n t r o l . T h e p r e s e n c e o f / 3 - g l u c o s i d a s e o r o t h e r e n z y m e s , s u c h a s c e l l o b i o s e p h o s p h o r y l a s e ,
w h i c h a r e r e q u i r e d f o r c e l l o b i o s e m e t a b o l i s m a n d t o e n h a n c e c e l l u l o s e h y d r o l y s i s b u t w h i c h a r e n o t ,
s t r i c t l y s p e a k i n g , c e l l u l a s e s , f u r t h e r c o m p l i c a t e s t h e p i c t u r e . M o r e o v e r , t h e r e h a s b e e n c o m p a r a t i v e l y
l i t t l e e l u c i d a t i o n o f t h e d i f f e r e n c e s i n t h e m o d e s o f a c t i o n o f t h e c e l l u l a s e s y s t e m o f v a r i o u s o r g a n i s m s , a n d
e s p e c i a l l y b e t w e e n e u c a r y o t e s a n d p r o c a r y o t e s .
2 5 8
M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a s e a c t i v i t i e s 2 5 9
I n
t h e f a c e o f t h e s e d i f f i c u l t i e s , a n d i n v i e w o f t h e a p p l i e d n a t u r e o f m o s t c e l l u l a s e w o r k , i t i s u n d e r s t a n d -
a b l e t h a t i n v e s t i g a t o r s i n d i f f e r e n t l a b o r a t o r i e s h a v e e a c h d e v e l o p e d a s e r i e s o f e m p i r i c a l a s s a y p r o c e -
d u r e s . W h i l e a c o m m o n a p p r o a c h i s s h a r e d , a s i t u a t i o n h a s n o n e t h e l e s s r e s u l t e d w h e r e c o m p a r i s o n o f
c e l l u l a s e a c t i v i t i e s b e t w e e n l a b o r a t o r i e s i s n o t r e a d i l y m a d e i n a q u a n t i t a t i v e m a n n e r . T h e s e r e c o m m e n d a -
t i o n s f o r s t a n d a r d a s s a y s a r e i n t e n d e d t o a l l e v i a t e t o s o m e e x t e n t t h e p r e s e n t l a c k o f u n i f o r m p r o c e d u r e s
w i t h , h o w e v e r , c e r t a i n r e s e r v a t i o n s .
F i r s t , t h e s e p r o c e d u r e s h a v e r e c e i v e d c o m m o n a c c e p t a n c e p r i m a r i l y f o r t h e e v a l u a t i o n o f t h e c e l l u l a s e
s y s t e m o f T r i c h o d e r m a , a n d p o s s i b l y o t h e r m e s o p h i l i c f u n g a l s p e c i e s . S t u d i e s w i t h c e l l u l o l y t i c b a c t e r i a ,
s u c h a s C l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m o r T h e r m o m o n o s p o r a f u s c a , s u g g e s t t h a t t h e s e c e l l u l a s e s y s t e m s m a y
h a v e a d i f f e r e n t m o d e o f a c t i o n . M o r e o v e r , p H a n d t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s f o r o p t i m a l c e l l u l a s e a c t i v i t y
f r o m t h e s e o r g a n i s m s a r e d i f f e r e n t t h a n t h o s e f o r m o s t f u n g i . T h u s , t h e a s s a y p r o c e d u r e s w i l l o f t e n n e e d t o
b e a d a p t e d t o o t h e r c e l l u l a s e s y s t e m s b y l i n e a r i z i n g w i t h r e s p e c t t o t i m e , s u b s t r a t e a n d e n z y m e c o n c e n t r a -
t i o n , a n d b y p r o p e r s p e c i f i c a t i o n o f p H a n d t e m p e r a t u r e . H o w e v e r , t h e c r i t e r i a o f a s s a y i n g F P A e m p l o y -
i n g f i l t e r p a p e r a s i n s o l u b l e s u b s t r a t e m u s t b e b a s e d o n e q u a l c o n v e r s i o n ( i n t h e p r e s e n t r e c o m -
m e n d a t i o n s 4 % ) s i n c e t h e r a t e s a r e n o t l i k e l y t o b e l i n e a r a n d r e p r e s e n t a t i v e o f t r u e f i l t e r p a p e r a c t i v i t y
( s e e S e c t i o n I I . G e n e r a l I n f o r m a t i o n ) .
S e c o n d , t h e s p e c i f i c a s s a y s w h i c h h a v e b e e n r e c o m m e n d e d a r e n o t m e a n t t o b e i n c l u s i v e , b u t w e r e c h o s e n
o n t h e b a s i s o f c o m m o n u s a g e a n d p r o c e d u r a l e a s e . O t h e r a s s a y s i n t h e l i t e r a t u r e w i l l u n d o u b t e d l y
c o n t i n u e t o f i n d l i m i t e d a p p l i c a t i o n . S o m e n o t a b l e e x a m p l e s a r e :
( 1 )
v i s c o s i m e t r i c a s s a y ' u s i n g s o l u b l e , d e r i v a t i z e d c e l l u l o s e , w h i c h i s a v e r y s e n s i t i v e , b u t s o m e w h a t
d i f f i c u l t m e t h o d o f m e a s u r i n g e n d o g l u c a n a s e ( E C 3 . 2 . 1 . 4 ) a c t i v i t y ;
( 2 ) c e l l u l o s e a z u r e a s s a y 2 u s i n g l a b o r a t o r y p r e p a r e d o r c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e d y e d c e l l u l o s e , a c o n v e -
n i e n t m e t h o d o f m e a s u r i n g p r i m a r i l y c e l l o b i o h y d r o l a s e ( E C 3 . 2 . 1 . 9 1 ) a c t i v i t y b y d y e r e l e a s e ; a n d
( 3 ) f i l t e r p a p e r d e g r a d i n g ( F P D ) a s s a y 3 , a s i m p l e , u s e f u l , b u t s o m e w h a t t i m e c o n s u m i n g m e t h o d , r e q u i r -
i n g n o s o p h i s t i c a t e d e q u i p m e n t .
S o m e i n v e s t i g a t o r s p r e f e r t o u s e a l t e r n a t i v e s u b s t r a t e s , e . g . m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e i n t h e f o r m o f
A v i c e l i n s t e a d o f f i l t e r p a p e r , o r d i f f e r e n t f o r m s o f s o l u b l e s u b s t i t u t e d c e l l u l o s e . W h e r e t h e s e a l t e r n a t i v e
p r o c e d u r e s a p p e a r t o b e j u s t i f i e d , t h e i r u s e w i l l u n d o u b t e d l y c o n t i n u e . A g a i n , t h e e m p i r i c a l n a t u r e o f t h e
r e c o m m e n d e d a s s a y s w i l l m o r e l i k e l y b e o f c o n t i n u e d v a l u e t o b i o t e c h n o l o g i s t s t h a n t o e n z y m o l o g i s t s , w h o
w i l l f i n d t h e s e m e t h o d s l a c k i n g i n t h e o r e t i c a l d e f i n i t i o n . T h e n e e d y e t r e m a i n s t o d e v e l o p a c c u r a t e l y
d e f i n e d c e l l u l o s i c s u b s t i a t e s f o r p r e c i s e a s s a y p r o c e d u r e s .
I t i s w e l l k n o w n t h a t t h e l e v e l o f f 3 - g l u c o s i d a s e i n a n e n z y m e p r e p a r a t i o n m a y a f f e c t t h e r e s u l t o f c e l l u l a s e
a s s a y s , i n p a r t i c u l a r t h e a s s a y o f F P A 4 . I n o r d e r t o o v e r c o m e t h i s p r o b l e m , i t w o u l d b e i m p o r t a n t i n t h e
f u t u r e e i t h e r t o m o d i f y t h e F P U a s s a y o f M a n d e l s e t a ! . , o r e l s e t o a d o p t a m e t h o d w h i c h i s n o t a f f e c t e d b y
t h e l e v e l o f f J - g l u c o s i d a s e i n t h e e n z y m e p r e p a r a t i o n . O n e s u c h m e t h o d i s t h e D y e d A v i c e l m e t h o d o f
L e i s o l a a n d L i n k o 2 , w h i c h w a s n o t , h o w e v e r , a d o p t e d i n t h e p r e s e n t r e c o m m e n d a t i o n s . M o d f i c a t i o n o f
t h e F P U a s s a y w o u l d i n v o l v e e i t h e r a d d i t i o n o f e x c e s s f J - g l u c o s i d a s e s o t h a t a l l o f t h e p r o d u c t o f t h e
c e l l u l o l y t i c e n z y m e ( s ) w o u l d b e m e a s u r e d a s g l u c o s e o r a l t e r n a t i v e l y r e m o v a l o r i n h i b i t i o n o f t h e / 3 -
g l u c o s i d a s e c o m p o n e n t o f t h e c e l l u l a s e e n z y m e s o t h a t t h e r e a c t i o n p r o d u c t m e a s u r e d w o u l d b e p r o d u c e d
s o l e l y b y t h e a c t i o n o f t h e t r u l y c e l l u l o l y t i c e n z y m e ( s ) .
