High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak

destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering
digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa
aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan rendah), dan High
pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat
oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan
pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika
ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan
sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange)
karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan
untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.

Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling
populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah
fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial
karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi
lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan
dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase
gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati
porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai
BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM
yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian,
dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase
diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.
Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada
kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat
digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

Teknik HPLC lebih bermanfaat dibandingkan dengan GC (Gas Chromatography).
Kelebihan dari teknik HPLC ini antara lain :
1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
2. HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi
3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi
4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya
5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam
beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase
gerak yang dikonsumsi)
6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat menurunkan
biaya karyawan.
7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Prinsip kerja HPLC :
Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan
ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom
lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut
tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom
dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
















Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

a. Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa
gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan
salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fasa gerak HPLC:
- Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
- Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
- Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
- Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
- Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
- Sesuai dengan detector.
Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:
a. HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak
non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol
yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah
heksana atau i-propileter.
b. HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa
gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan
dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k antara 2-5.

b. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk
mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.
Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in
2
)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit
4. Bahan tahan korosi
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan
pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya
ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di
ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung
pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas
pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi)
serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

c. Pemasukan cuplikan
Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC:
- Injeksi syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan
tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-
3% dan sering lebih jelek.
- Injeksi stop-flow
Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara,
sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom.
Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
- Kran cuplikan
Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa
gerak perlu dua langkah:
a. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load,
cuplikan masih berada dalam loop
b. Kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa
gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.

d. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10 -100 l/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar
dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara
kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi
silanisasi) :








Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.

e. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi,
dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
- mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
- mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil;
- stabil dalam pengopersiannya;
- mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
- signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier);
- tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.



Si OH + + HCl Cl Si R
CH
3
CH
3
Si O R Si
CH
3
CH
3
Karakteristik detector HPLC:
Dasar
Pendeteksian
Jenis Maksimum
sensitifitas
Peka terhadap
kecepatan alir
Sensitivitas
suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10
-16
Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10
-6
Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10
-11
Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10
-7
Tidak + 10
-4 0
C
Konduktometri Spesifik 10
-8
Ya 2%
0
C
Spektometri
massa
Umum 10
-10
Tidak Tidak ada
elektrokimia Spesifik 10
-12
Ya 1,5%
0
C

Keuntungan dan keterbatasan HPLC
Ada beberapa keuntungan HPLC, yaitu:
1. Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak stabil dengan
pemanasan.
2. Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak dan fasa diam
berperan dalam proses kromatografi.
3. Berbagai jenis kolom yang selektif.
4. Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.
5. Waktu analisis yang cepat.
6. Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga menjamin presisi
kuantitatif.
7. Resiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan pemanasan.
8. Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektivitas metode tersebut dapat
disesuaikan dengan mudah.
Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPL dihubungkan dengan
spektrofotometer massa (MS). Selain itu, keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis
sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

Aplikasi HPLC
Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif. HPLC
digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi
dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan
larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram
dan tinggi puncak kromatogram.
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan
terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample
yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak
peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam
identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke
HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena
sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses
pelarutan saja.
Contoh hasil analisa HPLC

Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah kompone sedangkan luas
peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk
mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran
HPLC.