BAB III

METODE PENELITIAN

A. Subjek Penelitian
Populasi penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague
dawley berumur 10-16 minggu yang diperoleh dari laboratorium Balai Penelitian
Veteriner (BALITVET) Bogor. Sampel penelitian sebanyak 25 ekor yang dipilih secara
acak yang dibagi dalam 5 kelompok. Menurut Dahlan (2009), pada uji eksperimental
ini, variabel yang diuji adalah numerik tidak berpasangan sehingga perhitungan sampel
dihitung dengan rumus:

n1=n2=2

( Z + Z ) S
x 1x 2

Dengan nilai Z = 1,96; Z = 0,84; simpangan baku = S dan perbedaan rerata

gambaran mikroskopis hepar diharapkan sebagai ( x 1x 2 ) dengan memasukkan data

26

masing-masing peningkatan pada indikator tersebut kedalam rumus maka akan

diperoleh jumlah sampel yang digunakan sebagai berikut:
S= 0,2028
x 1x 2=0,355, makaakan didapatkan perhitungan sebagaiberikut :

( Z +Z ) S
n1=n2=2
x 1x 2

(1,96+ 0,84 ) 0,2028

n1=n2=2
0,355

n1=n2=2

0,56784
0,355

n1=n2=2 [ 1,5 ]

n1=n2=4,5

Maka jumlah minimal sampel perkelompok dibulatkan adalah 5 ekor tikus per
kelompok.

27

Jadi sampel yang akan digunakan adalah berdasarkan perhitungan, yaitu sejumlah 5
ekor tikus pada masing-masing kelompok percobaan dan jumlah kelompok yang
digunakan adalah 5 kelompok, sehingga untuk satu tanaman herba menggunakan 25
ekor tikus putih.
Kriteria inklusi:
1. Sehat (tidak tampak penampakan rambut kusam, rontok, atau botak, dan bergerak
aktif);
2. Memiliki berat badan sekitar 100-150 gram;
3. Berjenis kelamin betina;
4. Berusia sekitar 8-16 minggu (dewasa).
Kriteria eksklusi:
1. Sakit (penampakan rambut kusam, rontok atau botak dan aktivitas kurang atau tidak
aktif, keluarnya eksudat yang tidak normal dari mata, mulut, anus, genital);
2. Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa adaptasi dilaboratorium;
3. Mati selama masa pemberian perlakuan.

B. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik yang menggunakan

metode rancangan acak terkontrol dengan pola post test-only control group design.
Sebanyak 25 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague dawley

28

berumur 8 -16 minggu yang dipilih secara acak dan dibagi menjadi 5
kelompok,dengan pengulangan sebanyak 5 kali.

C. Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FK Unila untuk mengetahui

gambaran mikroskopis hepar. Waktu penelitian selama bulan April 2013.

D. Rancangan Penelitian

1. Pembagian Kelompok
Pembagian kelompok dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
Tikus sebanyak 25 ekor, dikelompokkan dalam 5 kelompok. Kelompok I sebagai
normal, hanya yang diberi aquades kontrol. Kelompok II sebagai kontrol
patologis, diberikan DMBA dengan dosis 20 mg/kgBB. Kelompok III adalah
kelompok perlakuan coba dengan pemberian dosis ekstrak daun sirsak (Annona
muricata Linn) dengan dosis 100 mg/KgBB, kelompok IV dengan dosis ekstrak
daun sirsak (Annona muricata Linn) dengan dosis 200 mg/KgBB dan kelompok V
dengan dosis ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn) sebanyak 400 mg/kgBB.

2. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas

: Ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn)

29

b. Variabel Terikat

: Gambaran histopatologi kerusakan sel hepar tikus

yang ditandai tanda nekrosis seperti piknotik, karioreksis maupun kariolisis.

c. Variabel Luar
Variabel Luar Terkendali

: Jenis makanan dan minuman, galur mencit, umur ,

jenis kelamin tikus, suhu udara ruangan

Variabel Luar Tak Terkendali : Kondisi psikologis tikus , alergi, dan daya
regenerasi kerusakan sel hepar masing-masing tikus serta daya imunitas tikus.
3. Konversi Dosis
Dosis normal pada manusia adalah 12 mg/kgBB (Rahmawati, 2006). Angka
konversi dari manusia dengan berat badan 70 kg ke tikus dengan berat badan 200
g adalah 0,018.