F i n a l l y i t m u s t b e r e m e m b e r e d t h a t a s s a y a c t i v i t i e s m a y n o t r e f l e c t p o t e n t i a l s a c c h a r i f i c a t i o n p e r f o r m a n c e .
O t h e r c o n s i d e r a t i o n s b e c o m e o f g r e a t i m p o r t a n c e t o c o m m e r c i a l c e l l u l o s e h y d r o l y s i s , s u c h a s e n d - p r o d u c t
i n h i b i t i o n , t h e a d d i t i o n o f c e l l o b i a s e a c t i v i t y , o r r e a c t o r a n d p r o c e s s c o n f i g u r a t i o n . T h e s e f a c t o r s w i l l v a r y
w i t h d i f f e r e n t c e l l u l a s e s y s t e m s a n d s i g n i f i c a n t l y a f f e c t c o n v e r s i o n e f f i c i e n c y .
I I . G E N E R A L I N F O R M A T I O N
1 . F o r s o l u b l e e n z y m e , f i l t e r o r c e n t r i f u g e c u l t u r e s a m p l e t o r e m o v e s o l i d s a n d a n a l y z e s u p e r n a t a n t o r
f i l t r a t e . F o r c e l l b o u n d e n z y m e s , h o m o g e n i z e c e l l s i n a p p r o p r i a t e b u f f e r s u c h a s 0 . 0 5 M c i t r a t e , p H 4 . 8 .
D i s s o l v e e n z y m e p o w d e r s a t 1 - 5 m g p e r m l i n b u f f e r . D i l u t e e n z y m e s o l u t i o n s i n b u f f e r .
2 . B l a n k s o f e n z y m e w i t h o u t s u b s t r a t e a n d s u b s t r a t e w i t h o u t e n z y m e a r e i n c l u d e d w i t h a l l e n z y m e a s s a y s
a n d s a m p l e v a l u e s a r e c o r r e c t e d f o r a n y b l a n k v a l u e .
3 . F o r q u a n t i t a t i v e r e s u l t s , e n z y m e m u s t b e d i l u t e d o r a s s a y r e a c t i o n t i m e d e c r e a s e d u n t i l t h e a m o u n t o f
p r o d u c t p l o t t e d a g a i n s t e n z y m e c o n c e n t r a t i o n i s r e a s o n a b l y l i n e a r . F o r t h e a s s a y p r o c e d u r e s d e s c r i b e d
h e r e , t h i s w o u l d b e w h e n a b o u t 0 . 5 m g ( o r l e s s ) o f g l u c o s e i s p r o d u c e d f r o m c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e , o r
c e l l o b i o s e ; o r 2 . 0 m g o f g l u c o s e ( o r l e s s ) i s p r o d u c e d f r o m f i l t e r p a p e r , o r o t h e r i n s o l u b l e s u b s t r a t e s . F o r
i n s o l u b l e c e l l u l o s e , i n i t i a l r a t e s a r e o f l i t t l e v a l u e s i n c e t h e r e i s a l w a y s s o m e a m o r p h o u s c e l l u l o s e w h i c h i s
r e a d i l y h y d r o l y z e d , b u t r a t e s f a l l o f f r a p i d l y t o z e r o i f t h e c e l l u l a s e i s i n c o m p l e t e . F o r q u a n t i t a t i v e r e s u l t s
e n z y m e p r e p a r a t i o n s s h o u l d b e c o m p a r e d o n t h e b a s i s o f s i g n i f i c a n t a n d e q u a l c o n v e r s i o n . T w i c e a s m u c h
e n z y m e w i l l g i v e e q u a l s u g a r i n h a l f t h e t i m e , b u t i t w i l l n o t g i v e t w i c e a s m u c h s u g a r i n e q u a l t i m e . A n
a r b i t r a r y v a l u e o f 2 . 0 m g o f r e d u c i n g s u g a r a s g l u c o s e f r o m 5 0 m g o f f i l t e r p a p e r ( 4 % c o n v e r s i o n ) i n 6 0
m i n u t e s h a s b e e n d e s i g n a t e d a s t h e i n t e r c e p t f o r c a l c u l a t i n g f i l t e r p a p e r c e l l u l a s e u n i t s .
2 6 0
C O M M I S S I O N O F B I O T E C H N O L O G Y
4 .
C i t r a t e B u f f e r : F o r T r i c h o d e r m a r e e s e i c e l l u l a s e a s s a y s a r e c a r r i e d o u t i n 0 . 0 5 M c i t r a t e b u f f e r p H 4 . 8 .
2 1 0 g C i t r i c A c i d M o n o h y d r a t e C 6 1 1 8 0 7 . H 2 0
7 5 0 m l d i s t i l l e d w a t e r
N a O H a d d u n t i l p H e q u a l s 4 . 3 ( 5 0 - 6 0 g )
D i l u t e t o 1 0 0 0 m l a n d c h e c k p H . I f n e c e s s a r y a d d N a O H u n t i l p H = 4 . 5 . T h i s i s 1 M c i t r a t e b u f f e r p H 4 . 5 .
W h e n d i l u t e d t o 0 . 0 5 M , p H s h o u l d b e 4 . 8 .
5 . R e d u c i n g S u g a r E s t i m a t i o n b y D i n i t r o s a l i c y l i c A c i d ( D N S ) M e t h o d 5
D N S R e a g e n t
M i x : D i s t i l l e d W a t e r 1 4 1 6 m l
3 , 5 - D i n i t r o s a l i c y l i c a c i d 1 0 . 6 g
N a O H 1 9 . 8 g
D i s s o l v e a b o v e , t h e n a d d :
R o c h e l l e s a l t s ( N a - K t a r t a r a t e ) 3 0 6 g
P h e n o l ( m e l t a t 5 0 C )
7 . 6 m l
N a m e t a b i s u l f i t e 8 . 3 g
T i t r a t e 3 m l s a m p l e w i t h p h e n o l p t h a l m w i t h 0 . 1 N H C 1 . S h o u l d t a k e 5 - 6 m l H C 1 . A d d N a O H i f r e q u i r e d
( 2 g =
1 m l 0 . 1 N H C 1 ) .
G l u c o s e S t a n d a r d s : 0 . 2 5 . 0 m g o f g l u c o s e p e r m l o r p e r 0 . 5 m l a s a p p r o p r i a t e .
P r o c e d u r e : P l a c e 1 - 2 m l s a m p l e i n a t e s t t u b e a n d a d d 3 m l D N S R e a g e n t . P l a c e i n b o i l i n g w a t e r f o r 5
m i n u t e s . C o o l t o r o o m t e m p e r a t u r e . D i l u t e s a m p l e s i f n e c e s s a r y s o T h a t l i g h t t r a n s m i t t a n c e i n t h e
c o l o r i m e t e r w i l l b e b e t w e e n 3 % a n d 8 0 % . I n c l u d e g l u c o s e s t a n d a r d m a d e u p a n d d i l u t e d l i k e s a m p l e s .
R e a d % t r a n s m i t t a n c e a t 5 4 0 n m w i t h a w a t e r b l a n k f o r 1 0 0 % T . P l o t t h e s t a n d a r d s o n s e m i l o g p a p e r ( l o g
% T v e r s u s c o n c e n t r a t i o n ) . T h i s s h o u l d g i v e a s t r a i g h t l i n e i n t e r s e c t i n g a b s c i s s a a t 0 . 0 4 m g o f g l u c o s e . T h e
0 . 0 4 m g r e p r e s e n t s t h e g l u c o s e l o s t b y o x i d a t i o n . F o r a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o n o f l o w c o n c e n t r a t i o n o f
g l u c o s e a d d 0 . 1 m g o f g l u c o s e t o e a c h s a m p l e . T h r e e m l o f D N S R e a g e n t w i l l r e a c t w i t h a b o u t 1 0 m g o f
g l u c o s e . T h e r e f o r e c o n c e n t r a t e d s u g a r s o l u t i o n s s h o u l d b e d i l u t e d s o t h a t s a m p l e s f o r a n a l y s i s w i l l c o n t a i n
5 m g o f r e d u c i n g s u g a r o r l e s s .
