FOTOMETRI

Nina Salamah, MSc., Apt

Radiasi elektromagnetik (1)

Radiasi elektromagnetik, atau sinar

suatu bentuk energi radiasi,
memperlihatkan sifat partikel dan gelombang

Sifat gelombang, tergambar pada sifat optik radiasi
elektromagnetik, yaitu difraksi
Sifat partikel, atau foton, tergambar pada proses
interaksi radiasi elektromagnetik dengan zat, yaitu
pada proses penyerapan dan emisi

Interaksi antara sinar dan zat (1)
dipantulkan
dihamburkan
sinar dari
sumber
menuju detektor
I
o
I
diserap
sampel
(reflection)
(Scattering)
(absorption)
I
o
= intensitas sinar sebelum mengenai sampel
I = intensitas sinar yang diteruskan
Perhitungan intensitas pita serapan
menggunakan hukum Lambert dan Beer

Interaksi antara sinar dan zat (2)
Radiasi adalah suatu bentuk energi. Interaksi antara suatu
molekul dengan radiasi menyebabkan molekul bergerak dari
tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi yaitu ke
tingkat energi eksitasi

Radiasi pada daerah UV dan Vis mempengaruhi transisi
elektronik. Energi yang serap pada transisi elektronik
menyebabkan terjadinya eksitasi elektron yang terdapat pada
orbital molekul ke orbital berikutnya yang mempunyai tingkat
energi yang lebih tinggi; jadi elektron mengalami eksitasi dari
tingkat dasar ke tingkat tereksitasi

Keadaan tereksitasi berlangsung sangat singkat (10
-9
- 10
-7
detik)



Interaksi antara sinar dan zat (3)

Dalam teori : transisi elektronik tunggal memberikan garis
tunggal yang tajam pada spektra serapan. Ini hanya
berlaku untuk molekul dalam bentuk gas atau untuk atom
dimana transisi selain elektronik ditekan.

Untuk molekul dalam larutan, terlihat adanya pita serapan
yang lebar pada spektra UV yang disebabkan oleh
berbagai jenis transisi (elektronik, vibrasi, dan rotasi) yang
saling berhubungan, dan karena interaksi solut-pelarut.
Spektrofotometer

provide a plot of the intensity of transmitted or absorbed
light versus wavelength
Penggolongan berdasarkan sistem optik

-- single beam
Sistem optik -- -- single detector
-- double beam --
-- double detector

Pada double beam,
sumber cahaya utama terbagi menuju 2 beam :
satu menuju kuvet (mengandung larutan sampel) dan satu
menuju kuvet (mengandung pelarut referensi)


Yang dimiliki Farmasi UAD ?
double beam double detector (UV-1700)
I. Instrumen (1)
I. Instrumen (2)
I. Instrumen (3)
Sumber sinar
Filter atau monokromator


Ada beberapa cara untuk mengisolasi/mendapatkan
sinar monokromatik yang diinginkan. Salah satunya
adalah dengan menempatkan suatu filter di depan wadah
sampel

filter dapat berupa glass filter atau gelatin filter
(Wratten),
yang mempunyai bandwidths yang luas dan puncak
emisi yang rendah

[Bandwidth (nm) glass filter : 150+, gelatin filter : 25-50;
Transmisi (%) glass filter : 25-90%, gelatin filter : 5-30
(Beckett,227)
]


Beberapa instrumen menggunakan prisma atau diffraction
gratings sebagai monokromator
(Settle,490)
.
Skema monokromator
prisma
(Pecsok,150)
Kuvet
Untuk Vis dari gelas atau kuarsa (quartz)

Untuk UV harus dari kuarsa

Gelas menyerap sinar UV dengan kuat
Kuvet biasanya mempunyai panjang celah 1,0 cm
Kuvet dari kuarsa atau gelas dapat dibersihkan dengan dibilas
dengan air; jika perlu, dengan larutan deterjen atau
asam nitrat panas


Dibilas dengan etanol agar cepat kering

Dibilas untuk mencegah terjadinya penumpukan zat yang
mengabsorbsi, pada permukaan kuvet
Tahapan Kerja Analisis (1)
1. Mencari Operating Time (OT)

Tujuan :

mengetahui waktu dimana suatu proses reaksi
berlangsung stabil

Pada saat reaksi berlangsung stabil (=pada saat OT)
diukur serapan larutan uji

Pengukuran pada saat reaksi berlangsung tidak stabil
data yang diperoleh tidak menentu

Bagaimana mencari dan mengetahui OT ?

Tahapan Kerja Analisis (2)
2. Mencari maksimum (
maks
)
Tujuan :
memperoleh serapan maksimum
Serapan maksimum diperoleh jika pengukuran
dilakukan pada
maks

Perubahan serapan per unit konsentrasi pada
maks

adalah sangat besar


semua yang terserap larutan uji idealnya juga terukur
maksimal oleh spektrofotometer sehingga diperoleh
hasil uji yang maksimal.

maks
harus dicari walaupun dalam prosedur
aslinya biasanya juga telah disebutkan
(petunjuk,14)

Bagaimana mencari dan mengetahui
maks
?
Tahapan Kerja Analisis (3)
3. Membuat kurva standar

a. Dibuat dari satu seri larutan standar - menggunakan
zat standar - dalam berbagai kadar

Zat standar = zat yang diuji (terdapat dalam larutan uji)

b. Diukur serapan satu seri larutan standar pada OT dan

maks
yang diperoleh pada tahap 1 dan 2.

Serapan tiap-tiap kadar larutan standar dicatat, dicari
persamaan garis lurus dan koefisien korelasinya;
absis (X) untuk konsentrasi (c) larutan standar,
ordinat (Y) untuk serapan (A)


Tahapan Kerja Analisis (4)
4. Mencari kadar zat dalam larutan uji

a. Larutan uji dalam kuvet yang telah dipersiapkan
diukur serapannya pada OT dan
maks
yang
telah diketahui.
Dilakukan beberapa kali pengulangan
pengujian
(4 replikasi).

b). Dengan bantuan kurva standar atau persamaan
garis linier yang diperoleh dapat diketahui kadar
zat dalam sampel.