HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan

fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa
geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolom
dengan bantuan pompa/tekanan.
Komponen pokok yang ada dalam alat HPLC :

1. Gradien Controller/Solvent Reservoir :

Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam
kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus
dimilipore (pori-pori + 5m) dan didegass.
2. Pompa :
Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.
3. Sample Introductions/Injector :
Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan
bantuan syringe.
4. Kolom :
Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah
terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.
5. Detektor :
Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil
pemisahan kolom.
6. Data Output :
Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh.

Perbandingan Antara Kromatografi Cairan Klasik dan HPLC

Klasik
- Jenis partikel pengisi kolom

- Partikel besar berpori

- Diameter partikel (m)

- 100 - 250

- Diameter kolom (mm)

- 10 50

- Panjang kolom (cm)

- 50 200

- Tekanan (atm)

- 0,1 1

- Kec Alir (mL/menit)

- Waktu Pemisahan
- Kapasitas
- HETP
- Resolusi

- 0.1
- Lama
- Besar (preparatif)
- 200
-1

HPLC
- Perikular
- Mikropartikulat
- 37 50
- 5 10
-13
-26
- 50 100
- 10 50
- 30 50
- 100 200
- 0.5 5
- Cepat
- Lebih kecil
- 10.000
-7

KEUNTUNGAN HPLC

Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan
data
Volume sampel kecil
Daya pisah tinggi
Merupakan metode analitis

Cepat
Peka
Akurat
Tepat
Reproducible

Juga Preparatif
Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan
non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.
Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

POMPA (Sistem Penyalur Fasa Gerak)

Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak

Bebas pulsa
Perlu de gasser
Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan
dan tekanan lebar
Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

JENIS JENIS POMPA

Pompa bolak balik (reciprocating pump)

Paling banyak digunakan

Jumlah vol pelarut tidak terbatas
Dapat digunakan untuk elusi gradien
Menghasilkan aliran berpulsa

Pompa jenis penyuntik (syringe pump)

Kapasitas ruang pelarut 250 500 mL
Untuk kolom kolom kecil (micro bore columns)
Menghasilkan aliran bebas pulsa

Metode Pemisahan Umum dalam HPLC

Tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat ;
Fasa Normal
Fasa gerak nonpolar
Fasa diam polar

Fasa Terbalik
Fasa gerak polar
Fasa diam nonpolar

Typical stationary and mobile phases for normal and reverse

phase chromatography

DETEKTOR HPLC
Tergantung pada jenis senyawa dalam eluat ;

Spektrofotometer UV Visible
Indeks bias
Spektrofluorimeter ( zat berfluoresensi )
Konduktivitas listrik ( zat ionik )
Spektrometer infra merah
Spektrometer massa ( LC MS )
Spektrometer NMR ( LC NMR )

Jenis Detektor Karakteristik HPLC

Daftar Pustaka
VOGELS, 1989. Textbook of Quantitative Chemical Analysis.
5th edition. Longman Scientific & Technical. John Wiley &
Sons, Inc. New York.
Albert K., 2002. On-Line LC-NMR and Related Techniques.
John Wiley & Sons Ltd. England.
Sadek P. C., 2002. The HPLC Solvent Guide. 2nd. Wiley
Interscience. John Wiley & Sons, Inc. New York.
Synder, L.R., Kirkland, J.J., Glaich. J. L., Practical HPLC
Method Development. 2nd . Wiley-Interscience. New York.

Analisis Kafein dalam Tablet dengan Metode HPLC

Fasa Gerak

Siapkan campuran pelarut H2O : MeOH : AcOH (69:28:3) grade HPLC atau PA yang
sudah dimilipore dan didegass.

Larutan Standar Internal

Siapkan larutan asam benzoat dalam metanol dengan konsentrasi kira kira 6
mg/mL

Larutan Stok Standar

Larutkan secara akurat sejumlah tertentu standar kafein grade USP/PA dengan
pelarut campuran ( MeOH : Asam asetat glacial 95:5 ) dengan konsentrasi kira kira
0.25 mg / mL

Preparasi Standar

Pindahkan20 mL larutan stok standar dan 3 mL larutan standar internal ke dalam

labu ukur 50 mL, encerkan dengan pelarut campuran seperti diatas sampai tanda
batas, dan dihomogenkan.