E n z y m e A s s a y s : S t a n d a r d s s h o u l d b e m a d e u p a n d d i l u t e d a f t e r b o i l i n g l i k e t h e a s s a y u n k n o w n s . F o r
e x a m p l e , f o r t h e f i l t e r p a p e r a s s a y u s e 0 . 5 m l o f s t a n d a r d s c o n t a i n i n g 0 . 2 5 . 0 m g g l u c o s e p e r 0 . 5 m l . A d d
1 m l 0 . 0 5 M b u f f e r a n d 3 m l D N S R e a g e n t .
C o m m e n t s :
C o l o r d e v e l o p s o n l y u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s , s o a c i d i c s a m p l e s s h o u l d b e n e u t r a l i z e d .
T h i s m e t h o d i s n o n - s p e c i f i c a n d m e a s u r e s a n y r e d u c i n g c o m p o u n d . I f g l u c o s e i s u s e d a s t h e s t a n d a r d ,
v a l u e s f o r c e l l o b i o s e w i l l b e 1 5 % l o w a n d v a l u e s f o r x y l o s e w i l l b e 1 5 % h i g h o n a w e i g h t b a s i s .
B o i l e d s a m p l e s m a y b e l e f t a r e a s o n a b l e t i m e b e f o r e r e a d i n g . U n b o i l e d s a m p l e s g r a d u a l l y d e t e r i o r a t e .
I I I . F O L I N P R O T E I N D E T E R M I N A T I O N ( r e f . 6 )
1 . R e a g e n t s
R e a g e n t A 2 0 g N a 2 C O 3
4 g N a O H
d i s t i l l e d w a t e r t o m a k e 1 0 0 0 m l
R e a g e n t B - i 1 g C u S O 4 . 5 H 2 0
w a t e r t o m a k e 1 0 0 m l
R e a g e n t B - 2
2 g N a K T a r t a r a t e
w a t e r t o m a k e 1 0 0 m l
R e a g e n t C ( K e e p o n l y o n e d a y )
1 m l R e a g e n t B - i
1 m l R e a g e n t B - 2
1 0 0 m l R e a g e n t A
M i x i n t h i s o r d e r
P h e n o l R e a g e n t i N D i l u t e F o l i n C i o c a l t e a u R e a g e n t ( 2 N ) w i t h a n e q u a l v o l u m e o f w a t e r .
1 0 % T r i c h l o r o a c e t i c a c i d i n w a t e r .
M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a s e a c t i v i t i e s 2 6 1
2 . S o l u b l e p r o t e i n . F i l t e r o r c e n t r i f u g e c u l t u r e t o r e m o v e s o l i d s . U s e s u p e r n a t a n t .
3 . P r e c i p i t a t i o n . P l a c e 2 m l i n c o n i c a l c e n t r i f u g e t u b e ( 1 5 m l ) . A d d 2 m l 1 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . M i x .
I n c u b a t e 3 0 - 6 0 m i n u t e s i n r e f r i g e r a t o r . C e n t r i f u g e 2 5 m i n u t e s a t 2 0 0 0 R P M . D i s c a r d s u p e r n a t a n t . D i s -
s o l v e p e l l e t i n 2 m l R e a g e n t A .
4 . P r o t e i n m a y a l s o b e p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g 4 m l a c e t o n e t o 2 m l s a m p l e . I n t h i s c a s e t h e p e l l e t i s
d i s s o l v e d i n 0 . 0 5 M c i t r a t e b u f f e r o f p H 4 . 8 a n d e n z y m e d e t e r m i n a t i o n c a n a l s o b e m a d e . T h i s p r o c e d u r e i s
u s e d t o m e a s u r e e n z y m e i n s a m p l e s c o n t a i n i n g s o m u c h s u g a r t h a t i t i n t e r f e r e s w i t h t h e F P a s s a y .
5 . P l a c e 0 . 5 m l s a m p l e ( 0 . 0 5 1 . 0 m g p r o t e i n / m i ) i n a t e s t t u b e . A d d 5 m l R e a g e n t C a n d m i x w e l l . W a i t
1 0 m i n u t e s . A d d 0 . 5 m l 1 N P h e n o l R e a g e n t a n d m i x a t o n c e . W a i t 3 0 m i n u t e s a n d r e a d % t r a n s m i t t a n c e
a t 7 5 0 n m .
6 . L o o k u p p r o t e i n v a l u e s o n a c a l i b r a t i o n c u r v e m a d e u s i n g B o v i n e S e r u m A l b u m i n a s s t a n d a r d ( p l o t
l o g % T v s p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ) .
I v . C E L L O B I A S E A S S A Y ( r e f . 7 )
S u b s t r a t e : 1 5 . 0 m M c e l l o b i o s e ( e . g . F l u k a A G , p u r i s s , p . a . , p r o d u c t 2 2 1 5 0 ) i n 0 . 0 5 M c i t r a t e b u f f e r p H 4 . 8 .
F r e s h c e l l o b i o s e s o l u t i o n s h o u l d b e p r e p a r e d d a i l y .
M e t h o d
1 . A d d 1 . 0 m l o f e n z y m e , d i l u t e d i n c i t r a t e b u f f e r , t o a s m a l l t e s t t u b e . A t l e a s t t w o d i l u t i o n s m u s t b e m a d e
o f e a c h e n z y m e s a m p l e i n v e s t i g a t e d . O n e d i l u t i o n s h o u l d r e l e a s e s l i g h t l y m o r e a n d o n e s l i g h t l y l e s s t h a n 1 . 0
m g ( a b s o l u t e a m o u n t ) o f g l u c o s e i n t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s .
2 . T e m p e r a t e t o 5 0 C .
3 . A d d 1 . 0 m l s u b s t r a t e s o l u t i o n , m i x .
4 . I n c u b a t e a t 5 0 C f o r e x a c t l y 3 0 m m .
5 . T e r m i n a t e t h e r e a c t i o n b y i m m e r s i n g t h e t u b e i n b o i l i n g w a t e r f o r e x a c t l y 5 . 0 m m .
6 . T r a n s f e r t h e t u b e t o a c o l d w a t e r b a t h a n d d e t e r m i n e g l u c o s e p r o d u c e d u s i n g a s t a n d a r d p r o c e d u r e
( e . g . u s i n g a k i t b a s e d o n t h e g l u c o s e o x i d a s e r e a c t i o n ) .
C e l l o b i o s e b l a n k 1 . 0 m l c e l l o b i o s e s u b s t r a t e s o l u t i o n
1 . 0 m l c i t r a t e b u f f e r
3 0 m m , s o c
B o i l 5 . 0 m m , c o o l .
U s e i n t h e G O D r e a c t i o n a n d s u b t r a c t a b s o r b a n c e f r o m t h a t o f t h e s a m p l e . N o t e t h a t a s i n g l e c e l l o b i o s e
b l a n k c a n b e u s e d f o r a w h o l e s e r i e s o f a c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n s f o r w h i c h a n e n z y m e b l a n k i s n o t n e c e s s a r y .
E n z y m e b l a n k
1 . 0 m l c i t r a t e b u f f e r
1 . 0 m l e n z y m e d i l u t i o n
3 0 m m , 5 0 C
B o i l 5 . 0 m m , c o o l .
U s e i n t h e G O D r e a c t i o n a n d s u b t r a c t a b s o r b a n c e f r o m t h a t o f t h e s a m p l e , a l o n g w i t h t h e a b s o r b a n c e o f t h e
c e l l o b i o s e b l a n k . E n z y m e b l a n k s a r e n e c e s s a r y o n l y w h e n g l u c o s e i s p r e s e n t i n t h e e n z y m e p r e p a r a t i o n a n d / o r
w h e n s m a l l d i l u t i o n s a r e u s e d .
N o t e
B e f o r e c o n t i n u i n g w i t h t h e g l u c o s e d e t e r m i n a t i o n , i t i s i m p o r t a n t t o a p p r e c i a t e t h e f o l l o w i n g :
C o m m e r c i a l g l u c o s e o x i d a s e ( G O D ) p r e p a r a t i o n s c o n t a i n s m a l l a m o u n t s o f / 3 - g l u c o s i d a s e a s a n i m p u r i t y .
T h i s e n z y m e u s u a l l y h a s o n l y s l i g h t a c t i v i t y a g a i n s t t h e r e s i d u a l c e l l o b i o s e f r o m t h e c e l l o b i a s e r e a c t i o n
d u r i n g t h e s u b s e q u e n t G O D r e a c t i o n ( u n f a v o r a b l e t e m p e r a t u r e a n d p H ) . H o w e v e r , i t d o e s c a u s e a n
a p p r e c i a b l e b a c k g r o u n d r e a d i n g , w h i c h m u s t b e t a k e n i n t o a c c o u n t . T h i s i s d o n e u s i n g a c e l l o b i o s e b l a n k
( s e e a b o v e ) .
