Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam

keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya
baik yang mengganggu atau yang merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses
yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, maupun mekanik yang membunuh
semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2005).
Ketika anda pertama kali melakukan pemindahan biakan secara aseptik,
sesungguhnya anda sudah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran.
Sterilisasi adalah proses menghancurkan semua jenis kehidupan sehingga menjadi steril.
Sterilisasi seringkali dilakukan dengan pengaplikasian udara panas. Ada dua metode yang
sering digunakan, yaitu Panas lembab dengan uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk
sterilisasi karena menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya tembus kuat
dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba
yang menyebabkan sel hancur. Suhu efektifnya adalah 121C pada tekanan 5 kg/cm2 dengan
waktu standar 15 menit. Alat yang digunakan : pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan
retort. Panas kering, biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat laboratorium. Suhu
efektifnya adalah 160C selama 2 jam. Alat yang sering digunakan pada umumnya adalah
oven (Hadioetomo, 1993).
Agar biakan murni dapat dibuat, medium harus steril sebelum inokulasi; yaitu kita
harus yakin bahwa tidak ada organismehidup dapat berada dalam medium jika diinokulasi.
Metode yang lazim digunakan untuk mensterilkan media ialah menempatkannya dalam
otoklaf (sebetulnya panci masak bertekanan besar dan dielaborasi). Otoklaf menggunakan
uap bertekanan untuk menaikkan suhu barang yang sedang disterilkan sampai suatu taraf
yang mematikan semua bentuk kehidupan. Untuk sterilisasi rutin, otoklaf biasanya
dioperasikan pada tekanan uap 15 lb/in2. Pada tekanan ini suhu menjadi 121C. Waktu yang
diperlukan pada suhu ini adalah 15 sampai 20 menit. Apabila medium berukuran besar
disterilkan, maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang, karena panas memerlukan
waktu untuk menembus bahan tersebut (Volk & Wheeler, 1993).
Metode sterilisasi secara fisik dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia
tidak akan berubah akibat suhu yang tinggi atau tekanan yang tinggi. Cara kerja dari panas
tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim dan
membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel.
Daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan

biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat mematikan daripada dipanasi secara kering
(Waluyo, 2005).
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan sterilisasi sistem batch adalah temperatur dan
lama pemanasan. Proses pemusnahan mikroba kontaminan dapat digambarkan sesuai reaksi
kimia orde satu yang memenuhi persamaan kinetika :
1. Dimana N adalah jumlah sel yang hidup pada waktu t tertentu, t adalah lama
sterilisasi dan Kd adalah konstanta laju kematian spesifik. Dengan memplot nilai
terhadap t, maka didapat garis lurus dengan kemiringan Kd. pada kematian
mikroorganisme

secara

sterilisasi

juga

berlaku

persamaan

Arhenius

yang

menunjukkan bahwa temperatur mempengaruhi konstanta laju kematian spesifik.

2. Dimana A adalah konstanta Arhenius, Ea adalah energi aktivasi, dan R adalah
konstanta gas dan T adalah temperatur absolut pemanasan. Dari persamaan ini terlihat
bahwa laju reaksi kematian sel akan meningkat jika temperatur sterilisasi meningkat
karena peningkatan temperatur menyebabkan peningkatan Kd. nilai Ea dan Kd
didapat dari hubungan pada persamaan Arhenius tersebut dengan cara mengalurkan ln
Kd terhadap 1/T (Achmad, 2007).
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna
untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat
dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba.
Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus
memenuhi syarat-syarat, antara lain:
1. harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba,
2. harus mempunyai tekanan osmosis,
3. tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan
tumbuh,
4. tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba,
5. harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang
ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Sutedjo, 1991).

Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi
padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agaragar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus
Gelidium, namun sebagian besar mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai
makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).
Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri
dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal
dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali
dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan
indikator. Komposisi media bakteri dapat dimodifikasi sehingga dapat digolongkan menjadi
media umum, media selektif (bakteri tertentu saja yang dapat tumbuh) dan media diferensial
(bakteri tumbuh dengan memberikan ciri-ciri tertentu) (Achmad, 2007).
Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai
media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wadah yang telah
disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan
cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara
menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah
mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya, semua media tersebut secara
komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrient Agar), TSA
(Trypticase Soy Agar) dan lain-lain. Bakteri, dari kata latin bacterium (jamak, bacteria)
adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan
kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa
nukleus (inti sel), Cytoskelen, dan organik lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena
bakteri merupakan prokaryota, untuk membedakan dengan organisme lain yang memiliki sel
yang lebih kompleks, disebut eukaryota. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari
semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air dan sebagai simbiosis
dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil,
biasanya berukuran 0.5 5 m, meskipun akan ada juga jenis yang dapat menjangkau 0.3
mm dalam diameter (Thiomargarita) (Rachdie, 2006).