Implikasi Homosistein Thiolactone dan Protein Homocysteinylation untuk

Aterosklerosis di Sel Endotel Manusia

Hieronim Jakubowski, Li Zhang, Arlene Bardeguez, Abram Aviv
Abstrak- Pengubahan asam amino nonprotein homosistein oleh aminoasil-tRNA sintetase
tertentu menghasilkan homocysteine thiolactone thioester. Di sini kami menunjukkan bahwa
dengan adanya konsentrasi fisiologis homosistein, metionin, dan asam folat, sel endotel vena
umbilikalis manusia secara efisien mengubah homocysteine menjadi thiolactone. Tingkat
konversi ini berbanding lurus dengan konsentrasi homosistein dan berbanding terbalik
dengan konsentrasi metionin, menunjukkan keterlibatan methionyl-tRNA sintetase. Asam
folat menghambat sintesis thiolactone dengan menurunkan homocysteine dan meningkatkan
konsentrasi metionin pada sel endotel. Kami juga menunjukkan bahwa tingkat protein
homocysteinylation pasca-translasi meningkat dengan meningkatnya kadar homosistein tetapi
menurun dengan meningkatnya asam folat dan kadar HDL dalam kultur sel endotel. Data ini
mendukung hipotesis bahwa konversi metabolisme homosistein menjadi thiolactone dan
protein homocysteinylation dengan thiolactone mungkin memainkan peran dalam kerusakan
vaskular yang disebabkan homosistein.
Kata Kunci: homosistein, protein, lipoprotein HDL, sel endotel, aterosklerosis

Peningkatan kadar asam amino nonprotein homosistein (Hcy) berhubungan dengan penyakit
vaskuler pada manusia. Namun, tidak diketahui mengapa Hcy bisa berbahaya. Konversi Hcy
menjadi thiolactone sebagai akibat dari kesalahan perubahan fungsi beberapa aminoasiltRNA sintetase (AARS dalam Persamaan 1) adalah salah satu akibat dari metabolisme Hcy
yang dapat menjelaskan efek merugikan dari tingkat Hcy yang tinggi.

Konversi ini melibatkan reaksi Hcy dengan ATP untuk membentuk homocysteinyl adenilat
yang terikat AARS (Hcy~AMP) dan pirofosfat anorganik, PP i. Hcy yang tidak teraktivasi
tidak ditransfer ke tRNA oleh salah satu sintetase ini. Sebaliknya, Hcy~AMP mengalami
reaksi dimana gugus thiol rantai samping (SH dalam Persamaan 2) dari Hcy menggantikan
gugus AMP dari karboksilat Hcy yang diaktifkan, membentuk Hcy thiolactone sebagai
produk (Persamaan 2). Energi ikatan anhidrida dari Hcy~AMP adalah kekal dalam ikatan
intramolekuler thioester dari thiolactone. Akibatnya, thiolactone Hcy reaktif secara kimiawi
dan kelompok amino bebas acylates, seperti kelompok rantai samping protein lisin. Protein
terhomosisteinylasi kehilangan aktivitas biologisnya.
Hcy thiolactone, awalnya ditemukan dalam kultur sel mikroba, juga disintesis oleh sel-sel
non vaskuler mamalia tingkat tinggi. Sedangkan methionyl-tRNA sintetase terlibat dalam
sintesis thiolactone dalam semua jenis sel yang diperiksa, isoleucyl- dan leucyl-tRNA
sintetase juga dapat mengkonversi Hcy menjadi thiolactone, setidaknya pada bakteri. Karena

karakter sebagian besar netral pada pH fisiologis (pK=57.1; Reference 15), thiolactone
terakumulasi dalam media kultur. Sejumlah kecil Hcy hadir dalam protein.

Tidak diketahui apakah sintesis Hcy thiolactone terjadi pada sel-sel endotel vaskular
manusia. Jika tidak, ini bisa memberikan mekanisme kimia yang masuk akal menjelaskan
toksisitas Hcy pada endotel vaskular manusia, kerusakan yang memainkan peran sentral
dalam aterosklerosis. Vena umbilikalis sel manusia endotel (HUVECs), yang sering
digunakan sebagai model sel vaskular, telah dilaporkan memiliki aktivitas hidrolisis Hcy
thiolactone dan karena itu dianggap tidak mampu mendukung sintesis thiolactone. Namun,
dalam studi ini, kami menemukan bahwa HUVEC pada kultur dapat memetabolisme Hcy
menjadi thiolactone secara efisien dan memberikan bukti pembentukan Hcy menjadi protein
posttranslational pada kultur. Kami juga memeriksa faktor yang mempengaruhi sintesis
thiolactone dan protein homocysteinylation pada HUVEC.

