PENDAHULUAN

Ilmu
genetika

Ge
n

Teknologi rekayasa
Silanas
genetika/ DNA
e
rekombinan
Hidrolisis silan
Mengurangi penggunaan
pelepasan lignin
klorin beracun agen
pemutih

Streptomyces dikenal spesies

xilanolitik dominan Actinomyces
menghasilkan enzim degradasi
hemiselulosa.

Bakteri temostabil
(actinomycetes, Eubacteria
dan archaea)

Meneliti kemungkinan penyisipan gen (kloning)

xinalase yang dihasilkan oleh Streptomises sp
THW31 ke bakteri Escherichia coli
Menghasilkan xinalase
dengan jumlah yang
banyak

TUJUAN PENELITIAN

Mendapatkan organisme yang menghasilkan enzim xilanase

yang termotoleran (mampu bertahan pada suhu tinggi seperti
pasteurisasi di atas 70C) serta termostabil.
Mengurangi penggunaan gas Klorin (bersifat racun) yang
digunakan sebagai agen bleaching (pemutih) dalam industri
kertas karena proses ini memisahkan xilan dari hemiselulosa
Mendapatkan organisme termotoleran yang mampu
menghasilkan xilanase termostabil untuk menguraikan xilan
dari hemiselulosa dalam jumlah besar.

BAHAN PENELITIAN
Bahan-bahan penelitian
a. E. Coli TOP10 sebagai host dan pZErO-2 sebagai vektor
b. E. coli DH5 sebagai sub kloning
c. E. coli roseta gami B sebagai kloning dan ekspresi gen xilanase
d. Xilan gandum, xilan birchwood, xilan beechwood, derivatif p-nitrofenil
e. Janggel jagung, kulit jagung, ampas gula tebu, jerami padi yang dipotong dalam ukuran
kecil dan dihaluskan
f.

Air suling jumlah cukup (sediakan 20 L sesuai kebutuhan)

PEMISAHAN MIKROORGANISME

Strain Streptomises sp THW31 dikumpulkan dan dipisahkan dari kompos dengan

medium xilan.
Medium xilan mengandung xilan gandum, ekstrak ragi, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4,
MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O dan MnSO4.
Sampel tanah 0,1 g dimasukkan dalam medium xylan 100 mL dalam flask Hinton 1000
mL dan diinkubasi dalam pengocok pada putaran 200 rpm suhu 60C selama 5 hari.
Kultur ini disebarkan pada piringan agar dan diinkubasi 5 hari pada suhu 60C
Daerah cerah yang dihasilkan strain pengurai xylan, terlihat dengan Congo merah 0,1%
dan dipindahkan dengan NaCl 1 M.
Strain THW31 pengurai xylan terkuat dipilih dan digunakan untuk identifikasi taksonomi
berbasis analisis rDNA 16s menggunakan metode Keichi et al (2000).

PENGARUH PRODUKSI ENZIM PEMECAH

HEMISELULOSA DENGAN SAMPAH PERTANIAN

Medium actinomices mengandung KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, ekstrak ragi, peptone, Tween
80 dan larutan unsur pelacak ditambahkan pada limbah pertanian untuk produksi enzim
hemiselulosa.

Strain THW31 Streptomyces sp dikulturkan dalam 50 mL medium actinomices yang

mengandung 3% sampah pertanian seperti janggel, kulit jagung, jermai padi dan ampas tebu
gula.

Setiap kultur dimasukkan ke dalam flask Hinton 250 mL dan dikocok pada suhu 60C selama 5
hari.

Xylan gandum 3% ditambahkan ke dalam medium yang sama untuk produksi enzim
hemiselulosaan ke dalam flask Hinton 250 mL dan dikocok pada suhu 60C selama 5 hari.

Adanya cairan yang terpisah pada lapisan atas (Kultur supernatan) dikumpulkan dan dianalisis
aktifitas xylanase, - xylosidase, -arabinofuranosidase dan acetyl xylan esterase.

ENZIM ASSAY

Aktifitas xinalase ditentukan dengan mendeteksi pengurangan gula yang dihasilkan dari xylan
gandum 1% menggunakan metode Bailey et al (1992).

