Laporan Praktikum Hari,Tanggal : Senin, 18 November 2013

Biokimia Waktu : 11.00 12.40 WIB

PJP : Inda setyawati, S.Tp M.Si
Asisten : Lusianawati, S.Si
Sari Yunarini, S.Si





ISOLASI DNA KROMOSOM
BAWANG MERAH (Allium Cepa Var. Aggregatum)





Kelompok 10
Raden Dani Najar Saputra J3L112187
Andini Eka Pratiwi J3L112115
Dewi Rosmayanti J3L411211
Wika Herfiza J3L112057





















PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Pendahuluan
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit
mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam
nukleat itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit
mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai
sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida
terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3
suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya (Murray et al
2009).

Gambar 1 Jembatan fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan
posisi 5 pada mononukleotida lainnya
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan
asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini
merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi
dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu
dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul
RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan
mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai
dengan kode DNA-nya (Fessenden dan Fessenden 1990).
DNA dan RNA banyak memiliki persamaan, tetapi RNA memiliki
perbedaan dengan DNA yaitu, Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan
bagian pentosa DNA adalah dioksiribosa. Bentuk molekul DNA adalah heliks
ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal yang terlipat, sehingga
menyerupai rantai ganda. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin
seperti DNA tetapi tidak mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung
urasil. Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin,
demikian pula jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil (Poedjiadi 1994).
Selain itu perbedaan RNA dengan DNA yang lain adalah dalam hal ukuran dan
bentuk, susunan kimia, lokasi, dan fungsinya (Suryo 1992).
Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara
horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau
silinder yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat
bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya
yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya
tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel
menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan (Day dan
Underwood 2002). Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert
Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka
sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi
dipancarkan (It) (Khopkar 2003).
Tujuan
Menunjukkan sifat dan struktur DNA kromosom melalui proses isolasi
terhadap DNA kromosom
Metode
Alat-alat yang digunakan ialah neraca analitik, gelas beaker, sentrifus,
pipet tetes, tabung reaksi, tabung Eppendorf, dan vortex. Bahan-bahan yang
digunakan ialah umbi bawang merah, larutan lisis yang berisi Tris-HCl 50 mM
pH 8.0 yang mengandung 50 mM EDTA, SDS 10%, buffer elusi/buffer TE yang
berisi Tris-HCl 10 mM pH 8.0 yang mengandung 0,1 mM EDTA pH 8,0, EtOH,
NaCl, dan dH
2
O steril.
Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8,0
yang mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat
dari 10 mM Tris-HCl pH 8,0 yang mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah
itu, larutan disimpan di pendingin.
Isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus
dengan menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan seujung sudip
garam dapur digerus sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250
mL dan ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen
dan diinkubasi pada suhu 60C dalam water bath selama 20 menit. Hasil inkubasi
lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es sehingga larutan
tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian
ditambahkan 1 gram NaCl, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit.
Kemudian larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan
menggunakan pipet tetes dan dipindahkan ke dalam 2 tabung baru. EtOH dingin
sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi tabung. Kemudian, tabung ditempatkan
secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan
mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih.
DNA kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit
mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf
1.5 mL. Keempat tabung disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada
lapisan atas secara hati-hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke
pellet DNA kromosom. Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex
dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan
DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah kering, buffer
TE atau dH
2
O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.
Data Hasil Pengamatan
Tabel 1 Hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang merah
Larutan A 260 A 280
A Terkoreksi [DNA]
(g/mg)
Rasio
A260/A280 A 260 A 280
Blanko (TE) 0,2730 0,2010
0,6478 0,5678 32, 3900 1,1409
Sampel 0,9208 0,7688
Perhitungan :
A
terkoreksi =
A
sampel
- A
blanko

1. Aterkoreksi 260 = 0,9208 0,2730 = 0,6478
2. Aterkoreksi 280 = 0,7688 0,2010 = 0,5678

[DNA] = A
260
x 50 g/ml
= 0,6478x 50 g/ml
= 32, 3900 g/ml
Rasio A
260 :
A
280
=

A
260
Terkoreksi : A
280
Terkoreksi
= 0,6478 : 0,5678 = 1,1409
Keterangan :
50 : Larutan nilai basorbansi 1.0 sebanding dengan 50 g/ml untai ganda
DNA per ml
Pembahasan
Prinsip isolasi DNA yaitu, sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama
sentrifugasi ialah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada
di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik
sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 3000 rpm (rotation per
minute). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan yaitu, Isolasi sel; Lisis dinding
dan membran sel; Ekstraksi dalam larutan; Purifikasi; dan Presipitasi.
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan untuk
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan ialah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan,
DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi, sehingga dihasilkan pelet sel
yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir
sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan (Faatih 2009).
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai
macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan.
Praktikum Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah.
Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom
disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan
lebih jelas dan mudah diisolasi. Proses pekerjaan isolasi DNA harus dilakukan
pada suhu rendah, karena kromosom DNA tidak tahan panas dan dapat mengalam
i denaturasi akibat suhu yang terlalu tinggi (Schmid 2003).
Biomolekul seperti DNA bersifat labil dan mudah kehilangan aktifitas
biologisnya, sehingga ekstraksi harus dilakukan dalam kondisi ringan yaitu
dengan
menggunakan suatu larutan encer, tekanan osmotik yang ekstrim dan suhu tinggi.
Penambahan garam saat pengerusan bertujuan membantu ujung-ujung fosfat
DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na
+
yang dikandung oleh garam mampu
membentuk ikatan dengan kutub negatif pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na
+