Bahan dan Metode

Kultur Sel
HUVEC diperoleh dari tali pusar 6 bayi baru lahir sehat. Setiap tali pusar secara terpisah
diambil dalam larutan (dalam mmol/L) yang mengandung HEPES (pH 7.3) 10, NaCl 140,
KCl 4, dan glukosa 11; 50 mg/ mL penisilin; dan 100 mg/ mL streptomisin (Sigma). Sel
endotel diisolasi dengan kolagenase treatment dalam waktu 4 sampai 5 jam setelah
melahirkan. Sel ditanamkan dalam 75-cm2 wadah kultur dilapisi dengan kolagen dan dan
dalam kultur M199 (Life Technologies, Inc) pada 37 C/5% CO2, ditambah dengan 15%
FBS, heparin, faktor pertumbuhan sel endotel sapi, dan antibiotik seperti di atas.
Persiapan L- [35S] Hcy Thiolactone dan L- [35S] Hcy
Metode Baernstein digunakan untuk mengkonversi 5 mCi L- [35S] Met (Amersham) menjadi
L- [35S] Hcy thiolactone. L- [35S] Hcy thiolactone dimurnikan dengan kromatografi lapis

tipis 2-dimensi (TLC). [35S] Hcy segar disiapkan untuk setiap percobaan dengan hidrolisis
L- [35S] Hcy thiolactone (1 mmol / L, 10 000 Ci / mol) dengan NaOH di hadapan DTT.

Persiapan HDL
HDL dibuat dari serum manusia dengan ultrasentrifugasi kalium bromida (densitas 1,225 g /
mL) dan filtrasi gel pada kolom Sephacryl HR S-300 (Pharmacia) dengan adanya 1 mmol / L
CaCl2.
[35S] Met dan [35S] Hcy Kondisi Pelabelan
HUVEC berkembang dalam wadah 3,5 cm. Media kemudian diganti dengan 0,5 mL M199
bebas (Met) metionin dilengkapi dengan 15% FBS, heparin, dan faktor pertumbuhan sel
endotel sapi yang didialisis; 5 micromol/L [35S] Met (0,05 mg / mL); atau 5 sampai 100
micromol / L [35S] Hcy (0,05 mg / mL), dan kultur dipertahankan pada 37 C / 5% CO2
hingga 48 jam. Karena streptomisin menghancurkan Hcy thiolactone (lihat Hasil), kami
membilas sel dengan media bebas streptomisin sebelum menambahkan media bebas Mer
segar dan bebas streptomisin mengandung S-labeled asam amino.
Penentuan Hcy Thiolactone, Hcy, dan Hcy-Protein
Hcy thiolactone ditentukan oleh TLC 2-dimensi di media selulosa (Kodak). Total Hcy
ditentukan oleh karboksimetilasi sampel DTT yang mendapat perlakuan diikuti oleh TLC 1dimensi di media selulosa. Penentuan [35S] Hcy dan [35S] Met protein seluler dan
ekstraseluler, diperlakukan dengan 10 mmol / L DTT (5 menit, 25 C), dilakukan sebagai
seperti yang telah dijelaskan. Hcy DTT-labil direpresentasikan hingga 60% dari total Hcy
yang dimasukkan ke dalam protein.
Degradasi Edman
Degradasi Edman DTT yang mendapat perlakuan dan protein berlabel carboxymethylated
[35S] Hcy dilakukan seperti yang telah dijelaskan oleh Chang. Phenylthiohydantoin (PTH) (S-karboksimetil) Hcy standar oleh degradasi Edman pada serum protein homocysteinylated
in vitro pada manusia.
Hasil
Sintesis Hcy Thiolactone Dari Hcy endogen
Dalam sel manusia, Hcy endogen terbentuk dari Met dalam reaksi enzimatik yang dimulai
dengan pembentukan S-adenosyl (Ado) Met. Sebagai hasil dari reaksi metilasi berikutnya,
AdoMet diubah menjadi AdoHcy. AdoHcy kemudian dihidrolisis menjadi Hcy, yang dapat
dikonversi menjadi thiolactone, terutama ketika konversi menjadi Met dengan folate- dan
vitamin B12 tergantung transmetilasi, atau sistein dengan vitamin B6 tergantung jalur
transulfurasi dikompromikan. Untuk menguji sintesis thiolactone dari Hcy endogen di
HUVEC, kami menginkubasi sel dengan 5 mmol / L [35S] Met hingga 48 jam. Sebagian

