Elektroforesis DNA bakteri

Alat
seperangkat alat elektroforesis [Bio Rad (wide minisub(P) cell GT)]
microwave (Sanyo)
sentrifuse (Sorvall Biofuge)
lampu UV (Bio-Rad)
mikropipet
Bahan:
Isolat bakteri
Agarosa (invitrogen)
Tris-base (2-amino-2-hidroksimetil-propana-1,3-diol) (Merck)
EDTA
Akuades
Etidium bromida
Loading buffer
Prosedur:
Pembuatan tris HCl pH 7,5 ; 0,25 M
Disiapkan 3,0285 g tris-base dan ditambahkan dengan 50 mL akuabides
hingga larut. Larutan kemudian ditambahkan HCl dan akuabides secara
perlahan hingga pH 7,5 dan volume total menjadi 100 mL.
Pembuatan bufer TE (Tris-EDTA)
Sebanyak 4 mL Tris-HCl 0,25 M ditambahkan dengan 2 mL 0,5 M EDTA pH
8. Selanjutnya ditambahkan dengan akuabides hingga volume 100 mL.
Isolasi DNA Bakteri
Isolat bakteri dalam nutrien broth berumur 1-3 hari diambil, dipindahkan
ke tabung ependorf, dipanaskan 100 C selama 10 menit. Isolat
dipindahkan ke tabung reaksi, di freezer -20C selama 10 menit. Isolat
kemudian dipindahkan ke tabung ependorf, lalu disentrifuge dengan
kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Ambil endapan, tambahkan
dengan larutan tris EDTA 50 L
Pembuatan TAE 10X
Sebanyak 24,2 g tris-base (2-amino-2-hidroksimetil-propana-1,3-diol)
dilarutkan dalam 5,71 mL asam asetat glasial. Setelah larut, ditambahkan
dengan 20 mL larutan EDTA pH 8. Selanjutnya, larutan ditambahkan
dengan akuades hingga volume akhir 500 mL.
Analisis kualitatif DNA dengan elektroforesis gel agarosa
Untuk Analisis kualitatif DNA dengan elektroforesis gel agarosa, tahap
pertama adalah membuat gel agarosa 1,5 % terlebih dahulu, dengan cara

menimbang 0,375 g agarosa, dilarutkan dalam 25 mL larutan TAE 1x dan

dipanaskan dalam microwave hingga larut. Kemudian, didinginkan sampai
suhu 60 oC dan ditambahkan 1 L etidium bromida. Larutan dituang dalam
cetakan gel (tray) dan dipasangi well-forming combs, didiamkan kurang
lebih 60 menit (sampai gel mengeras). Setelah mengeras, well-forming
combs dilepas secara perlahan-lahan dan gel agarosa siap digunakan.
Langkah selanjutnya adalah proses elektroforesis yaitu dengan
mengambil tray yang berisi gel agarosa 1,5 % kemudian diletakkan di
dalam alat elektroforesis dan disiram dengan larutan TAE 1x sampai gel
terendam seluruhnya. Sampel hasil isolasi DNA diambil sebanyak 5 L
dan ditambahkan 1 L loading buffer kemudian dicampur dengan rata.
Larutan campuran tersebut diambil dengan mikropipet dan dimasukkan
dalam sumur (lubang-lubang pada gel agarosa), kemudian dilakukan
elektroforesis dengan buffer TAE 1x selama 60 menit pada tegangan 50 V.
Setelah proses elektroforesis selesai, gel diambil dan ditaruh di atas
lampu UV. Penampakan hasil elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan difoto
dengan kamera digital.