Dosis tikus(200g)

= 12mg/kgBB x 70 kg x 0,018
= 840mg x 0,018= 15,12mg/200gBB

Dosis untuk 100 g tikus adalah 7,56 mg/100gBB. Dalam penelitian ini kelompok
kontrol negatif dan kontrol positif tidak diberikan daun sirsak (Annona muricata
Linn). Dosis pertama daun sirsak (Annona muricata Linn) diambil dari dosis
normal tikus, sedangkan dosis kedua diambil dari hasil pengalian 2x dosis

30

pertama dan dosis ketiga diambil dari hasil pengalian 4x dari dosis pertama atau
2x dari dosis kedua.
1) Dosis untuk tiap tikus kelompok III
7,56 mg/100gBB
2) Dosis untuk tiap tikus kelompok IV
2 x 7,56 mg/100gBB = 15,12 mg/100gBB
3) Dosis untuk tiap tikus kelompok V
4 x 7,56 mg/100gBB = 30,24 mg/100gBB
Hal ini berarti sebagai berikut:
Pada berat tikus rata-rata sekitar 100 mg atau 0,10 kg maka dosis perekor tikus
sebesar:
20 mg/kgBB x 0,10kg = 0,20 g = 200 mg

Volume ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn) diberikan secara oral sebanyak
1 ml yang merupakan volume yang boleh diberikan berdasarkan pada volume
normal lambung tikus yaitu 3-5 ml. Jika volume ekstrak melebihi volume lambung,
dapat berakibat dilatasi lambung secara akut yang dapat menyebabkan robeknya
saluran cerna (Ngatidjan, 2006).

31

E. Pengukuran Hasil Penelitian

a. Variabel bebas

: Ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn)

Dosis normal pada manusia adalah 12 mg/kgBB (Rahmawati, 2006). Angka

konversi dari manusia dengan berat badan 70 kg ke tikus dengan berat badan 200
g adalah 0,018.

Dosis tikus(200g)

= 12mg/kgBB x 70 kg x 0,018
= 840mg x 0,018= 15,12mg/200gBB

Dosis untuk 100 g tikus adalah 7,56 mg/100gBB. Dalam penelitian ini kelompok
kontrol negatif dan kontrol positif tidak diberikan daun sirsak (Annona muricata
Linn). Dosis pertama daun sirsak (Annona muricata Linn) diambil dari dosis
normal tikus, sedangkan dosis kedua diambil dari hasil pengalian 2x dosis
pertama dan dosis ketiga diambil dari hasil pengalian 4x dari dosis pertama atau
2x dari dosis kedua.
4) Dosis untuk tiap tikus kelompok III
7,56 mg/100gBB
5) Dosis untuk tiap tikus kelompok IV
2 x 7,56 mg/100gBB = 15,12 mg/100gBB
6) Dosis untuk tiap tikus kelompok V

32

4 x 7,56 mg/100gBB = 30,24 mg/100gBB

Hal ini berarti sebagai berikut:
Pada berat tikus rata-rata sekitar 100 mg atau 0,10 kg maka dosis perekor tikus
sebesar:
20 mg/kgBB x 0,10kg = 0,20 g = 200 mg
Volume ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn) diberikan secara oral sebanyak
1 ml yang merupakan volume yang boleh diberikan berdasarkan pada volume
normal lambung tikus yaitu 3-5 ml. Jika volume ekstrak melebihi volume lambung,
dapat berakibat dilatasi lambung secara akut yang dapat menyebabkan robeknya
saluran cerna (Ngatidjan, 2006).
Skala yang digunakan adalah ordinal
b. Variabel Terikat

: Kerusakan sel hepar tikus

Kerusakan sel hepar adalah gambaran mikroskopik histopatologi hepar mencit

yang mengalami nekrosis yang dihitung dari 100 sel sentrolubuler pada
pembesaran 1000 kali.
Adapun tanda sel hepar mengalami nekrosis adalah ;
1) Sel yang mengalami pyknosis intinya kisut dan bertambah basofil, berwarna
gelap (hiperkromatis) batasnya tidak teratur.
2) Sel yang mengalami karyorrhexis yang intinya mengalami fragmentasi atau
hancur dengan meninggalkan pecahan-pecahan zat kromatin yang tersebar
dalam sel.

33

3) Sel yang mengalami karyolisis yaitu kromatin basofil menjadi pucat, inti sel
kehilangan kemampuan untuk diwarnai dan menghilang (Price dan Wilson,
2006)
Skala yang digunakan adalah rasio.
c. Variabel Luar

Variabel Luar Terkendali

1) Jenis makanan dan minuman

: Makanan yang diberikan adalah pellet

dan minuman air PAM.

2) Galur mencit dan umur tikus

: Sprague dawley usia 8 16 minggu.

3) Jenis kelamin tikus, suhu ruangan

: Jenis kelamin betina dengan suhu

ruangan peneltian adalah 25 28 0 C.

Variabel Luar Tak Terkendali

1) Kondisi Psikologis

: Sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang

gaduh, pemberian perlakuan yang berulang, dan kadang perkelahian antar

tikus. Untuk itu tempat dibagi 5 kelompok dan dijauhkan dari keramaian
manusia.
2) Regenerasi kerusakan sel hepar : Daya regenasi tidak sama.
3) Daya imunitas tikus yang tidak sama.

34

F. Pelaksanaan Penelitian
1. Bahan dan Alat Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan ada dua yaitu DMBA dengan dosis 20 mg/kgBB,
kemudian ekstrak daun sirsak ( Annona muricata Linn) dengan dosis 100
mg/KgBB, 200 mg/KgBB, dan 400 mg/KgBB.