besar (0,95%) [35S] Met dimetabolisasikan dalam waktu 20 jam. 3% dari [35S] Met yang
tetap di media setelah 20 jam (Tabel 1) adalah, kemungkinan besar, omset protein. Delapan
puluh tiga persen dari [35S] Met yang dimetabolisme dimasukkan ke protein yang ditentukan
oleh asam trikloroasetat sel ex-traktat (tidak ditampilkan). Sekitar 4% dari [35S] Met yang
dimetabolisme diubah menjadi [35S] Hcy thiolactone (Gambar 1A), yang sebagian besar
terakumulasi dalam media kultur (Tabel 1). Dalam studi sebelumnya, 13% dari [35S] Met
dimetabolisme menjadi [35S] Hcy, yang sebagian besar terakumulasi dalam media kultur
(Gambar 1B). Selain itu, asam folat menghambat sintesis thiolactone di HUVEC,
kemungkinan besar dengan memfasilitasi transmetilasi dari Hcy untuk berpenggabungan
dengan Met synthase. Hal ini terlihat dengan penambahan 10 mmol/ L asam folat untuk
kultur HUVEC. Selain untuk mencegah akumulasi kedua thiolactone (Gambar 1A) dan Hcy
(Gambar 1B) dalam media kultur dan sel (Tabel 1). Data ini menunjukkan bahwa Hcy
endogen secara efisien dimetabolisme untuk thiolactone oleh HUVEC dan metabolisme
dihambat oleh suplementasi dengan asam folat.

Tingkat Hcy Thiolactone Apakah Proporsional dengan Konsentrasi eksogen Hcy

Kinetika sintesis thiolactone dari Hcy eksogen diperiksa pada konsentrasi fisiologis Hcy (10
sampai 80 mmol / L), asam folat (26 nmol / L; Reference 22), dan vitamin B12 (180 pmol / L
dari serum; Referensi 22) . Akumulasi Thiolactone berkorelasi positif dengan waktu inkubasi
dan konsentrasi Hcy (Gambar 2A). Sampai dengan 4 mmol / L thiolactone terakumulasi
dalam media kultur dalam kondisi ini, mewakili sampai 5% Hcy eksogen. Ada sangat sedikit
(0,1%) penggabungan Hcy eksogen dengan label 35S menjadi protein selular, sebagaimana
ditentukan oleh asam trikloroasetat ekstrak sel (tidak ditampilkan). Dengan demikian,
konversi metabolisme Hcy ke thiolactone merupakan jalur utama pada kondisi ini.

Met Menghambat Sintesis Hcy Thiolactone

Kami selanjutnya meneliti efek dari konsentrasi fisiologis Met pada kinetika sintesis
thiolactone dari [35S] Hcy. Pada rendah (10 mmol / L) dan tinggi (80 mmol / L) konsentrasi
[35S] Hcy, 5 sampai 20 mmol / L Met semakin menghambat sintesis [35S] Hcy thiolactone
(Angka 2B dan 2C). Pada saat inkubasi, 20 jam, tingkat yang lebih besar dari penghambatan
oleh Met ditemukan daripada di kemudian hari. Bahkan di hadapan 20 mmol / L Met, hingga
1 mmol / L [35S] Hcy thiolactone dibentuk dari 80 mmol / L [35S] Hcy (Gambar
2C). Dengan 40 mmol / L [35S] Hcy, Met semakin menghambat sintesis [35S] Hcy
thiolactone, mencapai setinggi penghambatan 80% pada 40 mmol / L Met setelah 48 jam
(Gambar 4D). Hasil ini menunjukkan keterlibatan methionyl-tRNA sintetase dalam sintesis
thiolactone di HUVEC.