garam berikatan dengan fosfat (mendekat), saat itulah DNA akan berkumpul.
Sedangkan penambahan alkohol pada permukaan larutan betujuan untuk
melakukan presipitasi sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah
dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur
penyusunnya. Detergen seperti sodium dodecyl sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB
dapat digunakan untuk proses lisis (Subandiyah 2006). Buffer lysis dan
Proteinase-K disini dipakai sebagai reagen pelisis supaya komponen DNA dalam
sitoplasma sel bisa keluar dan diisolasi, sedangkan etanol 70% sebagai pencuci
hasil isolasi (Faatih 2009). Kristal protease juga dapat diganti dengan NaCl
sebagai langkah pemurnian DNA dari kontaminan protein dengan cara
pengendapan molekul DNA tersebut sehingga tidak tercampur dengan
kontaminan (Ardiana 2009).
Larutan pelisis sel lysing solution yang mengandung EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate)
dengan ion logam, seperti Mg
2+
yang merupakan kofaktor DNAse. Dinding sel
dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti
dengan penghangatan pada suhu 60C. Proses lisis dinding sel dilakukan dengan
menginkubasi tabung berisi contoh ke dalam waterbath suhu 60C selama 30-90
menit atau sampai fase padat terpisah dari fase cair. Inkubasi dilakukan untuk
mempercepat proses isolasi DNA kromosom dari campuran. Suhu inkubasi tidak
boleh terlalu tinggi karena DNA kromosom dapat mengalami kerusakan
(Poedjiadi 2009). Larutan buffer TE terdiri dari 1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g
Trisma Base, 0,50 M EDTA pH 8,0, 18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat
2H
2
O berfungsi menjaga struktur DNA. DNA kromosom lalu di sentrifugasi
untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun
RNA. Sehingga DNA kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan
berada dibagian dasar setelah disentrifugasi. (Seidman & Moore 1999 dalam
Agustian 2008).
Pengukuran absorbansi DNA digunakan panjang gelombang 260 nm
sedangkan absorbansi RNA digunakan panjang gelombang 280 nm, hal tersebut
dilakukan karena pada panjang gelombang tersebut terjadi serapan yang maksimal
(Day dan Underwood 2002). Berdasarkan perhitungan pada Tabel 1, A
260
ialah
absorbansi DNA, sedangkan A
280
ialah absorbansi protein. Perhitungan [DNA]
yaitu digunakan A
260
terkoreksi, karena perhitungan konsentrasi DNA hanya
memerlukan absorbansi DNA, bukan absorbansi protein/kontaminan lain. Rasio
A
260 :
A
280
merupakan gambaran tingkat kemurnian DNA. DNA memiliki nilai
tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika
melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari
protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang
didapat belum murni. Jika kurang dari 1.8 maka dH2O yang diambil terlalu
banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Wulandhari 2009). Hasil
percobaan menunjukkan rasio kemurnian DNA sebesar 1,1409 (A
260
:A
280
). Ini
artinya DNA yang diperoleh tidak murni. Kemurnian yang rendah ini diduga
disebabkan protein yang tercampur pada DNA yang dihasilkan. Sambrook et al.
(1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai
1,8-2,0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol.
Simpulan
Berdasarkan percobaan, hasil isolasi DNA umbi bawang merah (Allium
Cepa Var. Aggregatum) memiliki rasio A
260
:A
280
sebesar 1,1409 dengan
konsentrasi DNA sebesar 32, 3900 g/mL dan hasil isolasi tidak murni.
Daftar Pustaka Agustian A. 2008. Karakterisasi Variasi Genetik Jatropha
curcas L. dengan Menggunakan Marka Molekular Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP) [skripsi]. Depok : Universitas Indonesia
Ardiana DW. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk
dengan Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Buletin Teknik
Pertanian. 14 (1): 12-16
Day JY dan Underwood AL. 2002 Analisis Kimia Kuantitatif. Iis Sopyan,
Penerjemah. Jakarta: Airlangga. Terjemahan dari: Quantitative Chemical
Analysis.
Faatih M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi. Surakarta: Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universitas
Muhammadiyah Surakarta.
Fessenden RJ. dan Fessenden JS. 1990. Kimia Organik Jilid 2. Aloysius Hadyana
Pudjaatmaka, Penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic
Chemistry 2.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. A. Saptorahardjo, Penerjemah.
Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry
Murray RK, Granner DK, dan Rodwell VW. 2009. Biokimia Harper Ed. ke-27.
Brahm U. Pendit, Penerjemah. Jakarta: Buku Kedokteran, EGC. Terjemahan
dari : Harpers Illustrated Biochemistry 27
th
ed.
Poedjiadi A. 1994. Dasar Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.
_________ . 2009. Dasar-Dasar Biokomia. Jakarta: Universitas Indonesia Press.
Sambrook J, Fritsch EF, And Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Vol. 3.Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press
Schmid R. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering.
German: Wiley-VCH.
Subandiyah S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi
Patogen Tumbuhan Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Malang: Pelatihan
dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.
Suryo W. 1992. Genetika. Yogyakarta: UGM-Press.
Wulandhari A. 2009. Optimalisasi Hasil Ekstraksi DNA dari Darah Segar Sapi
Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan Darah dan Lisis
Buffer pada Kecepatan Sentrifugasi Berbeda [skripsi]. Bogor: Institut
Pertanian Bogor