Satu unit aktifitas enzim adalah jumlah enzim yang mengeluarkan 1 mol pengurangan gula
per menit.

Aktifitas -xylosidase, -arabinofuranosidase dan acetyl xylan esterase diukur menggunakan

substrat p-nitrophenyl--D-xylopyranoside (pNPX), p-nitrophenyl--L-arabinofuranoside (pNPA)
and p-nitrophenyl-acetate (pNA).

Seluruh campuran assay terdiri atas turunan 0,9 mL p-nitrophenyl (2 mM) dalam 100 mM
McIlvaine buffer (pH 6.0) dan volume yang sesuai dengan sampel enzim untuk menghasilkan
volume akhir 1 mL.

Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 65C selama 15 menit selanjutnya sodium karbonat
Na2CO3 1 mL dari 0,5 M ditambahkan untuk mengakhiri reaksi.

Jumlah nitrofenil yang dibebaskan dari substrat ditentukan dengan mengukur penyerapan
pada 410 nm.

Satu unit aktifitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 mol
nitrofenol per menit.

ANALISIS GEN DNA DAN NUKLEOTIDA

Gen xilanase ORF terdiri atas 123 pasangan basa (base pair atau bp) signal peptida dan 876
bp rangkaian nukleotida xylanase yang dewasa/matang.

Gen xilanase dikuatkan dengan Polimerase Chain Reaction (PCR) dan KOD plus Taq
Polimerase (Toyobo, Osaka, Jepang) sehingga primer dapat dideteksi.

Primer (strand DAN yang bertindak sebagai titik awal dalam sintesis DNA) F1 dan R1.

F1, 5'-CGGGATCCGGCACGGTCGTCACGACCAAC-3; adalah BamHI yang merupakan

endonuklease restriksi yang mampu mengenali potongan DNA pendek 6 pasang.

R1, 5'-CCAAGCTTTCAGCCCGCGCTGCAGGAGACC-3'; adalah HindIII (Hind D three

merupakan enzim restriksi deoksiribonukleas yang dipisahkan dari Haemophilus influenzae).

F1 dan R1 yang digarisbawahi merupakan daerah restriksi yang digunakan sebagai

pembacaan gen xilanase dan ekspresi gen pada E. coli.

Semua produk PCR dikuatkan dengan kondisi denaturasi (pemanasan 98C) dan annealing
(pendinginan 65C).

Hasil ini dimurnikan dan diikatkan pada pGEM Tvektor dan diberi nama pGEM xlnW31.

Plasmid ini memiliki tempat terbatas untuk kloning menjadi pQE80L.

EKSPRESI DAN PEMURNIAN GEN XILANASE

Fragmen gen xilanase dalam pGEM-xlnW31 dilepaskan melalui penyarian dengan BamHI
dan HindIII selanjutnya digabungkan dengan vektor ekspresi Pqe80l.
pGEM-xlnW31 selanjutnya diubah menjadi E. coli Rosetta gami B (DE3) dan transforman
dikulturkan pada agar-agar LB yang ditambahkan dengan ampicillin (100 g/mL) dan
kanamisin (34 g/mL) pada 37C selama 24 jam.
Aktifitas xilanase transforman positif dimonitor dan ditambahkan 0,5% (w/v) xylan gandum
AZCL, 1 mM IPTG dan 100 g/mL ampicillin.
Transforman E. coli dibiakkan dalam LB yang ditambah ampisilin 100 g/mL dan 34
g/mL kanamisin sehingga kerapatan optik mencapai 600 nm.
Suspensi disentrifugal pada 12000 rpm selama 12 menit untuk menghilangkan butiran.
Hasil supernatan dimurnikan dengan Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography
(IMAC) pada Sepharose 6 fast flow colom (GE heathcare Jepang).
Pemurnian fraksi yang mengandung xylanase diyakinkan dengan Sodium Dodecyl
Sulphate (SDS-PAGE).