Bahan Kimia
Bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat histopatologi dengan metode
paraffin meliputi: larutan formalin 10% untuk fiksasi, alkohol 70%, alkohol 96%,
alkohol absolut, etanol, xylol, pewarna Hematoksilin dan Eosin, dan entelan (FK
Unila, 2011).
Alat Penelitian
Alat alat dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
a. Neraca analitik Metler Toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 g, untuk
menimbang berat tikus;
b. Spuit oral 1 cc, 3 cc dan 5 cc;
c. Minor set, membedah tikus untuk mengidentifikasi hepar;
d. Kapas dan alcohol;

35

e. Alat pemeriksaan mikroskopis:Mikroskop, objek glass, cairan emersi;

f. Kamera digital.
2. Langkah langkah Penelitian
1). Prosedur Pemberian Ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn)
Proses pembuatan ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn) dalam penelitian
ini menggunakan etanol sebagai pelarut. Penelitian ini menggunakan pelarut
etanol, untuk membedakan dengan penelitian sebelumnya oleh Singh dkk.,
(2009) yang menggunakan pelarut air.
Menurut Sulistianto dkk., (2004), ekstraksi dimulai dari penimbangan daun
sirsak (Annona muricata Linn). Selanjutnya dikeringkan dalam almari pengering,
dibuat serbuk dengan menggunakan blender atau mesin penyerbuk. Etanol
dengan kadar 70% ditambahkan untuk melakukan ekstraksi dari serbuk ini
selama kurang lebih 2 (dua) jam kemudian dilanjutkan maserasi selama 24 jam.
Setelah masuk ke tahap filtrasi, akan diperoleh filtrat dan residu. Filtrat yang
didapatkan akan diteruskan ke tahap evaporasi dengan Rotary evaporator pada
suhu 40 0C sehingga akhirnya diperoleh ekstrak kering.
2). Prosedur Pemberian Dosis DMBA
Dosis DMBA yang digunakan dalam penelitian ini adalah berdasarkan dari hasil
penelitian sebelumnya diberikan sebanyak 20 mg/kgBB selama 5 minggu.

36

Diberikan 2 kali dalam seminggu. Dosis ini merupakan dosis toksik pada tikus
dimana dengan dosis 20 mg/kgBB sudah dapat menginduksi peningkatan enzim
sitokrom P450, peroksidasi lipid, aktivitas superoxide dismutase (SOD) di hati
dan sumsum tulang belakang(Dhuley dan Naik, 1998).
2). Prosedur Penelitian

Tikus sebanyak 25 ekor, dikelompokkan dalam 5 kelompok. Kelompok I

sebagai normal, hanya yang diberi aquades kontrol. Kelompok II sebagai
kontrol patologis, diberikan DMBA dengan dosis 20 mg/kgBB. Kelompok
III adalah kelompok perlakuan coba dengan pemberian dosis ekstrak daun
sirsak (Annona muricata Linn) dengan dosis 100 mg/KgBB, kelompok IV
dengan dosis ekstrak daun sirsak (Annona muricata Linn) dengan dosis 200
mg/KgBB dan kelompok V dengan dosis ekstrak daun sirsak (Annona
muricata Linn) sebanyak 400 mg/kgBB.

Setelah 4 minggu, perlakuan diberhentikan;

Selanjutnya tikus dibius dengan kloroform dan dilakukan pembedahan;

Dilakukan pemeriksaan morfologi hepar secara mikroskopis:

Organ

hepar

dibuat

Hematoksilin-Eosin.

preparat

Kemudian

histopatologi
preparat

dengan

histopatologi

pewarnaan
dikirim

ke

laboratorium Patologi Anatomi untuk dikonsultasikan dengan ahli patologi

anatomi.Pengamatan mikroskopis dilakukan oleh peneliti sendiri.

37

3.

Pemeriksaan Histopatologis dan Tehnik Analisis

Setelah hari ke-28 atau minggu ke-4 hwan percobaan dikorbankan dengan cara
dibius dengan ester. Kemudian organ hepar diambil untuk selanjutnya dibuat
preparat histopatologi dengan metode blok paraffin dengan pengecatan HE. Tebal
irisian hepar adalah 3-8 m. Pembutan preparat diambil masing perkelompok.
Kemudian diamati pada pembesaran 100 kali untuk melihat 4 lapang pandang
yakni pada bagian jam 12, 3, 6, dan 9 yang persebaran kerusakannya merata. Dari
zona sentrolobuler lobulus hepar tersebut dengan pembesaran 1000 kali kemudian
ditentukan jumlah sel yang mengalami nekrosis yaitu ditandai dengan inti piknosi,
karioreksis dan kariolisis dari tiap 100 sel. Hasil yang diperoleh dari tiap kelompok
kemudian dirata-rata dan selanjutnya dibandingkan dengan rata-rata kelompok
yang lainnya dengan uji Oneway ANOVA. Jika ada perbedaan bermakna dilanjutkan
dengan uji Post Hoc. Jika tidak terpenuhi maka akan dilakukan uji non-parametrik
yaitu Kruskal-Willis dan dilanjutkan uji Mann Whitney. Data diolah dengan
program komputer Stastical Product and Service Solutions (SPSS).17.0 for
windows ( Dahlan, 2006).