Preparasi sample uji kafein

Timbang sample kafein yang sudah dihaluskan sekitar 250 mg, dan dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 mL. tambahkan 75 mL pelarut campuran, kocok dengan shaker
sekitar 30 menit. Encerkan sampai tanda batas dengan pelarut campuran, dan
dihomogenkan. Pindahkan 2 mL larutan ini dan 3 mL larutan standar internal ke
dalam labu ukur 50 mL,encerkan sampai tanda batas, dan dihomogenkan.

Sistem Kromatografi
HPLC dilengkapi dengan detector UV dengan 275 nm dan kolom C-18. Kecepatan
alir eluen sekitar 2 mL /menit.

Prosedur Analisis
Suntikkan sekitar 10 L larutan preparasi standar dan larutan sample yang sudah
dipreparasi secara terpisah, ke dalam HPLC. Waktu retensi kafein sekitar 0.5, asam
benzoate sekitar 1. Hitung kadar kafein (C8H10N4O2) dalam sample uji dengan rumus;
2500 C ( Rv / Rs )
C

; Konsetrasi dalam mg/mL standar kafein USP / PA dalam preparasi standar

Rv & Rs ; Rasio factor respon puncak analit dan puncak standar internal yang
didapat dari preparasi sample uji kafein dan preparasi standar.

PETUNJUK PENGGUNAAN ALAT

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
HP 1100, AGILENT CHEMSTATION

LABORATORIUM KIMIA BAHAN ALAM DAN LINGKUNGAN

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PADJADJARAN
BANDUNG
2007

PERHATIAN !
SEBELUM MEMAKAI ALAT HARAP KONFIRMASI JADWAL KE
BAGIAN ADMINISTRASI SEKURANG-KURANGNYA SEMINGGU
SEBELUMNYA

SEBELUM MEMAKAI ALAT, HARAP MENGISI KELENGKAPAN

ADMINISTRASI

UNTUK PEMULA HARAP MEMBACA & MEMAHAMI PETUNJUK

INI SEBELUM MENGOPERASIKAN ALAT

HARAP UNTUK SELALU MENGIKUTI PETUNJUK PENGGUNAAN

UNTUK MENGHINDARI HAL-HAL YANG TIDAK DIINGINKAN,

SEBAIKNYA

PENGGUNA

MINTA

PENDAMPING

PENGOPERASIAN MELALUI BAGIAN ADMINISTRASI

SEMUA ELUEN, SAMPEL YANG DIBAWA HARUS SUDAH

DISARING DENGAN MILLIPORE DAN DIAWAGASKAN

APABILA TERJADI KESALAHAN ATAU KERUSAKAN SEKECIL

APAPUN

PADA

SECEPATNYA

ALAT

MAUPUN

MELAPOR,

SOFTWARE,

HARAP

MENCOBA

UNTUK

JANGAN

MEMPERBAIKI SENDIRI

SETELAH SELESAI MENGGUNAKAN ALAT, CHECK ALIRAN

LISTRIK, KEBERSIHAN DAN KERAPIHAN ALAT DAN RUANGAN.
JIKA TIDAK DIGUNAKAN, SAKLAR HARUS SELALU MATI DAN
ALAT SELALU DITUTUP DENGAN PENUTUP YANG TERSEDIA

SETIAP MENGGUNAKAN ALAT HARUS SELALU MEMAKAI

ALAS

KAKI

YANG

BERSIH

DAN

KERING,

UNTUK

MENGHINDARI SENGATAN LISTRIK

ALAT

TIDAK

BOLEH

DINYALAKAN

KETIKA

DI

LUAR

RUANGAN SEDANG ADA PETIR, KILAT ATAU HALILINTAR

I.

Sekilas Pengenalan Alat HPLC HP 1100.

Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang ada di jurusan
Kimia FMIPA Unpad adalah HPLC type HP 1100 buatan Hewlet
Packard. Alat ini terdiri dari 3 bagian perangkat keras, yaitu:

Alat HPLC-nya sendiri yang terdiri atas : (penampakan dari atas ke

bawah) botol eluen, injektor, pompa, kolom dan detektor.

Seperangkat komputer yang terdiri atas : CPU, monitor, keyboard,

mouse dan mouse pad.

Printer HP Laserjet 6L.

