BAB III

METODE PENELITIAN
A. Bahan dan Subyek Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi PGV-0 murni secara
KLT (kromatografi lapis tipis) yang diperoleh dari hasil sintesis CRC (Curcumin
Research Center) Fakultas Farmasi UGM, kitosan viskositas rendah (KVR, Sigma
Aldrich), natrium alginat (Shadong Bio-Technologi, Shanghai), kalium diklofenak
(Cataflam, Novartis, Jakarta), karagenin kappa (Sigma Chemical Co.), natrium
karboksi metil selulosa, HCl p.a., NaCl p.a., MgCl2 p.a., KCl p.a., CaCl2 p.a. dan
NaHCO3 p.a., CH3COONa p.a., asam asetat glasial, etil asetat p.a., etanol 96%
teknis (CV General Labora, Yogyakarta), akuades teknis (CV General Labora,
Yogyakarta), NaCl 0,9% (PT Otsuka, Jakarta), dan tikus (Rattus norvegisus) galur
Wistar (Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Fakultas Farmasi UGM).
Subyek dalam penelitian in vivo untuk uji anti inflamasi adalah tikus
(Rattus norvegicus) jantan galur Wistar dengan berat badan antara 120-180 gram,
dan umur 3-4 bulan. Keterangan kelaikan etik tertera pada Lampiran 8.

B. Peralatan
Alat gelas (Pyrex), mikropipet (pipetPAL), neraca analitik (Sartorius BP
310 P), pH meter (Hanna), vortex mixer (Thermolyne Type 16700 Mixer),
hotplate and magnetic stirrer (Stuart CB162), Stuart Overhead Stirrer Model
SS30, rotary evaporator (Stuart RE300), water bath (Stuart RE300DB), vacuum
pump (Diaphragm Vacuum Pump GM-0.33II), waterbath shaker (Orbit),
26

27

ultrasonic bath (Transsonic 570), Spektrofotometer (Genesys 10 UV Scanning),

centrifuge (eppendorf Centrifuge 5804 R), transmission electron microscopy
(JEOL JEM 1400), DelsaTM Nano Submicron Particle Size and Zeta Potential
Analyzer (Beckman Coulter), dan pletismometer (UGO Basile 7140).

C. Jalannya Penelitian
1. Formulasi nanopartikel PGV-0 dengan kitosan viskositas rendah
alginat
Formulasi nanopartikel pada penelitian ini dipengaruhi oleh 3 faktor,
yaitu PGV-0, kitosan viskositas rendah (KVR), dan natrium alginat dengan
berbagai seri konsentrasi. Formulasi dimulai dalam skala kecil menggunakan
tabung mikro yaitu dengan volume akhir sebanyak 1 mL. Sebanyak 0,5 mL
larutan KVR dalam dapar asetat pH 4,0 dicampurkan dengan 0,5 mL larutan
PGV-0 dalam etanol teknis 96%, kemudian dilakukan pencampuran
menggunakan vortex. Setelah pencampuran berlangsung selama 20 detik,
larutan natrium alginat dalam akuades sebanyak 0,5 mL dimasukkan ke dalam
campuran tersebut. Campuran tersebut di-vortex kembali selama 20 detik.
Pada tahap akhir tutup tabung dibuka agar pelarut organik PGV-0 menguap
hingga volume akhir menjadi 1 mL. Sistem dispersi yang stabil merupakan
formula yang terpilih dan dilakukan scaling up pada volume 10 mL.
Formulasi nanopartikel pada skala akhir 10 mL menggunakan cara
yang sama dengan formulasi skala 1 mL. Perbandingan volume larutan PGV-0
KVR alginat tetap 1 : 1 : 1 (masing-masing 2,5 mL). Namun ada

28

perbedaan pada alat pencampur yang digunakan, yaitu Stuart Overhead

Stirrer Model SS30, dengan kecepatan putar sebesar 2000 rpm dan lama
pencampuran 10 menit. Penguapan dilakukan dengan menuangkan campuran
pada cawan petri, agar penguapan berjalan lebih cepat (kontak dengan udara
luar lebih besar). Kemudian sambil diuapkan, campuran diaduk dengan
magnetic stirrer pada suhu ruang selama 15 menit (volume akhir menjadi 7,5
mL).

2. Uji stabilitas fisik

Formula yang digunakan untuk uji stabilitas fisik adalah hasil scaling
up pada volume 10 mL pada beberapa formula terpilih. Dispersi yang
terbentuk dimasukkan ke dalam tabung yang telah diberi skala ukuran panjang
menggunakan kertas millimeter blok, dan didiamkan pada rak dengan posisi
tegak. Pengamatan kecepatan pengendapan dilakukan pada hari ke-0, 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, dan 14.

