PEMBAHASAN PCR

Pada percobaan kali ini untuk melakukan amplifikasi DNA atau yang biasa disebut
memperbanyak DNA dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Metode
PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme (in vitro). Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
besar dengan waktu relative singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang
menggunakan DNA. PCR banyak digunakan di bidang biokimia dan biologi molecular karena
relative murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Adapun komponen- komponen yang dibutuhkan dalam proses PCR adalah tabung
Eppendorf, template DNA, sepasang primer forward 16s rRNA dan reverse 16s rRNA, dNTP,
dapar PCR (taq buffer, ammonium sulfat) , Taq polymerase, dan aqua bidestilata.
DNA primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang
menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. DNA
primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, sehingga
dirancang agar menempel pada daerah tertentu yang diinginkan.
dNTP (deoxynucleoside triphosphate) ataudapatdisebutsebagai building blocks penyusun
DNA yang baru. Komponenselanjutnyaadalah buffer, biasanyaterdiriatasbahan-
bahankimiauntukmengkondisikanreaksi agar berjalan optimum danmenstabilkanenzim DNA
polymerase.Lalu ion logambiasanyadigunakan ion logam bivalen, umumnya Mg
2+
yangberfungsisebagaikofaktorbagienzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA
polymerase tidakdapatbekerja.
Prosedur yang dilakukan terlebih dahulu dibuat master mix yang terdiri dari campuran
sepasang primer forward 16s rRNA (Bact_FI) dan reverse 16s rRNA (Uni_FI), 10 mM dNTP,
dapar PCR, 25 mM Mg
2+
, dan ddH
2
O. Kemudian ditambahkan template DNA kromosom dan 5
unit/ L Taq polymerase. Sepasang primer yang digunakan adalah primer Bact-FI
(5AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3) dan Uni-B1 (5GGTTACSTTGTTACGACTT3).
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Thermal cycler. Cetakan yang
digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah DNA genomic bakteri yang telah diisolasi
dari praktikum sebelumnya. Proses PCR dilakukan dengan diawali tahap denaturasi awal pada
suhu 94oC selama 5 menit. Kemudian dilakukan serangkaian siklus sebanyak 30 kali yang terdiri
dari tahap denaturasi 94oC selama 1 menit, penempelan (annealing) pada suhu 55oC selama 1
menit dan pemanjangan 72oC selama 1 menit.

Gambar 1. Proses PCR
Ada beberapafaktor yang menyebabkantidakberhasilnya PCR, antara lain sebagaiberikut :
Pada saat pengambilan gel salah, Pengambilan forward primer ataupun reverse primer tertukar
dan Enzim
DAFTAR PUSTAKA
Yepyhardi. 2011. Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction). Available online
http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/