Pada percobaan ini dilakukan pewarnaan spora.

Pewarnaan spora ini sangat

penting dalam pembelajaran mikrobiologi di farmasi, karena tidak semua bakteri
mampu membentuk spora sehingga adanya spora dapat dijadikan indikator untuk
jenis bakteri tertentu, selain itu lokasi spora membantu identifikasi berbagai
spesies bakteri. Spora bakteri berfungsi sebagai mekanisme pertahanan dari
lingkungan yang ekstrim. Bakteri yang dapat membentuk spora berasal dari
bakteri Gram Positif, seperti dari genus Bacillus, Clostridium.
Dalam pengamatan kali ini digunakan bakteri bacillus subtilis sebagai sample,
karena Bacillus subtilis mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora
yang protektif yang memberi kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan
yang ekstrim. Bacillus subtilis juga merupakan flora normal yang ada di sistem
pencernaan manusia dan menghasilkan enzim proteolytic yaitu subtilisin. Dalam
jumlah normal bakteri ini tidak akan memberikan efek yang serius bagi tubuh
manusia, tetapi dalam jumlah banyak dapat menyebabkan gastroenteritis.
Baccillus subtilis merupakan jenis kelompok bakteri termofilik yang dapat
tumbuh pada kisaran suhu 45 C 55 C dan mempunyai pertumbuhan suhu
optimum pada suhu 60 C 80 . Bacillus subtilis selnya berbentuk basil, ada
yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Semua
membentuk endospora yang berbentuk bulat dan oval.
Ada beberapa metode yang digunakan untuk pewarnaan spora, diantaranya Untuk
metode pewarnaan spora ini digunakan biakan yang tua (sekitar 72 jam) karena
Spora umumnya tidak terdapat pada kultur muda dan menjadi banyak pada kultur
yang tua. Pembentukkan spora segera terjadi pada kondisi lingkungan yangtidak
menguntungkan. Spora sangat tahan panas, kekeringan, radiasi, desinfektan
dan pembekuan untuk jangka waktu yang lama.
Didalam suspensi bakteri ditambah karbol fukhsin sebanyak 1:1, hal ini
merupakan bagian dari tahap pewarnaan spora. Pada tahap pewarnaan ini
dilakukan pemanasan supaya zat warna dapat menembus dinding spora. Larutan
ini memberi warna biru. Endospora sukar menyerap zat warna, tetapi sekali diberi

zat warna, warna tersebutsulit dilunturkan. Dalam praktikum pewarnaan spora

pada bakteri Bacillus subtilis setelah diberi warna merah menggunakan karbol
fukhsin dilakukan pemanasan selama 10 menit pada suhu 800C dalam kondisi
tersebut, lingkungan akan merugikan sel bakteri karena dapat mematikan bakteri,
pada kondisi seperti itu bakteri akan membentuk spora untuk melindungi dirinya
dari kondisi lingkungan yang merugikan. Selain itu pemanasan ini ditujukan
untuk membantu masuknya pewarna menembus kulit spora yang tebal, dengan
adanya pemanasan pori- pori membesar , spora meregang dan zat warna dapat
masuk dengan mudah. Pewarna pertama untuk spora belum tentu karbolfuksin
yang berwarna merah, bisa juga menggunakan pewarna lain, missal malachite
green yang berwarna hijau, tapi proses tetap diikuti dengan pemanasan. Karbol
fukhsin segera masuk ke dalam spora dan spora yang telah terpisah dari sel
vegetatif akhirnya terlihat berwarna hijau pada perbesaran dengan mikroskop.
Selanjutnya karena spora telah terpisah dari sel vegetatif dan berwarna oleh karbol
fukhsin, maka sel vegetatif terakhir terlihat berwarna biru karena warna yang
terserap adalah warna biru dari metilen biru yang terakhir diberikan dan dibiarkan
1 menit, dibilas dan dikeringkan.
Pembilasan dengan H2SO4 akan melunturkan warna karbol fukhsin dari sel
vegetatif. H2SO4 berfungsisebagai agen dekolorisasi sel. Pewarna kedua yaitu
metilen biru yang bersifat. Larutan ini digunakan untuk mewarnai sel vegetatif
sehingga timbul warna biru, warna ini tidak mempengaruhi warna merah dari
spora. Spora tahan proses pewarnaan biasa, hal ini karena dinding spora lebih
bersifat impermeabel dan spora mengandung sangat sedikit air, tetapi beberapa
pewarnaan biasa dapat dipaksa masuk ke dalam spora dengan cara pemanasan
(melalui pori-pori spora zat warna dapat masuk). Sekali spora menyerap zat warna
maka spora tidak mudah didekolorisasi (penghilangan warna),sedangkan zat
warna dapat dengan mudah dicuci dari sel vegetatif. Karena itu saat olesan dicuci
dan diberi pewarna tandingan dengan zat warna kedua, spora akan tetap
mempertahankan pewarna pertama dan sel vegetatif akan menunjukkan pewarna

dari pewarna kedua. Larutan pewarna dari pewarna gram tidak akan mewarnai
spora dan akibatnya spora memiliki warna yang berbeda dari sel vegetatifnya.
Pada pengecatan spora metode Klein dapat dilihat bahwa bagian yang berwarna
biru merupakan sel bakteri itu sendiri karena bakteri pertama diberi zat warna
fuchsin setelah difiksasi. Sedangkan ada bintik-bintik kecil yang berwarna merah,
itulah yang disebut sebagai spora bakteri..
Dari hasil pengamatan di atas dapat diketahui juga jenis spora dari bakteri
Bacillus subtilis, yaitu endospora karena berupa tubuh berdinding tebal, sangat
refraktif, dan sangat resisten. Jika kita lihat, spora bakteri (bintik-bintik berwarna
merah) terdapat pada ujung dari sel vegetative bakteri, sehingga berdasarkan letak
sporanya dapt dikategorikan sebagai spora terminal, yaitu spora yang dibentuk di
ujung sel bakteri.