A n o t h e r c o n s e q u e n c e o f t h e c o n t a m i n a t i n g f 3 - g l u c o s i d a s e i n t h e G O D p r e p a r a t i o n i s t h a t t h e c o l o r i n t h e
g l u c o s e o x i d a s e r e a c t i o n d o e s n o t r e a c h a s t a b l e v a l u e i n t h e i n c u b a t i o n t i m e r e c o m m e n d e d b y t h e m a n -
u f a c t u r e r . C o l o r i n t e n s i t y c o n t i n u e s t o i n c r e a s e b e c a u s e n e w g l u c o s e ( s u b s t r a t e ) f o r t h e G O D r e a c t i o n i s
c o n t i n u o u s l y p r o d u c e d b y t h e a c t i o n o f t h e c o n t a m i n a t i n g / 3 - g i u c o s i u a s e o n t n e r e s i d u a l c e l l o b i o s e s u b s -
t r a t e . F o r t h i s r e a s o n i t i s r e c o m m e n d e d t h a t t h e G O D r e a c t i o n s h o u l d b e t e r m i n a t e d b y a c i d i f i c a t i o n ,
w h i c h h a l t s t h e a c t i v i t y o f b o t h t h e G O D a n d t h e c o n t a m i n a t i n g f 3 - g l u c o s i d a s e e n z y m e . A s u i t a b l e a c i d
a d d i t i o n i s 0 . 2 m l 7 2 % H 2 S 0 4 t o a r e a c t i o n v o l u m e o f 2 - 2 0 m l . O f c o u r s e , a c i d s h o u l d b e a d d e d t o a l l
s a m p l e s , z e r o s , b l a n k s a n d s t a n d a r d s , r e g a r d l e s s o f w h e t h e r t h e y c o n t a i n c e l l o b i o s e . I f t h e r e a c t i o n i s n o t
t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f a c i d , i t i s n e c e s s a r y t o r e a d t h e a b s o r b a n c e s o f a l l t h e s a m p l e s a f t e r e x a c t l y t h e
s a m e t i m e f r o m t h e s t a r t o f t h e G O D r e a c t i o n .
2 6 2 C O M M I S S I O N O F B I O T E C H N O L O G Y
U n i t C a l c u l a t i o n
1 . D e t e r m i n e t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s ( m g m 1 1 ) i n t h e c e l l o b i a s e r e a c t i o n m i x t u r e s o b t a i n e d u s i n g a t
l e a s t t w o d i f f e r e n t e n z y m e d i l u t i o n s .
2 . M u l t i p l y b y 2 t o c o n v e r t g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s i n t o a b s o l u t e a m o u n t s ( m g ) .
3 . T r a n s l a t e e n z y m e d i l u t i o n s i n t o c o n c e n t r a t i o n s :
1 v o l u m e o f e n z y m e s a m p l e i n d i l u t i o n
c o n c e n t r a t i o n =
( =
. . )
d i l u t i o n t o t a l v o l u m e o f d i l u t i o n
4 . E s t i m a t e
t h e c o n c e n t r a t i o n o f e n z y m e w h i c h w o u l d h a v e r e l e a s e d e x a c t l y 1 . 0 m g o f g l u c o s e b y p l o t t i n g
g l u c o s e l i b e r a t e d ( 2 ) a g a i n s t e n z y m e c o n c e n t r a t i o n s ( 3 ) o n s e m i l o g a r i t h m i c g r a p h p a p e r .
5 . C a l c u l a t e c e l l o b i a s e a c t i v i t y :
0 . 0 9 2 6
C B =
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
e n z y m e c o n c e n t r a t i o n t o r e l e a s e 1 . 0 m g g l u c o s e
D e r i v a t i o n o f t h e C e l l o b i a s e U n i t
T h e u n i t o f c e l l o b i a s e ( C B ) i s b a s e d o n t h e I n t e r n a t i o n a l U n i t ( I U )
1 I U = 1 m o i m m 1 o f s u b s t r a t e c o n v e r t e d
=
2 . 0 . t m o l m m 1 o f g l u c o s e f o r m e d i n t h e c a s e o f t h e C B r e a c t i o n
T h e a b s o l u t e a m o u n t o f g l u c o s e r e l e a s e d i n t h e C B a s s a y a t t h e c r i t i c a l d i l u t i o n i s 1 . 0 m g :
1 . 0 m g g l u c o s e = 1 . 0 / 0 . 1 8
m o l g l u c o s e
=
0 . 5 / 0 . 1 8 m o l c e l l o b i o s e c o n v e r t e d
T h i s a m o u n t o f c e l l o b i o s e w a s c o n v e r t e d b y 1 . 0 m l e n z y m e i n 3 0 m m , i . e . , 1 . 0 m g g l u c o s e =
0 . 5 / 0 . 1 8
X 1 . 0
x 3 0 j . m o i m i n 1 m l 1 c e l l o b i o s e c o n v e r t e d = 0 . 0 9 2 6 j . m o l m i n 1 m i - 1 . T h e r e f o r e , t h e e s t i m a t e d a m o u n t o f
e n z y m e w h i c h r e l e a s e s 1 . 0 m g g l u c o s e i n t h e C B r e a c t i o n c o n t a i n s 0 . 0 9 2 6 u n i t s , a n d
0 . 0 9 2 6
C B = u n i t s m i
e n z y m e c o n c e n t r a t i o n t o r e l e a s e 1 . 0 m g g l u c o s e
N o t e : c f e n d o f F P U u n i t d e r i v a t i o n .
V .
F i L T E R P A P E R A S S A Y F O R S A C C H A R I F Y I N G C E L L U L A S E ( F P U A s s a y ) ( r e f . 8 )
S u b s t r a t e : W h a t m a n N o . 1 f i l t e r p a p e r s t r i p , 1 . 0 x 6 . 0 c m ( = 5 0
m g ) .
M e t h o d
1 . A d d 1 . 0 m l 0 . 0 5 M N a - c i t r a t e , p H 4 . 8 , t o a t e s t t u b e o f v o l u m e a t l e a s t 2 5 m l .
2 . A d d 0 . 5 m l e n z y m e , d i l u t e d i n c i t r a t e b u f f e r . A t l e a s t t w o d i l u t i o n s m u s t b e m a d e o f e a c h e n z y m e
s a m p l e i n v e s t i g a t e d . O n e d i l u t i o n s h o u l d r e l e a s e s l i g h t l y m o r e a n d o n e s l i g h t l y l e s s t h a n 2 . 0 m g ( a b s o l u t e
a m o u n t ) o f g l u c o s e ( = r e d u c i n g
s u g a r s a s g l u c o s e ) i n t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s .
3 . T e m p e r a t e t o 5 0 C , a d d o n e f i l t e r p a p e r s t r i p , m i x ( N B ! i t d o e s n o t m a t t e r i f a s m a l l p a r t o f t h e p a p e r
i s a b o v e t h e l i q u i d s u r f a c e , b u t i f t h e p a p e r " w i n d s " u p t h e t u b e i t m u s t b e p u s h e d d o w n a g a i n ) .
4 . I n c u b a t e 5 0 C , 6 0 m m .
5 . A d d 3 . 0 m l D N S , m i x . T r a n s f e r t u b e t o a r a c k o n t h e t a b l e .
6 . B o i l f o r e x a c t l y 5 . 0 m m i n a v i g o r o u s l y b o i l i n g w a t e r b a t h c o n t a i n i n g s u f f i c i e n t w a t e r . A l l s a m p l e s ,
e n z y m e b l a n k s , g l u c o s e s t a n d a r d s a n d t h e s p e c t r o z e r o s h o u l d b e b o i l e d t o g e t h e r . A f t e r b o i l i n g , t r a n s f e r
t o a c o l d w a t e r b a t h .
7 . A d d 2 0 m l d e i o n i z e d o r d i s t i l l e d w a t e r . M i x b y c o m p l e t e l y i n v e r t i n g t h e t u b e s e v e r a l t i m e s s o t h a t t h e
s o l u t i o n s e p a r a t e s f r o m t h e b o t t o m o f t h e t u b e a t e a c h i n v e r s i o n ( N B . T h i s i s i m p o r t a n t ! ) .
8 . W h e n t h e ' p u l p ' h a s s e t t l e d w e l l , i . e . , a f t e r a t l e a s t 2 0 m m , t h e c o l o r f o r m e d i s m e a s u r e d a g a i n s t t h e
s p e c t r o z e r o a t 5 4 0 n m . I f t h e p a p e r p u l p d o e s n o t s e t t l e , i t w i l l d o s o a f t e r s t i r r i n g w i t h a g l a s s r o d . ( T h e
n e c e s s i t y f o r s t i r r i n g c a n b e s e e n a f t e r o n l y a f e w m i n u t e s o f s e t t l i n g t i m e ) .