Suplementasi Dengan Asam Folat atau HDL Menghambat Sintesis Hcy Thiolactone
Pengaruh suplementasi dengan asam folat, methylcobalamine, dan HDL pada kinetika
sintesis thiolactone dari Hcy eksogen dalam kultur HUVEC ditunjukkan pada Gambar
2D. Pada [35S] Hcy rendah (10 mmol / L), suplementasi dengan 10 mmol / L asam folat
mengakibatkan .90% penghambatan sintesis thiolactone (Gambar 2D). Pada [35S] Hcy tinggi

(80 mmol / L), penghambatan sintesis thiolactone oleh asam folat kurang (75%), dan
thiolactone
(1
mmol
/
L)
masih
terbentuk
secara
signifikan
(tidak
ditampilkan). Methylcobalamine (1,5 mmol / L) hanya memiliki efek yang kecil (10%
penghambatan 20%) pada sintesis thiolactone (Gambar 2D). Sekitar 5% dari label 35S dari
eksogen [35S] Hcy dimasukkan ke protein seluler dari kultur asam folat dilengkapi (tidak
ditampilkan). Lebih Met dan kurang Hcy hadir dalam sel dipertahankan dalam medium asam
folat suplemen daripada di media diberi suplemen (Tabel 1). Temuan ini mendukung peran
folat dalam transmetilasi dari Hcy ke Met juga di HUVECs.
Karena mengandung Hcy terikat erat thiolactonase sebagai salah satu komponennya, 23 HDL
harus menghambat akumulasi Hcy thiolactone. Memang, suplementasi kultur HUVEC
dengan HDL menyebabkan 80% penghambatan sintesis thiolactone (Gambar 2D). Waktu
paruh dari thiolactone menurun dari 3,5 jam dalam kultur diberi suplemen sampai 10 menit
dalam kultur HDLsupplemented (tidak ditampilkan).
Omset Hcy Thiolactone
Dalam M199 tanpa antibiotik, thiolactone dihidrolisis untuk HCY dengan paruh 3,5 jam
dengan dan tanpa kehadiran HUVEC (Gambar 3A), menunjukkan bahwa omset Gambar 3.
Omset Hcy thiolactone dalam kultur HUVEC. [35S] Hcy thiolactone (5 mmol / L) diinkubasi
di M199 dilengkapi dengan 15% didialisis FBS, heparin, dan faktor endotel sapi
pertumbuhan sel dalam ketiadaan (F) dan kehadiran (M) sel konfluen (A) atau dalam tidak
adanya (F) dan kehadiran (M) dari 0,1 mg / mL streptomisin (B) thiolactone dalam kultur
HUVEC adalah karena hidrolisis oleh media, bukan oleh sel. Namun, dalam media yang
mengandung antibiotik, thiolactone diserahkan lebih cepat, dengan waktu paruh 10 menit
(Gambar 3B). Hal ini disebabkan reaksi orde kedua dari thiolactone dengan
streptomisin. Reaksi thiolactone dengan streptomisin (k52000 (mol z L) -1 zh-1) adalah 400
kali lebih cepat dibandingkan dengan lisin (K55 (mol z L) -1 zh-1; Referensi
10). Kemungkinan kimia mungkin melibatkan kelompok aldehida streptomisin membentuk
basis aduk Schiff dengan kelompok thiolactone a-amino.

Pendirian Hcy Ke Protein

Untuk menentukan apakah Hcy dapat dimasukkan ke dalam protein, kami siap seluler dan
ekstraseluler [35S] protein dari [35S] Hcy-berlabel HUVECs dan asam-dihidrolisis mereka
untuk membebaskan mereka [35S] asam amino, yang kemudian dipisahkan oleh 2-dimensi
TLC . Selain [35S] Met, sejumlah besar [35S] Hcy hadir dalam protein. Jumlah Hcy
dimasukkan ke dalam protein adalah sebanding dengan konsentrasi Hcy dalam kultur
HUVEC dalam kisaran 3-100 mmol / L (Angka 4A dan 4B). Hcy penggabungan ke protein
intraseluler berkisar antara 20% (pada Hcy rendah) sampai 95% (pada Hcy tinggi) dari Met
penggabungan (Gambar 4A). Protein ekstraseluler dimasukkan 2 sampai 4 kali lipat lebih
Hcy dari Met (Gambar 4B). Penggabungan Hcy mewakili '20% dari Hcy thiolactone hadir
dalam kultur HUVEC (Gambar 4C).
Kami juga meneliti efek dari suplementasi dengan asam folat, Met, dan HDL, yang masingmasing menghambat secara tidak langsung atau langsung pembentukan thiolactone Hcy, pada
homocysteinylation protein. Asam folat dihapuskan penggabungan Hcy menjadi protein
seluler dan ekstraseluler (Tabel 2), kemungkinan besar dengan memfasilitasi transmetilasi
dari Hcy ke Met, sehingga secara tidak langsung mencegah sintesis Hcy thiolactone (Tabel
1). Seperti yang diharapkan, '10 kali lebih Met dimasukkan ke protein di hadapan 10 mmol /
L asam folat dari dalam ketiadaan (Tabel 2). Sekitar 70% penghambatan penggabungan Hcy
ke protein diamati di hadapan 20 mmol / L Met, mungkin karena Met menghambat sintesis
thiolactone (Gambar 4D). HDL, tampaknya karena terkait erat Hcy thiolactonase, yang
menghidrolisis thiolactone (Gambar 2D), menghambat penggabungan Hcy dengan protein
ekstraselular. Namun, HDL tidak mempengaruhi penggabungan Hcy dengan protein
intraseluler (Tabel 2). Penggabungan Met dengan protein seluler dan ekstraseluler tidak
terpengaruh oleh HDL, seperti yang diharapkan.