3. Scale up nanopartikel PGV-0 KVR alginat formula terpilih

Formula yang di-scale up menjadi volume akhir 100 mL adalah 5
formula terpilih yang memiliki stabilitas fisik yang paling baik dan dengan
pertimbangan efektivitas dan efisiensi produksi. Pembuatan formula dengan
skala 100 mL ini serupa dengan cara pembuatan formula nanopartikel skala
10 mL. Perbandingan volume larutan PGV-0 KVR alginat tetap 1 : 1 : 1
(masing-masing 50 mL), kecepatan putar tetap 2000 rpm. Akan tetapi lama

29

pengadukan lebih lama yaitu 20 menit. Penguapan dilakukan menggunakan

rotary evaporator (Stuart RE300) pada pemanasan penangas air (Stuart
RE300DB) suhu 50oC dengan skala putar 7 (kecepatan putar alat antara 20
190, hingga pelarut organik PGV-0 menguap semua, dengan kata lain volume
akhir menjadi 100 mL.

4. Karakterisasi nanopartikel
a) Penentuan ukuran dan potensial zeta nanopartikel
Pengukuran dilakukan menggunakan alat Particle Size Analyzer
(PSA) di Balai Inkubator Teknologi Badan Pengkajian dan Penerapan
Teknologi (BIP-BPPT) Serpong-Tangerang pada suhu 25oC dengan
refraksi indeks 1,3328 dan viskositas 0,8878 cP. Sampel nanopartikel
sejumlah 2 tetes dimasukkan ke dalam kuvet dan ditambahkan 5 mL
akuabides, kemudian sampel tersebut ditentukan ukuran partikelnya
menggunakan alat DelsaTM Nano Submicron Particle Size and Zeta
Potential Analyzer (Beckman Coulter).
b) Pengamatan morfologi nanopartikel
Pengamatan morfologi nanopartikel PGV-0 KVR alginat
menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Copper grid ditetesi
dengan sampel nanopartikel kemudian dilapisi karbon dengan alat Auto
Carbon Coated (JOEL JEC-560, Japan) selama 5 detik kemudian
dikeringkan pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah sampel nanopartikel
kering dilapisi lagi dengan carbon kemudian copper grid dimasukkan ke

30

dalam holder dan sampel siap dianalisis dengan percepatan voltage 120
kV dan magnifikasi 40.000.
c) Entrapment efficiency (%)
Efisiensi penjerapan PGV-0 dalam kompleks KVR alginat
dilakukan menggunakan metode ekstraksi. Sebanyak 3 x 1,5 mL formula
nanopartikel diendapkan dengan sentrifugasi 10000 rpm 10oC selama 10
menit. PGV-0 bebas (tak terjerap dalam kompleks KVR alginat) dalam
supernatan diekstraksi menggunakan 2,5 mL etil asetat dengan cara divortex.

Fase

etil

asetat

diukur

absorbansinya

menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm untuk mengetahui

kandungan PGV-0 bebasnya.
d) Entrapment stability test
Guna mengetahui stabilitas penjerapan PGV-0 dalam kompleks
KVR alginat pada pH cairan lambung dan usus. Formula nanopartikel
PGV-0 KVR alginat diinkubasi dalam Artificial Gastric Fluid (AGF)
(0,2% NaCl; 0,26% HCl; pH akhir 1,2) dan Artifisial Intestinal Fluid
(AIF) (20 mM bikarbonat; 139 mM klorida; 5 mM kalium; 140 mM
sodium; 4 mM kalsium; dan 3 mM magnesium; pH akhir 7,0). Sebanyak 7
mL volume formula nanopartikel dimasukkan ke dalam 93 mL AGF / AIF,
kemudian digoyangkan dengan alat shaker waterbath pada suhu 37oC dan
kecepatan pengadukan 100 rpm. Sampel diambil tiap jam selama 4 jam
untuk pengujian dalam cairan lambung buatan dan 5 jam untuk pengujian

31

dalam cairan usus buatan.