S p e c t r o Z e r o E n z y m e b l a n k
1 . 5 m l c i t r a t e b u f f e r 1 . 0 m l c i t r a t e b u f f e r
3 . 0 m l D N S 0 . 5 m l e n z y m e
5 m m b o i l , 2 0 m l H 2 0 , e t c . 3 . 0 m l D N S
S p e c t r o z e r o i s u s e d t o s e t t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r
B o i l , H 2 0 , e t c .
a t z e r o a b s o r b a n c e . C o l o r m e a s u r e d a g a i n s t s p e c t r o z e r o a n d s u b t r a c t e d
f r o m t h e v a l u e o f t h e a p p r o p r i a t e r e a c t i o n t u b e .
S S 1 ?D I P U I p u s q o q i s n w
s o z n j
J o u n o u n
D u q
s s I u o U R 3 1 0 W S 3 J
P I 0 U O ! 3 f l 1 1 p U O 2 I L J J 1 f l O s p o q o u i
i ( I ?S S t
o a i q t w u i
u u i d d i
u o
- o n . f l s U ! ' L L
S O D f l j
Jo S O j J j E M ! 1 3 f 2 0 2
p j o d i 1 x 3
p u s u o i n j r p
u i A z u 3
i n p p i o w w o i j s n s o i
s n 0 2
q i s s i u u d
j o u s i 2 !
' J U I j U O U
S t U O I P E 1
D U I U i & Z U
s n o q
' J A M O H
. ( z ( q
p u u q o
o s o z n
3 1 1 2
u i A j d i 1 n w
p u i
2 u i x t u i
' u o i n o s
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j o j u i o J M
P 1 1 ! ! P
j U

2 u i p p i A q )
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a i o j q i o j o 3 L 1 1 t l l P
o 1
j q s s u u d
S ! !
' 3 1 f l S E U I
q 2 O U U 3 3 1 P I 4 S U 3 p O S 5 1 U U O J i o o
2 i q
p u n o j ! 2 !
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J W ! J O I O 3 J o
q E d q q
t p u o
2 u ! p u d o p
' j i
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j o u n o w n
5 E 3 1
U I U f l f l E
u l
p a i i n b a i
s u u q i o s q u I
u I o 2 o q d o J p d s q i q I A A q p s u t h n s
q
i u u i
u i r j s i i j
I O J
s A u s s u
s o q
u i u u o p d
s l a p o M
' j n s i
s y p u s q n s U u A p J w o i j
s o n j
j o u n o w i
( i u j
i q u i )
p x q u
u u u u i u s
j o
j d I 3 u u d
u i u s u o p s u q j j u a i u s r n q o j p z p u u w
' f l d I
J O
s A u s s u
q j
s p o qja jj a s I q o p p u }t j :
' I l d 1
q ; o j ; o w
s o o n j & u
s u p i o u o i p u u u o
u i A z u
i I " 5 ! U f l
=
f l d 1
L 0
: p u u
' s u n
L E O 5 U I U O 3 U QI 1 f l ( j J
L f l U !
5 O D f l j U I
0 Z s s p i p i q
( 1 _p u
j u i
=
U O I JU 3U O D
u i A z u
j u w
= ) u i A zu 3
J o u n o u n p u w u s
' a i o j a i q j
( 1 _j w f l j )
_
jU l
j _
U ! U I
j 0 W
L C O
=
jm
_
n u n
j o u n l
0 9
x
c 0
x
8 V 0 / Z
=
5 O 3f l j l U
: u o i p n a i f l d d a I I I U !
' a ' ! U I
0 9
U !
a w i c z u a
i w c o
A q p a D n p o l d
s n M
5 O 3 f l j
j o u n o w n
j o w i f
r o i z
=
a s o n j
z
: & u
5 ! u o i n p p n & i p u p j a i
a s o o n j
j o u n o u i n a n j o s q n a u . j
a s o c n i j 2
!
p n p o i d
u a q j r n w
u I
8 1 0
=
u o ! p n a i
s i s A j o i p i ( q
a q
u u n p
p a u u o j
( a s o n j
s u
s i n n s & I D n p a i ) a s o 3 n j , ,
j o T '
j o w n '
T
p a . I a A u o 3 a n i s q n s j o j _U ! w
j O L I J 7 l
J
=
f l J J
( r u )
p u j n u o n n u i a u j a q u o p a s n q 5 ! f ) ( j J j o p u n o q j
J i U f ) I l d I ' J J J O U O ! J C A ! J J
a j d w n x a U a A i 2
a q u t S n
' i a j i j j i w
. i o d
s p u n
s u
i c j d i . u i s p a s s a i d x a
a m s p n s a m a q n q p a p u a w w o a i s i p
' a m o j a m a q j
u o p n a i a q J o a n u w
A J a A a
p u n
q z n a
u u n p
a n i a w u s a q n p a u u o j 5 1
n p o i d
q i q u i s u o ! p n a l i n 3 U j
' '5 a ! P O 1 a A
j n i p u ! U O
p a s n q 5 1
! U f l S u p s u
p a 1 . I O ) U ! 5 ! a s
i a d
P U j n u o u u u m a u i a q j o a s n a q
' m n a u q - u o u
s
A n s s n
f l d d 3 1 f l a s n n a a * F N
a s o o n j w
a s n a j a l 0 2 u o p n i u a z u o
o w A z u a
1 _j U l S 2 I U f l =
f l c H
L 0
: f j
n p i n D c
. i a d u d q d n i 2 z i w q p m n 2 o j i u i a s
u o
( )
u o u n m u a u o
a w A z u a
2 s u ! n 2 n ( z )
p a i n i a q l j
a s o z n j 2
2 u u i o j d c q a s o 3 n j 2
J 0
2 w A j p n x a
p a s u a j a l a A u q p n o q D ! q M
a U I A Z U a
J O
U O i 2 n J 2 U a D u O D a q a 1 n w ! 2 s I
u o i n j i p j o a w n j o A j 2 O 2
u O l 2 n j l p
( .
= )
.
=
u o r n m u a c u o
u o ! 2 n jl p u i
a U I A Z U a
j o a w n j o A
: s u o u n m 2 u a D u o 3
a U I A Z U a
0 2 1 1 ! p s n s u o u n j i p 3 q 2 a j n j s u n m
( u o u o n a i
a q
2 u u n p p a z r n p o i d a s o 3 n j 2
2 w = ) a s o 3n j2
o u !
( j u n j q
a w z u a
J o u o t p n i q n s
l a 2 J n )
s a q n
a j d w n s
a i p J O s a n j n a u n q i o s q n a q a n j s u n i
' p m n p u n 2 s
5 ! q 2
2 u ! s f l
o I 7 c y
2 s u i n 2 n
p a u o j d ( j w c o / 2 w )
a s o 3 n j 2
j o s u n o w n a n j o s q n a q
2 u i s n
p m p u n s
a s o z n j 2
m n a u q n
p l u 2 s u o D T
U O ! 3U t f l ZI U D 3! U f 1
( j w c o / 2 w 0 T )
T _j w
2 w
= =
i a jjn q jw j i + 1 w T
( j w c o / 2 w c 9 1 )
j _j u l
2 w
=
: j
=
m a jjn q j w o z
+
j w j
( j w c o m u i c z )
1 _j w
2 w
o c
=
z: 1
=
m a jjn q j w o J
+
I W j
( j w ( j / 2 w )
j _j W
2 w
L 9
=
j: j
=
i a jjn q jw c o
+
j w j
: s u o u n j i u
o m a z
o m p a d s
2 s u ! n 2 n
a m n s u a w p u n D 3
u m w z p i a J v
j j a t i p s o
. i a q w a w a J
S N U 1 W
0 :
u a z o i j p a m o s a q u n j w o r - c j o
s 2 o n b q v
i a j j n q 2 E 1 3 j U l
T
a s o 3 n j 2 s n o i p A q u n 1 _
i u
w
o i p m n p u n s j w c o
U O ! J U I O S ' P l S S O f l I 9
S P U I P U U J S
S e W n / P l O e s e jn jje o JO , l u e we Jn s e e p t J
2 6 4 C O M M I S S I O N O F B I O T E C H N O L O G Y
W h e n a s s a y i n g l o w l e v e l s o f a c t i v i t y , i t m a y b e f o u n d t h a t e v e n t h e u n d i l u t e d e n z y m e r e l e a s e s l e s s t h a n t h e
c r i t i c a l a m o u n t o f g l u c o s e . I n t h i s c a s e c a l c u l a t e t h e a c t i v i t i e s f r o m t h e a m o u n t s o f g l u c o s e ( a b s o l u t e
a m o u n t s ) r e l e a s e d b y t h e u n d i l u t e d e n z y m e s a s f o l l o w s :
1 . F P U = m g g l u c o s e r e l e a s e d x 0 . 1 8 5
D e r i v a t i o n
1 . 0 m g g l u c o s e = 1 . 0 / 0 . 1 8 x 0 . 5 x 6 0
m o 1 m m m l 1 s u b s t r a t e c l e a v a g e
=
0 . 1 8 5 u n i t s m i 1
2 . C M C
=
m g
g l u c o s e r e l e a s e d x 0 . 3 7
D e r i v a t i o n
1 . 0 m g g l u c o s e = 1 . 0 / 0 . 1 8 x 0 . 5 x 3 0 j m o l m m 1 m i 1 s u b s t r a t e c l e a v a g e
=
0 . 37 u n i t s m i i
3 . C B =
m g
g l u c o s e r e l e a s e d x 0 . 0 9 2 6
D e r i v a t i o n
1 . 0 m g g l u c o s e = 0 . 5 / 0 . 1 8
x 1 . 0 x 3 0 j . m o l m m 1 m i 1 s u b s t r a t e c l e a v a g e
=
0 . 0 9 2 6 u n i t s m i 1
I n a l l t h r e e c a s e s , i f a c c u r a t e r e s u l t s a r e d e s i r e d , u n d i l u t e d e n z y m e s h o u l d b e u s e d o n l y w h e n t h e a m o u n t
o f g l u c o s e r e l e a s e d i s b e l o w o r e q u a l t o t h e c r i t i c a l a m o u n t o f g l u c o s e i n t h e r e a c t i o n c o n c e r n e d .