Hcy Apakah Pulih Dari Protein Dikenakan Edman Degradasi

Untuk menentukan apakah penggabungan Hcy dengan protein adalah pasca-translasi atau
translasi, [35S] protein dari kultur HUVEC menjadi sasaran degradasi Edman. Asam amino
memiliki kelompok-amino bebas yang dilepaskan dari protein setelah 1 siklus degradasi
Edman. Dengan demikian, Hcy dimasukkan pasca translasi akibat homocysteinylation oleh
thiolactone dari kelompok amino rantai samping residu lisin protein akan dirilis oleh
degradasi Edman.
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 5, degradasi Edman dibebaskan oleh PTH- (Skarboksimetil) - [35S] Hcy dari [35S] protein yang diperoleh dari kultur HUVEC yang

diinkubasi dengan (dalam mmol / L) 10 (jalur 1), 40 (jalur 2), dan 80 (jalur 3) [35S]
Hcy. Kuantifikasi tempat yang diberi radiolabel oleh sintilasi penghitungan menunjukkan
bahwa PTH- (S-karboksimetil) - [35S] Hcy mewakili '30% dari total [35S] protein (tidak
ditampilkan). Kurangnya PTH- (S-karboksimetil) - [35S] Hcy yang dibebaskan dari protein
[35S] yang diperoleh dari kultur ditambah dengan 20 mmol / L Met (jalur 4) atau 1 mg / mL
HDL (jalur 6). Apalagi PTH- (S-karboksimetil) - [35S] Hcy yang dibebaskan dari protein
[35S] yang diperoleh dari kultur ditambah dengan 10 mmol / L asam folat (jalur 5) atau 10
mmol / L asam folat dan 1,5 mmol / L methylcobalamine ( jalur 7). Bintik-bintik samar PTH[35S] Met, bermigrasi dekat dengan bagian atas pelat TLC di jalur 5 dan 7 kemungkinan
besar karena N-terminal Met yang diamati diharapkan bergabung dengan protein dalam
kultur asam folat.
Jumlah Terbatas Ekstraseluler Protein Menjadi 35S Berlabel
Untuk menentukan apakah protein ekstraseluler spesifik menjadi 35S berlabel, kami
memeriksa media yang bebas sel SDS-PAGE dari HUVEC dipertahankan pada [35S] Hcy,
sesuai standar protein homocysteinylated in vitro dalam serum manusia. Seperti ditunjukkan
dalam Gambar 6, pola protein SDS-PAGE [35S] diperoleh dengan protein ekstraseluler yang
berbeda dengan pola standar N- [35S] Hcy-protein dalam serum manusia. Seperti yang
disarankan oleh kepadatan ikatan yang menonjol dan massa molekul jelas, 10 N-Hcy-protein
utama hadir dalam homocysteinylated serum albumin in vitro (68 kDa), subunit dari IgG (50
dan 25 kDa), transferin (80 kDa), dan mikroglobulin (180 kDa) (jalur 3 pada Gambar
6). Selain ikatan radiolabeled albumin, 5 pita protein yang berbeda (dari berat molekul '45,
'50, dan '180, dengan 2 dari 0,200 kDa) yang terlihat pada pola SDS-PAGE yang diperoleh
dengan sampel protein (mengandung hingga 80 % [35S] Hcy-protein; lihat Gambar 4B) dari
kultur HUVEC dipertahankan pada (dalam mmol / L) 2 (jalur 2), 10 (jalur 6), 40 (jalur 5),
dan 80 (jalur 1) [35S] Hcy. Protein yang berbeda ini menjadi lebih berat dengan diberi label
[35S] Met (Tabel 2) dalam kultur ditambah dengan asam folat (jalur 4). Hal ini menunjukkan
bahwa protein yang baru disintesis dari HUVEC yang disekresikan, adalah target untuk
homocysteinylation protein.