Setiap alat dilengkapi dengan penutupnya yang harus selalu dipasang

jika alat sedang tidak digunakan untuk menghindari debu dan kotoran.
Dalam komputernya, telah dipasangkan pengolah data Agilent
Chemstation dengan dasar MS-Windows NT. Untuk kelancaran
penggunaan, selain mengolah data dilarang memasukkan disket atau
CD ke dalam komputer dan atau mengotak-atik software lain yang
terdapat didalamnya (misalnya menulis dalam notepad).

PEDOMAN PENGGUNAAN

PREPARASI SAMPEL

Sampel harus dalam bentuk larutan.

Untuk skala analisis sampel dalam L, konsentrasi sampel yang

diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.
Konsentrasi maksimal adalah sekitar 40 ppm.

PREPARASI FASA GERAK

Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade
HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.

Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore

kemudian

diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk

menghilangkan udara terlarut.

Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan,

untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang
digunakan.

PENYALAAN ALAT

Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung

eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat
gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung
pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat
penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa
kembali seperti semula.

Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).

Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).

Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)

Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)

Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.

MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION

Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul
tampilan :
Windows NT workstation version 4.00
Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)

Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00) secepatnya,

kemudian tekan ENTER.

Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.

Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu
diisi apa-apa, langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG
PASSWORD PADA PENGOLAH DATA !

Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No

Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik

pada menu Instrument 1 Online.
Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan
pengolahan data tanpa penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat
komputernya saja). Menu ini misalnya digunakan untuk print out
kromatogram yang belum sempat dilakukan atau untuk melakukan print
ulang kromatogram yang sudah ada.

Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.

PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI

Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih
dahulu untuk menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan
juga dimaksudkan agar alat benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram
yang dihasilkan akan bagus.
Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation,
klik menu Run Control. Kemudian :

Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.

Klik menu Instrument, klik pada set up pump

>set gradient fasa gerak
>set laju alir
>set waktu run dan post run
catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1
uL/menit untuk menghemat eluen.

Klik pada kolom, klik control, klik on.

Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible),

tergantung sample yang akan diinjeksikan.

Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi

kolom yang diinginkan.

Klik menu Instrument, klik Set

Up DAD Signals untuk mengatur

panjang gelombang detektor yang diinginkan. Masukkan panjang

gelombang pilihan disertai dengan tanda X.

Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang
lebih 45-60 menit untuk menstabilkan.

Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang
diinginkan (jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT !
Naikkan Perlahan....Agar tekanan pompa stabil...!

PERSIAPAN INJEKSI
INGAT.....:

TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP

TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING
TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI

Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)

Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas

Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan

line dengan jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline
pada skala nol tekan BALANCE.

Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL,

klik SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut
keterangan sampel.

Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.

Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak

utama ke kolom. Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan
ganti dengan sampel lain, kolom harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit),
pencucian masukkan ke dalam file CUCI.

CARA INJEKSI

Ambil alat injek (syringe).

Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya
metanol)

Kemudian bilas syringe dengan sampel

Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi
tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau
gelembung udara

Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar

terpasang loop 20 uL

Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas),

injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum
syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress
data aquasition.........

Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk

menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi
puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di
layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...Run in Progress Data
Analysis.

Setelah di layar muncul kembali tampilan Ready (hijau), maka

pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali
sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running
cuci kolom ke dalam file cuci.

PRINT OUT KROMATOGRAM

Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap

sampel yang telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA
ANALYSIS.

Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih
file mana yang akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang
diinginkan. Segera akan keluar tampilan kromatogram yang dipanggil.

Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang

dipanggil tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE.
Maka segera akan muncul nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor
yang ada yaitu DAD (Diode Arays Detector) sangat sensitif, maka setiap
puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat terintegrasi sehingga
puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita tampilkan
waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan
saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK

sampai muncul tanda X merah. Atau dapat langsung klik di menu X

merah yang biasanya ada di layar. Untuk menghapusnya, klik dengan X
merah tersebut di tempat-tempat yang waktu retensinya tidak ingin
ditampilkan.

Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik

SPECIFY REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang
diinginkan. Setelah siap, klik PRINT REPORT lalu tunggu sebentar
sampai komputer menampilkan print previewnya. Kemudian klik pada
icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.

Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu
VIEW, klik METHOD AND RUN CONTROL.