V I . C A R B O X Y M E T H Y L C E L L U L A S E A S S A Y F O R E N D O - 1 3- 1 , 4 - G L U C A N A S E ( r e f . 8 )
S u b s t r a t e
2 % C a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e C M C 7 L 2 ( d e g r e e o f s u b s t i t u t i o n =
0 . 7 ) ( H e r c u l e s I n c . , W i l m i n g t o n , D e l a w a r e
1 9 8 9 9 , U S A ) i n 0 . 0 5 M s o d i u m c i t r a t e b u f f e r , p H 4 . 8 .
M e t h o d
A d d 0 . 5 m l e n z y m e , d i l u t e d i n c i t r a t e b u f f e r , t o a t e s t t u b e o f v o l u m e a t l e a s t 2 5 m l . A t l e a s t t w o d i l u t i o n s
m u s t b e m a d e o f e a c h e n z y m e s a m p l e i n v e s t i g a t e d . O n e d i l u t i o n s h o u l d r e l e a s e s l i g h t l y m o r e a n d o n e
s l i g h t l y l e s s t h a n 0 . 5 m g ( a b s o l u t e a m o u n t ) o f g l u c o s e ( = r e d u c i n g
s u g a r s a s g l u c o s e ) i n t h e r e a c t i o n
c o n d i t i o n s .
2 . T e m p e r a t e t o 5 0 C .
3 . A d d 0 . 5 m l s u b s t r a t e s o l u t i o n , m i x w e l l a n d i n c u b a t e a t 5 0 C f o r 3 0 m m .
4 . A d d 3 . 0 m l D N S , m i x . T r a n s f e r t o a r a c k o n t h e t a b l e .
5 . B o i l f o r e x a c t l y 5 . 0 m m i n a v i g o r o u s l y b o i l i n g w a t e r b a t h c o n t a i n i n g s u f f i c i e n t w a t e r . A l l s a m p l e s ,
e n z y m e b l a n k s , g l u c o s e s t a n d a r d s a n d t h e s p e c t r o z e r o s h o u l d b e b o i l e d t o g e t h e r . A f t e r b o i l i n g , t r a n s f e r
i m m e d i a t e l y t o a c o l d w a t e r b a t h .
6 . A d d 2 0 m l d e i o n i z e d o r d i s t i l l e d w a t e r . M i x b y c o m p l e t e l y i n v e r t i n g t h e t u b e s e v e r a l t i m e s s o t h a t t h e
s o l u t i o n s e p a r a t e s f r o m t h e b o t t o m o f t h e t u b e a t e a c h i n v e r s i o n ( N . B . T h i s i s i m p o r t a n t ! ) .
7 . M e a s u r e t h e c o l o r f o r m e d a g a i n s t t h e s p e c t r o z e r o a t 5 4 0 n m . W h e n n e c e s s a r y ( i . e . , w h e n s m a l l
d i l u t i o n s a r e u s e d ) , t h e c o l o r f o r m e d i n t h e e n z y m e b l a n k ( s e e b e l o w ) i s s u b t r a c t e d f r o m t h a t o f t h e
s a m p l e t u b e .
8 . T r a n s l a t e t h e a b s o r b a n c e o f t h e s a m p l e t u b e ( c o r r e c t e d i f n e c e s s a r y b y s u b t r a c t i o n o f t h e e n z y m e
b l a n k ) i n t o g l u c o s e p r o d u c t i o n d u r i n g t h e r e a c t i o n u s i n g a g l u c o s e s t a n d a r d c u r v e ( s e e b e l o w ) .
S p e c t r o Z e r o E n z y m e B l a n k
0 . 5 m l s u b s t r a t e s o l u t i o n 0 . 5 m l s u b s t r a t e s o l u t i o n
3 0 m m , s o c 3 0 m m , 5 0 C
3 . 0 m l D N S 3 . 0 m l D N S
0 . 5 m l c i t r a t e b u f f e r , m i x 0 . 5 m l e n z y m e d i l u t i o n
B o i l 5 . 0 m m , a d d 2 0 m l H 2 O B o i l 5 . 0 m m , a d d 2 0 m l H 2 0
Z e r o a t 5 4 0 n m M e a s u r e a t 5 4 0 n m
S t a n d a r d s G l u c o s e S t o c k S o l u t i o n
0 . 5 m l s u b s t r a t e s o l u t i o n
2 m g m l 1 a n h y d r o u s g l u c o s e
3 0 m m , 5 0 C A l i q u o t s o f a b o u t 5 m l c a n b e s t o r e d f r o z e n
3 . 0 m l D N S
R e m e m b e r t o s t i r w e l l a f t e r t h a w i n g
0 . 5 m l s t a n d a r d
U n d i l u t e d
=
2 . 0
m g m i i ( 1 . 0 m g / 0 . 5 m l )
B o i l 5 . 0 m m , a d d 2 0 m l 1 - 1 2 0
1 . 0 m l + 0 . 5 m l b u f f e r = 1 : 1 . 5
=
1 . 33
m g m i i ( 0 . 6 7 m g / 0 . 5 m l )
M e a s u r e a t 5 4 0 n m
1 . 0 m l + 1 . 0 m l b u f f e r = 1 : 2
=
1 . 0
m g m i 1 ( 0 . 5 m g / 0 . 5 m l )
1 . 0 m l + 3 . 0 m l b u f f e r = 1 : 4
=
0 . 5
m g m 1 1 ( 0 . 2 5 m g / 0 . 5 m l )
M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a s e a c t i v i t i e s
2 6 5
U n i t C a l c u l a t i o n
1 . C o n s t r u c t a l i n e a r g l u c o s e s t a n d a r d u s i n g t h e a b s o l u t e a m o u n t s o f g l u c o s e ( m g / 0 . 5 m l ) p l o t t e d a g a i n s t
A 5 4 0
2 . U s i n g t h i s s t a n d a r d , t r a n s l a t e t h e a b s o r b a n c e v a l u e s o f t h e s a m p l e t u b e s ( a f t e r s u b t r a c t i o n o f e n z y m e
b l a n k ) i n t o g l u c o s e ( = m g g l u c o s e p r o d u c e d d u r i n g t h e r e a c t i o n ) .
3 . T r a n s l a t e t h e d i l u t i o n s u s e d i n t o e n z y m e c o n c e n t r a t i o n s
1
v o l u m e o f e n z y m e i n d i l u t i o n
c o n c e n t r a t i o n = ( =
d i l u t i o n t o t a l v o l u m e o f d i l u t i o n
4 . E s t i m a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f e n z y m e w h i c h w o u l d h a v e r e l e a s e d e x a c t l y 0 . 5 m g o f g l u c o s e b y
p l o t t i n g g l u c o s e l i b e r a t e d ( 2 ) a g a i n s t e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ( 3 ) o n s e m i l o g a n t h m i c g r a p h p a p e r .