Pembahasan

Data kami menunjukkan bahwa (1) Hcy thiolactone merupakan komponen penting dari
metabolisme Hcy dalam sel endotel vaskular manusia; (2) Hcy dimasukkan ke dalam
protein; dan (3) tingkat pembentukan thiolactone dan homocysteinylation protein tergantung
pada konsentrasi ekstraseluler Hcy, asam folat, dan HDL, dan faktor-faktor yang telah terlibat
dalam kerentanan terhadap penyakit vaskular pada manusia. Dalam kondisi metabolik yang
diregulasi (folat rendah, Hcy tinggi), protein homocysteinylation meningkat relatif terhadap
kondisi metabolik normal (folat tinggi, Hcy rendah). Kemampuan untuk mendukung sintesis
thiolactone dan protein homocysteinylation dapat mendasari kerentanan sel endotel manusia
terhadap aterosklerosis yang diinduksi kerusakan Hcy.

Dudman et al melaporkan bahwa HUVEC tidak ditemukan fungsinya dalam hidrolisis

thiolactone. Sebaliknya, kami mendeteksi sintesis thiolactone sangat efisien dalam sel-sel ini
(Gambar 1 dan 2). Sebuah penjelasan yang mungkin untuk temuan oleh Dudman et al adalah
bahwa penghapusan lengkap dari streptomisin (hadir dalam media kultur sel endotel yang
digunakan oleh Dudman et al17) akan menyebabkan aktivitas thiolactonase palsu dalam uji
rilis thiol tidak langsung. Namun, plot Lineweaver-Burk dari aktivitas yang diamati oleh
Dudman et al membuat penjelasan ini tidak mungkin. Penjelasan lain yang mungkin untuk
perbedaan tersebut bisa menjadi perbedaan antara donor HUVEC yang digunakan dalam 2
studi.
HUVEC mengeluarkan sejumlah besar Hcy ketika mereka yang dikultur dalam standar
menengah mengandung Met yang berisi 26 nmol / L asam folat (Referensi 22 dan pekerjaan
ini). Namun, selain Hcy, HUVECs juga mensintesis thiolactone dalam jumlah
besar. Meskipun 26 nmol / L asam folat ternyata cukup untuk mendukung pertumbuhan Met
di HUVEC, itu tidak cukup untuk transmetilasi dari Hcy ke Met dalam sel-sel
ini. Suplementasi media kultur dengan 10 mmol / L asam folat pada transmetilasi dari Hcy ke
Met dan mencegah akumulasi dari kedua Hcy dan thiolactone. Karena bentuk thiolactone
Hcy di aktif bagi methionyl-tRNA sintetase, 3,5 sintesis thiolactone diperkirakan akan
meningkat dengan peningkatan rasio Hcy / Met. Memang, sintesis thiolactone oleh HUVEC
meningkat dengan peningkatan konsentrasi Hcy dan menurun dengan peningkatan
konsentrasi Met. Faktor-faktor seperti asam folat yang mempengaruhi rasio Hcy / Met di
plasma1,22 manusia juga sintesis thiolactone terkena dampak dalam sel pembuluh darah
(studi ini).

