POKOK BAHASAN :
1. Teknik Pewarnaan GRAM (Pewarnaan Differensial)
2. Uji Katalase
3. Pembuatan stok agar miring
TUJUAN PRAKTIKUM :
1. Mempelajari cara menyiapkan apusan bakteri dengan baik sebagai prasyarat untuk mempelajari
teknik pewarnaan;
2. Mempelajari prosedur Pewarnaan Gram, memahami tahapan prosedur dan reaksi kimiawi yang
terlibat dalam prosedur.
3. Mempelajari salah satu uji biokimia katalase untuk identifikasi awal bakteri
TINJAUAN PUSTAKA :
Bakteri isolat tunggal dapat disimpan dalam waktu lama (4-6 bulan) dengan menggunakan agar
miring pada suhu dingin. Media padat dibuat menjadi agar miring di dalam Penyimpanan lebih
lama dapat dilakukan dengan menggunakan teknik kriopreservasi yaitu bakteri disimpan dalam
media-gliserol 50% pada suhu -80 0C. Agar miring juga dapat digunakan untuk melihat motilitas
bakteri. Pergerakan bakteri agar miring dapat dilihat dari bentuk goresan. Bentuk irregular ataupun
menyebar dari goresan menunjukkan bakteri bersifat motil, jika bentuk koloni mengikuti goresan
kemungkinan besar bakteri bersifat non motil.
Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan
bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik
pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion
protoplasma sel.
Page 19
Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu : (1) bersifat Asam, berupa anion dan umum
digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan
dalam bentuk klorida.
Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil reaksi zat
warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang
akan melekatkan zat warna pada plasma sel.
Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu :
Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat warna seperti :
Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Page 20
UJI KATALASE
Identifikasi suatu jenis bakteri dilakukan melalui serangkaian pengujian dan pengamatan.
Pewarnaan gram bertujuan untuk membantu mengetahui kategori kelompok bakteri berdasarkan
struktur dinding sel dan bentuk bakteri. Uji katalase merupakan salah satu pengujian biokimia untuk
mengidentifikasi bakteri apakah menghasilkan enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dihasilkan
oleh beberapa jenis bakteri dalam rangka mencegah oksidasi radikal bebas yang dapat merusak atau
membunuh bakteri. Ada beberapa jenis pengujian biokimia lain yang merupakan bagian dari
pengidentifikasian suatu jenis bakteri diantaranya :kemampuan
hidrolitik terhadap substrat yang ditambahkan pada media, kemampuan memfermentasi gula,
mengoksidasi nitrat dsb. Uji katalase sangat mudah dilakukan dengan menggunakan hydrogen
peroksida 3% yang diberikan pada
Page 21
zat ini dapat mengakibatkan kematian organisme kecuali mereka dapat mendegradasi secara
enzimatis. Zat ini diproduksi ketika lingkungan aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofil
digunakan dalam jalur pernapasan aerobic, dimana oksigen merupakan akhir aseptor electron,
selama pendegradasian karbohidrat untuk produksi energy. Organisme mampu memproduksi
katalase yang secara cepat mampu mendegradasi hydrogen peroksida.
2H2O2
2H2O + O2
Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi terutama superoksida toksik
menggunakan enzim superoksida dismutase. Produk akhir dari
H2O2, tapi ini memiliki sedikit toksik terhadap sel bakteri daripada superoksida.
Produksi katalase dapat ditentukan dengan menambahkan substrat H2O2 tepat ketika diinkubasi
dalam NA agar miring kultur. Jika terdapat katalase, reaksi kimia dapat diindikasikan dengan
adanya buih-buih yang menandakan adanya oksigen bebas (O2). Jika tidak terdapat buih, maka
menunjukkan hasil negatif.
Bahan :
Biakan (Agar Culture/ Broth Culture)
NaCl Fisiologis
Spiritus
Prosedur :
Sumber dari biakan Padat (Solid Medium)
1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop NaCl Fisiologis, tempatkan di atas Object
Glass;
2. Dengan menggunakan Jarum Ose (ujung runcing), ambil 1 koloni bakteri dari biakan
Padat, tempatkan di atas suspensi NaCl Fisiologis yang sudah ada di atas Object Glass,
3. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan;
4. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit;
5. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan.
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013
Page 22
Page 23
Ilustrasi Teknik Pembuatan Apusan bakteri dapat dilihat pada Gambar berikut :
Page 24
Bahan :
Apusan Bakteri
Zat Warna Gentian Violet
Iodine
Alcohol
Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin
Aquades
Spiritus
Prosedur :
1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya;
2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan, biarkan selama 20 detik;
3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik;
4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit;
5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar 10 20
detik);
6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;
7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20 detik;
8. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;
9. Keringkan di suhu ruang;
10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan bantuan minyak imersi;
Page 25
Alat:
Slide glass
Kawat ose
Hydrogen peroksida 3%
Bunsen
Page 26
Prosedur:
1 Biakan padat bakteri target yang telah diinkubasi sehari semalam disiapkan.
3. NaCl fisiologis 0,9% diambil sebanyak 2 ose dan ditempatkan pada slide glass
4. Koloni bakteri diambil 1 ose secara aseptis kemudian disapukan pada slide glass yang telah
diberi NaCl fisiologis.
5. Hidrogen peroksida 3% sebanyak 1 tetes ditempatkan diatas sapuan dan diamati
pembentukan buih. Koloni positif mennghasilkan enzim katalase jika dihasilkan buih.
6. Hasil praktikum dicatat pada tabel pengamatan.
Sumber Isolat
GRAM
Positif
No
Sumber Isolat
Perbesaran Mikroskop
Negatif
Uji Katalase
Positif
Keterangan
Negatif
Page 27