Untuk mengetahui kandungan PGV-0 bebas, tiap kali pengambilan
sampel adalah 3 x 1,5 mL. Cuplikan diendapkan dengan sentrifugasi
10000 rpm 10oC selama 10 menit. PGV-0 bebas (tak terjerap dalam
kompleks KVR alginat) dalam supernatan diekstraksi menggunakan 2,5
mL etil asetat dengan cara di-vortex. Fase etil asetat diukur absorbansinya
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm.
5. Uji aktivitas antiinflamasi metode radang buatan
Uji daya antiinflamasi formula nanopartikel PGV-0 KVR
alginat dilakukan dengan mengukur penghambatan pembentukan udem
kaki tikus (Rattus norvegicus) putih jantan galur Wistar. Hewan uji yang
telah dipuasakan selama 1 hari, dibagi menjadi 10 kelompok (masingmasing kelompok 3 ekor) dan diberi larutan uji secara per oral sesuai yang
tertera pada Tabel 1. Kaki kanan tiap tikus diberi tanda batas di atas tumit
dan diukur volumenya menggunakan pletismometer sebagai volume
telapak kaki mula-mula. Selanjutnya kaki tersebut diinjeksi secara
intraplantar dengan karagenin 1%, dan langsung diukur kembali
volumenya sebagai volume udem menit ke-0. Pengukuran volume udem
kaki hewan uji dilakukan tiap 30 menit selama 6 jam dan dilanjutkan
kembali pada jam ke-24.

32

Tabel 1. Pembagian kelompok hewan uji dalam uji antiinflamasi penghambatan volume
udem kaki tikus terinduksi karagenin

Kelom
pok
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Perlakuan
Blangko Na-CMC 0,5%
Kontrol positif kalium diklofenak dosis 2,25 mg/KgBB
Blangko matriks KVR-alginat (konsentrasi tertinggi pada
nanopartikel terpilih)
Kontrol pembanding PGV-0 dosis 5 mg/KgBB
Kontrol pembanding PGV-0 dosis 20 mg/KgBB
Kontrol pembanding PGV-0 dosis 40 mg/KgBB
Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 3 mg/KgBB (Nano A)
Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 5 mg/KgBB (Nano B)
Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 3 mg/KgBB (Nano C)
Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 5 mg/KgBB (Nano D)
Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 5 mg/KgBB (Nano E)

D. Analisis
1. Pengukuran uji stabilitas fisik formula dilakukan terhadap tinggi lapisan
paling atas endapan relatif yaitu dihitung menggunakan persamaan 1.
tinggi endapan pd hari ken
Tinggi endpaan relatif (HR) = tinggi endapanmulamula .......................
(1)
2. Ukuran dan distribusi partikel nanopartikel dapat diamati dengan Particle
Size Analyzer (PSA) dan morfologinya dengan alat transmission electron
microscopy (TEM).
3. Entrapment efficiency (EE (%)) PGV-0 dalam nanopartikel kitosan-alginat
ditetapkan dengan mengukur post-polimerization free drug. Kadar PGV-0
yang tidak terjerap ditetapkan menggunakan spektrofotometer, dan nilai
efisiensinya ditentukan dengan rumus :
EE =

Konsentrasi PGV 0total Konsentrasi PGV 0bebas

x 100 ....
Konsentrasi PGV 0 total

(2)

33

34

4. Stabilitas nanopartikel ditetapkan dengan menghitung kadar PGV-0 yang

terlepas setiap satuan waktu selama inkubasi. Kadar PGV-0 ditetapkan
menggunakan spektrofotometer. Persentase nanopartikel PGV-0 yang masih
stabil dihitung dengan rumus :
NanoPGV 0=

Konsentrasi PGV 0totalKonsentrasi PGV 0terlepas

x 100
Konsentrasi PGV 0total

..

(3)
5. Uji aktivitas antiinflamasi metode radang buatan ditetapkan dengan
memperhitungkan luas daerah di bawah kurva dari data volume udem. Nilai
AUC (Area Under Curve) kelompok perlakuan dibandingkan dengan AUC
kelompok kontrol dari 0 sampai 24 jam untuk memperoleh daya antiinflamasi.
a. Perhitungan nilai volume udem (
V u =V t V p
t

Vu

), diperoleh dengan rumus :

..

(4)

Keterangan:
Vut

= volume udem pada waktu t

Vt

= volume kaki tikus pada waktu t

Vp = volume kaki tikus sebelum injeksi karagenin

b. Nilai AUC antar waktu pengamatan dihitung dengan rumus :
tn

AUC t n1

(Vt n1 +Vt n )
t .
2

(5)
Keterangan:

35

Vtn-1

= volume udem pada waktu pengamatan sebelumnya

Vtn

= volume udem pada waktu tn

= selisih waktu pengukuran

36

c. Nilai daya antiinflamasi (DAI) dihitung menggunakan rumus :

DAI ( )=

AB
100 ..
A

(6)

Keterangan:
A = AUC0-24jam kelompok kontrol

B = AUC0-24jam kelompok perlakuan

d. Daya hambat inflamasi diuji statistik menggunakan pirantik lunak
Statistical Product and Service Solutions (SPSS).

E. Bagan Alur Penelitian

Gambar 10. Bagan alur penelitian