Sejumlah besar Hcy juga ditemukan dimasukkan ke dalam protein seluler dan ekstraseluler
dalam kultur HUVEC, sampai dengan 4 kali lipat lebih Hcy dari Met yang tergabung di
hadapan Hcy tinggi dan kadar folat rendah. Mekanisme yang tepat dari penggabungan Hcy
menjadi protein tidak diketahui. Namun, pemulihan Hcy dari protein ini dengan degradasi
Edman menunjukkan bahwa penggabungan Hcy kemungkinan besar karena
homocysteinylation kelompok amino protein dengan thiolactone. Tidak hanya sintesis
thiolactone tetapi juga protein homocysteinylation dipengaruhi oleh kadar Hcy, folat, dan
HDL, yang semuanya telah dikaitkan dengan penyakit pembuluh darah.
Peningkatan kadar Hcy merupakan faktor risiko independen untuk penyakit vaskular. Namun
tidak jelas mengapa kelebihan Hcy berbahaya. Hipotesis berikut telah diusulkan untuk
menjelaskan efek Hcy. Hcy dapat menyebabkan kerusakan oksidatif sel endotel,
meningkatkan pertumbuhan otot polos pembuluh darah, dan menghambat regenerasi sel
endotel.Penghambatan pertumbuhan sel endotel mungkin akibat dari penghambatan metilasi
oleh Hcy. Selain itu, Hcy dapat mempengaruhi mekanisme pembekuan darah, sehingga
meningkatkan keadaan prothrombotic. Perubahan dalam ekspresi beberapa gen yang
diinduksi oleh Hcy dalam sel endotel juga bisa berkontribusi terhadap aterosklerosis. Namun,
dalam sebagian besar percobaan yang menyebabkan hipotesis ini, konsentrasi
nonphysiological dari Hcy (1 sampai 10 mmol / L) yang digunakan, dan, di mana dilaporkan,
efek yang sama diamati dengan sistein atau 2-mercaptoethanol. Meskipun efek Hcy terhadap
pertumbuhan dan metilasi ditemukan pada konsentrasi Hcy fisiologis, efek ini hanya bisa
diamati pada adenosin tingkat tinggi, yang tidak hadir dalam sel manusia.
Temuan kami yang thiolactone dan Hcy-protein yang hadir dalam kultur HUVEC
mendukung hipotesis alternatif, yaitu, bahwa konversi metabolisme Hcy untuk thiolactone,
homocysteinylation protein, dan menghasilkan protein menyebabkan kerusakan toksisitas
Hcy pada endotel manusia. Protein homocysteinylation spesifik untuk Hcy karena
thiolactone-metabolit menghasilkan modification- hanya bisa timbul dari Hcy.The sintesis
thiolactone dan homocysteinylation protein terjadi pada konsentrasi fisiologis Hcy dan
tergantung pada rasio Hcy / Met, yang pada gilirannya tergantung pada folat. Dengan
menggunakan media folat terbatas, kami mampu memperoleh tingkat thiolactone dan proteinHcy di HUVEC kultur setidaknya 100 kali lebih tinggi dari tingkat yang diamati dalam
percobaan sebelumnya dengan kultur fibroblast, sehingga menunjukkan bahwa kurangnya
folat merupakan penentu utama sintesis thiolactone efisien dan homocysteinylation protein.
Hcy thiolactone diketahui menjadi racun bagi sel-sel endotel. Sebagai contoh, infus kronis
babun dengan Hcy thiolactone menyebabkan cedera sel endotel. Thiolactone, tapi tidak Hcy,
ditemukan untuk menginduksi perubahan gross morfologi sel endotel dan menginduksi
kematian sel. Perlu dicatat, bagaimanapun, bahwa tidak diketahui apakah efek ini disebabkan
oleh homocysteinylation protein.
Itu homocysteinylation protein mungkin fisiologis merugikan disarankan oleh beberapa
penelitian. Misalnya, enzim, seperti metrs dan tripsin, dinonaktifkan oleh
homocysteinylation.Lysyl oksidase, suatu enzim penting yang bertanggung jawab untuk
pasca-translasi modifikasi penting untuk biogenesis matriks jaringan ikat, tidak aktif oleh
thiolactone Hcy, yang memodifikasi aktif-situs tyrosinequinone kofaktor. Selain itu,
homocysteinylated sitokrom c sangat rentan terhadap agregasi, dan homocysteinylation
protein dapat merugikan fisiologis dengan memunculkan respon imun, seperti yang
ditunjukkan pada kelinci diimunisasi dengan LDL homocysteinylated.

Kesimpulannya, karya ini menunjukkan bahwa dalam sel endotel vaskular manusia Hcy
dimasukkan ke dalam protein dan bahwa penggabungan ini, serta pembentukan thiolactone,
tergantung pada Hcy ekstraseluler, asam folat, dan HDL. Pada tahap ini, temuan kami dan
pengamatan oleh orang lain, menunjukkan bahwa homocysteinylation protein mengganggu
fungsi fisiologis, tidak membangun kausalitas Hcy di aterosklerosis. Namun, mereka
menekankan pentingnya memeriksa homocysteinylation protein dalam konteks patologi Hcy
diinduksi pada manusia.