5 . C a l c u l a t e C M C
0 . 1 8 5
C M C =
u n i t s m 1 1
e n z y m e c o n c e n t r a t i o n t o r e l e a s e 0 . 5 m g g l u c o s e
D e r i v a t i o n o f t h e C M C U n i t
T h e u n i t o f C M C i s b a s e d o n t h e I n t e r n a t i o n a l U n i t ( I U ) a n d i t s c a l c u l a t i o n i s a n a l o g o u s t o t h a t o f t h e u n i t
o f F P U .
1 I U = 1 m o l m i n 1 o f l i b e r a t e d h y d r o l y s i s p r o d u c t
= 0 . 1 8 m g m m 1 w h e n t h e p r o d u c t i s g l u c o s e
T h e c r i t i c a l a m o u n t o f g l u c o s e i n t h e C M C a s s a y i s 0 . 5 m g :
0 . 5 m g g l u c o s e = 0 . 5 / 0 . 1 8 t m o i
T h i s a m o u n t o f g l u c o s e w a s p r o d u c e d b y 0 . 5 m l i n 3 0 m m , i . e . , i n t h e C M C r e a c t i o n
0 . 5
0 . 5 m g g l u c o s e =
i i i
m o l m m - 1 m i - i
= 0 . 1 8 5 j m o l m m 1 m i 1 ( I U m i i )
T h e r e f o r e , t h e e s t i m a t e d a m o u n t o f e n z y m e ( = c r i t i c a l
e n z y m e c o n c e n t r a t i o n , m l . m i i ) w h i c h r e l e a s e s
0 . 5 m g g l u c o s e i n t h e C M C r e a c t i o n c o n t a i n s 0 . 1 8 5 I U , a n d :
C M C =
0 . 1 8 5 I U m i 1
c r i t i c a l e n z y m e c o n c e n t r a t i o n m l m i 1
0 . 1 8 5
=
. . . u n i t s m l 1
c r i t i c a l e n z y m e c o n c e n t r a t i o n
N B . B e c a u s e t h e C M C a s s a y i s n o n - l i n e a r . . .
( s e e
e n d o f F P U
d e r i v a t i o n ) .
V I I . A D D I T I O N A L A S S A Y P R O C E D U R E F O R E N D O G L U C A N S E ( H E C
A s s a y ) ( r e f . 9 )
S u b s t r a t e
1 . 0 % H E C ( H y d r o x y e t h y i c e l l u l o s e , m e d i u m v i s c o s i t y , F l u k a A G p r a c t . , p r o d u c t 5 4 2 9 0 , . D P 4 5 0 , D S
0 . 9 - 1 . 0 ) i n 0 . 0 5 M c i t r a t e b u f f e r , p H 4 . 8 . T h e H E C p o w d e r i s d i s s o l v e d u s i n g a m a g n e t i c s t i r r e r f o r a t l e a s t
o n e h o u r , a f t e r w h i c h i t m u s t s t a n d f o r a f u r t h e r 1 h t o c l a r i f y . T h e s o l u t i o n m a y b e s t o r e d f o r 2 w e e k s a t
+4 C .
M e t h o d
1 . A d d 1 . 8 m l s u b s t r a t e s o l u t i o n t o a 1 5 m l t e s t t u b e , p r e f e r a b l y u s i n g a n a u t o m a t i c p i p e t t e .
2 . T e m p e r a t e t o 5 0 C .
3 . A d d 0 . 2 m l o f e n z y m e s o l u t i o n d i l u t e d i n c i t r a t e b u f f e r , m i x .
4 . I n c u b a t e 5 0 C , 1 0 m m .
5 . A d d 3 . 0 m l D N S , m i x . T r a n s f e r t o a r a c k o n t h e t a b l e .
6 . B o i l f o r e x a c t l y 5 . 0 m m i n a v i g o r o u s l y b o i l i n g w a t e r b a t h c o n t a i n i n g s u f f i c i e n t w a t e r . A l l s a m p l e s ,
e n z y m e b l a n k s , g l u c o s e s t a n d a r d s a n d t h e s p e c t r o z e r o s h o u l d b e b o i l e d t o g e t h e r . A f t e r b o i l i n g , t r a n s f e r
t o a c o l d w a t e r b a t h .
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A D O 1 O N H 3 L O I 8 1 0 N O I S S I V J V s J O 3 9 9
M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a s e a c t i v i t i e s 2 6 7
1 0 0
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0
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0
F i g u r e
1 : E f f e c t o f e n z y m e s u b s t r a t e r a t i o a n d a d d e d / 3 - g l u c o s i d a s e o n p e r c e n t c o n v e r s i o n .
3 . C a l c u l a t e p e r c e n t s a c c h a r i f i c a t i o n a t e a c h t i m e a s
r e d u c i n g s u g a r ( m g / m i ) x 0 . 9 x 1 0 0
i n i t i a l s u b s t r a t e ( m g / m i )
4 . P l o t p e r c e n t s a c c h a r i f i c a t i o n v s l o g a r i t h m o f i n i t i a l e n z y m e / s u b s t r a t e r a t i o . T h i s s h o u l d g i v e a s t r a i g h t
l i n e .
5 . I f s u p p l e m e n t a l c e l i o b i a s e i s a d d e d i t s h o u l d b e a t a l e v e l t o g i v e o n e c e l l o b i a s e u n i t ( i n c l u d i n g
c e l l o b i a s e i n c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n ) p e r f i l t e r p a p e r c e l i u l a s e u n i t .
N o t e :
F o r e v a l u a t i o n o f c e l i u l a s e u n d e r p r o c e s s c o n d i t i o n s , a l l i m p o r t a n t p a r a m e t e r s l i k e p r e t r e a t m e n t o f t h e
l i g n o c e l i u l o s i c s u b s t r a t e ( i f d o n e ) , c e l l u l o s e / h e m i c e l l u l o s e c o n c e n t r a t i o n s , s o u r c e , s i z e a n d w a t e r c o n t e n t s
o f t h e s u b s t r a t e , p H , t e m p e r a t u r e , t i m e o f s a c c h a r i f i c a t i o n , n a t u r e o f a g i t a t i o n , a d d i t i o n o f s u p p l e m e n t a l
e n z y m e ( i f a n y ) a n d t h e ' c o m p o s i t i o n o f s u g a r s r e l e a s e d s h o u l d b e p r o v i d e d i n e a c h c a s e o f e v a l u a t i o n .
I X . G E N E R A L R E M A R K S
1 . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e r e c o m m e n d e d m e t h o d s a p p l y t o t h e e s t i m a t i o n o f a c t i v i t i e s o f e x t r a c e l l u l a r
c e l l u l a s e e n z y m e s p r o d u c e d b y t h e f u n g a l s p e c i e s T r i c h o d e r m a a n d n o t n e c e s s a r i l y t o o t h e r c e l l u l a s e
s y s t e m s e l a b o r a t e d b y t h e f u n g i P h a n e r o c h a e t e , P e n i c i l l i u m , F u s a r i u m , e t c . a n d t h e o b l i g a t e a n a e r o b e s
C l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m . I t i s l i k e l y t h a t s e v e r a l o f t h e r e c o m m e n d e d p r o c e d u r e s w i l l e q u a l l y a p p l y t o t h e
a s s a y o f o t h e r e n z y m e s y s t e m s b u t t h e s e m u s t b e s e p a r a t e l y a n d a d e q u a t e l y t e s t e d i n e a c h c a s e b e f o r e
t h e s e b e c o m e a c c e p t e d s t a n d a r d a s s a y s .
2 . M o r e e x a c t l y d e f i n e d s u b s t r a t e s l i k e h i g h e r c e l l o - o l i g o s a c c h a r i d e s s h o u l d b e d e v e l o p e d f o r c h a r a c t e r i -
z a t i o n o f c e l l u l a s e s y s t e m a n d c o m p o n e n t s f r o m a b i o c h e m i c a l p o i n t o f v i e w t o h e l p u n d e r s t a n d t h e m o d e o f
a c t i o n o f c e l l u l a s e s i n c e l l u l o s e h y d r o l y s i s .
R E F E R E N C E S
1 .