KARAKTERISASI ENZIM
Enzim xilanase murni dalam E. coli digunakan untuk karakterisasi enzim.
Menggunakan 3 buffer berbeda pada pH 3-11 yaitu:
a. McIlvaine buffer (pH 3.0 to 7.0)
b. Tris-HCl buffer (pH 7.0 to 9.0)

Aktifitas residual pada suhu optimum

c. glycine-NaOH (pHdi
9.0bawah
to 11.0) kondisi assay standar
ditentukan.
Stabilitas termal dilakukan pengamatan pada suhu 50-70C
Efek ion metal (1 mM) dan pengaruh zat lain pada aktifitas xylanase diamati melalui pre
inkubasi enzim murni dalam lingkungan ion metal dan zat lain yang paralel dengan
kontrol yang tidak diberi treatment.
Aktifitas residual pada suhu optimum di bawah kondisi assay standar ditentukan.

PENGIKATAN ASSAY
Uji ikatan dilakukan dengan menambah enzim murni (5 U/mg) ke berbagai jumlah
avicel atau xylan gandum yang tidak larut dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifuge.
Sampel diletakkan pada suhu 60 C selama 1 jam selanjutnya disentrifugal.
Aktifitas xilanase dalam supernatan ditentukan dengan metode standar
Aktifitas supernatan yang hilang dianggap sebagai enzim yang terikat

SDS PAGE DAN ZIMATOGRAFI

Dilakukan dengan gel poliakrilamid berdasarkan metode Laemmli
Protein terlihat melalui warna Coomassie Brilliant Blue (CBB).
Zimografi dilakukan pada SDS-PAGE dengan gel poliakrilamid ditambah xylan
gandum.
Aktifitas xylanase pada gel dideteksi dengan metode Nakamura .
SDS dihilangkan dari gel SDS-PAGE dengan digoncangkan perlahan dalam
isopropanol.
Gel dicuci 2 kali dengan air suling agar isopropanol hilang.
Ketika daerah tidak berwarna muncul maka gel dicampur dengan asam asetik.

HASIL PENELITIAN

Screening dan identifikasi silan yang

terdegradasi oleh strain Streptomyces
Strain Streptomyces THW31 yang mampu mendegradasi
silan
Hasil amplifikasi fragment 16S rDNA (sekitar 1406 bp;
accession no.GU929208) strain ini termasuk dalam
spesies Streptomyces dg kemiripan 99,8% strain S.
rochei HBUM174096 (accession no. EU841560), strain S.
enissocaesilis NRRL B-16365 (DQ026641), S. olivaceus
(AB184730), strain bakterium Actinomycetales R10 (2010)
R10 (HM007159).
Dapat disimpulkan bahwa strain ini merupakan
Streptomyces sp. THW31.

Induksi enzim degradasihemiselulosa dengan silan

Tabel 1. Induksi enzim-hemiselulase terkait Streptomyces
sp. THW31 oleh xilan yang mengandung limbah pertanian.

Streptomyces sp. THW31 diolah pada suhu 60 C selama 5 hari pada media
Actinomyces yang mengandung substrat yang berbeda. Jumlah aktivitas
xilanase yang kecil (0,9-2,5 U/ml) diamati, ketika xilosa dan glukosa
digunakan sebagai sumber karbon dalam medium Actinomyces. Hasil
disajikan sebagai rata-rata standar deviasi dalam supernatan kultur dari

Kloning dan analisis sequencing gen

silanase dari Streptomyces sp. THW31

Gambar 3. Nukleotida dan penarikan kesimpulan sequence

asam amino silanase XlnW31 dari Streptomyces sp.
THW31. Lokasi sisi ikatan-ribosom digaris bawahi dan
signal peptida ditebalkan. Kodon start ditulis dengan huruf
besar. Gly-yang kaya ikatan diberi tanda kotak dan asam
amino yang komposisinya CBD family 2 dari XlnW31 diberi
tanda garis dua. Pengawetan dua katalis asam glutamat
(E128 dan E218) diberi tanda bayangan. Transkripsi kodon
stop ditunjukkan oleh tanda bintang.

Gambar 4. (a) Prediksi model struktur tiga dimensi

XynW31; (b) Struktur superposisi XynW31 (merah
muda) dan struktur template Xyl1 (merah), family 11
endo-silanase dari Streptomyces sp. S38 (Wouters et
al., 2001).