A l m i n , K . E . , E r i k s s o n , K - E . a n d P e t t e r s s o n , L . G . ( 1 9 7 5 ) E u r . J . B i o c h e m . , 5 1 , 2 0 7
2 . L e i s o l a , M . a n d L i n k o M . , ( 1 9 7 6 ) A n a l . B i o c h e m . , 7 0 , 5 9 2
3 . T o y a m a , N . a n d O g a w a , K . , ( 1 9 7 7 ) P r o c . I . B i o c o n v e r s i o n S y m p . , l I T D e l h i , ( T . K . G h o s e , e d . ) ,
p . 3 0
4 . B a i l e y , M . J . ( 1 9 8 1 ) B i o t e c h n o l . L e t t e r s , 3 , 6 9 5
5 . M i l l e r , G . L . ( 1 9 5 9 ) A n a l y t i c a l C h e m . , 3 1 , 4 2 6
6 . L o w r y , O H . , R o s e b r o u g h , N . J . , F a r r , A . L . a n d R a n d a l l , R . J . ( 1 9 5 1 ) J . B i o l . C h e m . , 1 9 3 , 2 6 5
7 . S t e r n b e r g , D . , V i j a y k u m a r , P . , a n d R e e s e , E . T . ( 1 9 7 7 ) C a n . J . M i c r o b i o l . , 2 3 , 1 3 9
8 . M a n d e l s , M . , A n d r e o t t i , R . a n d R o c h e , C . , ( 1 9 7 6 ) B i o t e c h n o l . B i o e n g . S y m p . 6 , 1 7
9 . B a i l e y , M . J . a n d N e v a l a i n e n , K . M . H . , ( 1 9 8 1 ) E n z y m e M i c r o b . T e c h n o l . , 3 , 1 5 3
1 0 . M a n d e l s M . , M e d e i r o s J . E . , A n d r e o t t i R . E . , B i s s e t t F . H . ( 1 9 8 1 ) B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 3 , 2 0 0 9 ,
1 0 0
, - . G l u c o s i d a s e a d d e d , '
8 0 o V
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C e l l u l o s e
B W 2 0 0
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6 0
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2 0
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6 0
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, B - G l u c o s i d a s e
a d d e d
, , -
A v i c e t
C e l l u l o s e
I I
o
1 . 0 5 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0
F P C e U u l a s e u n i t s / g m i n i t i a l c e l l u l o s e
I I I
0 1 . 0 5 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0
F P C e l l u l o s e u n i t s / g m i n i t i a l c e L l u l o s e
2 6 8 C O M M I S S I O N O F B I O T E C H N O L O G Y
A c k n o wl e d g e m e n t s
T h e M I T w o r k s h o p w h e r e t h e r e c o m m e n d a t i o n s w e r e l a r g e l y f i n a l i s e d c o u l d n o t
h a v e b e e n c o m p l e t e d i f u n r e s e r v e d s u p p o r t a n d a s s i s t a n c e w e r e n o t r e c e i v e d f r o m
c o l l e a g u e s l i k e M a r y M a n d e l s o f U S A r m y D e v e l o p m e n t C e n t r e , M A ; J o h n
F e r c h a k o f B i o l o g i c a l E n e r g y C o r p o r a t i o n o f U S A a n d M i c h a e l B a i l e y o f T e c h n i -
c a l R e s e a r c h C e n t r e , E s p o o , F i n l a n d . S i n c e a p p e a r a n c e o f t h e f i r s t d r a f t ( k n o w n
a s G r e e n B o o k ) r e l e a s e d a t t h e L o n d o n , O n t a r i o m e e t i n g o f t h e C o m m i s s i o n i n
J u l y 1 9 8 0 , s e v e r a l o t h e r s c i e n t i s t s w e r e i n v o l v e d i n c a r r y i n g o u t r e c o m m e n d e d
a s s a y p r o c e d u r e s u s i n g s a m p l e s o f e n z y m e s a n d s u b s t r a t e s s u p p l i e d b y M a r y
M a n d e l s a n d M i c h a e l B a i l e y . T h e C o m m i s s i o n e x p r e s s e s i t s s i n c e r e t h a n k s t o
a c k n o w l e d g e a l l t h e s u p p o r t , c o m m e n t s , r e v i e w s a n d a s s a y r e s u l t s p r o v i d e d b y
t h e m . A l l t h e s e v i e w s w e r e t a k e n i n t o c o n s i d e r a t i o n a n d d i s c u s s e d a t t h e M I T
w o r k s h o p .
I N T E R N A T I O N A L C O L L A B O R A T O R S
D r . M i c h a e l J . B a i l e y
T e c h n i c a l R e s e a r c h C e n t r e o f F i n l a n d
B i o t e c h n i c a l L a b o r a t o r y
T i e t o t i e 2 , S F - 0 2 1 5 0 E s p o o 1 5
F i n l a n d
D r . V . S . B i s a r i a
B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t r e
I n d i a n I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , D e l h i
H a u z K h a s , N e w D e l h i - 1 1 0 0 1 6
I n d i a
P r o f . T . M . E n a r i
T e c h n i c a l R e s e a r c h C e n t r e o f F i n l a n d
B i o c h e m i c a l L a b o r a t o r y
T i e t o t i e 2 , S F - 0 2 1 5 0 E s p o o 1 5
F i n l a n d
D r . D . E . E v e l e i g h ,
D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M i c r o b i o l o g y
R u t g e r s T h e S t a t e U n i v e r s i t y o f N e w J e r s e y
N e w B r u n s w i c k , N J 0 8 9 0 3
U . S . A .
D r . V l a d i m i r F a r k a s
S l o v a k A c a d e m y o f S c i e n c e s
I n s t i t u t e o f C h e m i s t r y
D u b r a v s k a C e s t a
8 0 9 3 3 B r a t i s l a v a
C z e c h o s l o v a k i a
D r . J o h n D . F e r c h a k
B i o l o g i c a l E n e r g y C o r p o r a t i o n
P . O . B o x 7 6 6
2 6 5 0 E i s e n h o w e r A v e n u e
V a l l e y F o r g e , P A 1 9 4 8 2
U . S . A .
P r o f . E . G a l a s
I n s t i t u t e o f T e c h n i c a l B i o c h e m i s t r y
T e c h n i c a l U n i v e r s i t y
9 0 9 2 4 L o d z - G d a n s k a 1 6 2 / 1 6 8
P o l a n d
M r . V . K . G h o s h
B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t r e
I n d i a n I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , D e l h i
H a u z K h a s , N e w D e l h i - 1 1 0 0 1 6
I n d i a
D r . G . H a l l i w e l l
D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y a n d B o t a n y
U n i v e r s i t y C o l l e g e , S i n g l e t o n P a r k
S w a n s e a , 5 A 2 8 P P
U n i t e d K i n g d o m
P r o f . J . M . L e a b a u l t
D e p a r t e m e n t d e G e n i e C h i m i q u e
U n i v e r s i t e d e T e c h n o l o g i e d e C o m p i e g n e
6 0 2 0 6 C o m p i e g n e C e d e x
F r a n c e
D r . S . L e v y
B i o t e c h n o l o g y R e s e a r c h D e p a r t m e n t
S R I I n t e r n a t i o n a l
L i f e S c i e n c e s D i v i s i o n
3 3 3 R o v e n s w o o d A v e n u e
M e n l o P a r k , C A 9 4 0 2 5
U . S . A .
D r . M a t t i L i n k o
T e c h n i c a l R e s e a r c h C e n t r e o f F i n l a n d
B i o t e c l i n i c a l L a b o r a t o r y
T i e t o t i e 2 , S F - 0 2 1 5 0 E s p o o 1 5
F i n l a n d
D r . R o b e r t L o n g m
I n s t i t u t e P a s t e u r
2 8 R u e d u d o c . R o u x
P a n s , 7 5 0 1 5
F r a n c e
D r . M a r y M a n d e l s
E n z y m e a n d B i o c h e m i c a l E n g g . G r o u p
E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e s a n d E n g g . D i v i s i o n
S c i e n c e & A d v a n c e d T e c h n o l o g y L a b o r a t o r y
U S A r m y N a t i c k R e s e a r c h & D e v e l o p m e n t
L a b o r a t o r i e s
N a t i c k , M A 0 1 7 6 0
U . S . A .
P r o f . B l a n d M o n t e n e c o u r t
D e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s
L e h i g h U n i v e r s i t y
B e t h l e h e m , P A 1 8 0 1 5
U . S . A .
D r . J . C . S a d a n a
B i o c h e m i s t r y D i v i s i o n
N a t i o n a l C h e m i c a l L a b o r a t o r y
P u n e 4 1 1 0 0 8
I n d i a
P r o f . H . S a h m
I n s t i t u t f u r B i o t e c h n o l o g i e d e r
K e r n f o r s c h u n g s a n l a g e
J u l i c h G m b H , P o s t f a c h 1 9 1 3
5 1 7 0 J u l i c h
F R G
P r o f . C . R . W i l k e
L a w r e n c e B e r k e l e y L a b o r a t o r y
U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , B e r k e l e y
B e r k e l e y , C A 9 4 7 0 0
U . S . A .
D r . T o m W o o d
C a r b o h y d r a t e B i o c h e m i s t r y D e p a r t m e n t
R o w e t t R e s e a r c h I n s t i t u t e
A b e r d e e n , A B 2 9 S B
U n i t e d K i n g d o m