Ekspresi dan pemurnian rekombinan

XlnW31 dari E. coli

Gambar 5. Coomassie biru-noda

gel SDS-PAGE dan zymogram
XlnW31 yang telah dimurnikan
dari E. coli Rosetta gami (DE3)
yang mengandung pQE-xlnW31.
Lane M, marker massa molekul;
lane 1, ekstrak bebas sel dari E.
coli yang mengandung pQE80L;
lane 2, ekstrak bebas sel dari
E.coli yang mengandung pQExlnW31, lane 3, XlnW31 yang
telah dimurnikan dengan IMAC;
lane 4, zymogram dari XlnW31
yang telah dimurnikan oleh
IMAC.

Tabel 2. Rangkuman pemurnian XlnW31

Karakterisasi XlnW31
Gambar 6. Pengaruh pH () dan
stabilitas pH () pada uji aktivitas
silanase pada 60 oC selama 1 jam.
Aktivitas silanase diuji menggunkana
buffer dengan rentang pH dari pH 3,0
hingga 11,0. Simbol yang digunakan:
padat dan open circles, buffer McIlvaine
untuk pH 3,0 hingga 7,0; pada padat dan
Open Square, buffer Tris-HCl untuk 7,0
hingga 9,0 dan padat dan open triangles,
glisin-NaOH untuk pH 9,0 hingga 11,0.

Gambar 7. Pengaruh temperature

pada aktivitas silanase yang telah
dimurnikan

Gambar 8. Profil termostabil dari

silanase yang telah dimurnikan.
XlnW31
yang
telah
dimurnikan
diinkubasi tanpa subtrat pada 100
mM buffer McIlvaine (pH 6,0) pada
temperature yang berbeda selama
selama 2 jam dan residu aktivitas
diukur seperti yang dijelaskan pada
bahan dan metode. Simbo yang
digunakan solid circles 50 oC; solid
Tabel
3. triangles
Subtrat spesifik
XlnW31
squares 60 oC, dan
solid
70
o
C.

a, tidak ada aktivitas yang terdeteksi melalui Avicel, selulosa

karboksimetil (CMC), glukomonnan, spino gum, locust bean gum, pnitrofenil--D-silopironosida, p-nitrofenil--L-arabinofuranosida, pnitrofenil--D-glukopiranosida; b, aktivitas dari XlnW31 yang telah
dimurnikan mengarah pada silan kayu beech yaitu 414,8 U/mg, yang
didefinisikan sebagai 100%. Hasilnya diekspresikan sebagai rata

Tabel 4. Pengaruh ion logam dan reagen

pada XlnW31
Aktivitas dari XlnW31 yang
telah dimurnikan mengarah
pada silan gandum kering
yaitu 494,4 U/mg, yang
didefinisikan
sebagai
100%.
Hasil
tersebut
diekspresikan sebagai ratarata standar deviasi dari
tiga jenis bagian yang tidak
tergantung
pada
percobaan.

Gambar 9. Ikatan XlnW31 yang

telah
dimurnikan
pada
silan
gandum yang tidak larut dan
Avicel. Percobaan ikatan dilakukan
pada 60 oC selama 1 jam. Aktivitas
residu
pada
supernatant
ditentukan dengan cara seperti
yang dijelaskan pada bahan dan
metode. Simbol: solid squares,
silan gandum yang tidak terlarut

Gambar 10. Hidrolisis silan oleh XlnW31 yang

telah dimurnikan diidentifikasi menggunakan
TLC. Pengamatan menggunakan simbol X1
silosa, X2 silobiosa, X3 silotrios, dan X4
silotetraosa.

KESIMPULAN
Streptomyces sp. THW31 dapat menghasilkan enzim
silanase yang mampu mendegradasi silan
Aktivitas tertinggi pada pH 6,0 dan pada temperature
65 hingga 70 oC (XlnW31)
XlnW31 tertahan aktivitasnya pada rentang pH yang
cukup lebar yaitu pH 5,0 hingga 11,0 dan pada
temperature mencapai 60 oC selama 2 jam.
Enzim ini memiliki sifat termostabil
Enzim ini berhasil memproduksi oligosakarida dari silan
yang tersedia secara komersial dan limbah pertanian
enzim ini merupakan kandidat yang menarik pada
proses
produksi
secara
komersil
dan
dapat
diaplikasikan pada industri

TERIMA
KASIH