JOURNAL READING

Oleh
:
Mutiara Rachel
Rizki Ovianti
Suci Utami
Pembimbing : dr. Eva Susana Putri,SpAn

PENDAHULUAN
Propofol (2,6-diisopropyphenol) merupakan anastesi dan
sering digunakan sebagai sedasi jangka pendek ketika
pembedahan yang juga baik sebagai kombinasi terapi bagi
pasien dengan penyakit yang kritis. Propofol memberikian
efek farmakodinamik yang beragam, dimulai dari hipnosis
pada general anastesi, dan juga amnestik yang baik dan
memberikan efek relaksasi otot.
Propofol juga memiliki peran sebagai imunomodulator
dengan menurunkan produki dari proinflamasi sitokin dan
mengubah biosintesi nitrit oxida (NO). Propofol menghambat
fungsi neutrofil (chemotaxis, attachment, migrasi,
fagositosis, dan produksi dari reactive oxygen species/ROS).

 Propofol memberikan aktifitas antioxidant dengan cara

mengumpulkan radical bebas dan peroxynitrate
sehingga menurunkan stress oxidatic yang
menimbulkan peroksidasi lipid. Karena aksi anti
inflamasi tersebut, efek farmakologi propafol hingga
saat ini masih diselidiki.
Pemberian propofol secara intavena memiliki efek antiinflamasi in vivo. Contohnya pada endotoximeal induced
septik, propofol menghambat produksi stimuli-induced
dari proinflamasi sitokin dan kemokin termasuk TNF-a,
IL-1, IL-6, dan IL-8.

 Lebih lanjut propofol menekan produksi proinflamasi sitokin dan sintesis NO/biosintesis NO pada
aktivasi endotoxin lipopolisakarida (LPS) makrofag
dan sel mononuklear darah perifer in vitro.
Propfol memiliki efek anti-inflamasi pada LPSinduced alveolar tipe II ephitelial cell injury dengan
menurunkan regulasi CD14 dan menekan TLR 4.
Propofol memoulasi LPS induce inflamasi pada sel
monosit THP1 dengan menghambat aktivitas
cyclooxygenase..

 Song et al menunjukan bahwa propofol menghambat aktivasi

hepatic nuclear factor(NF)-kB sehingga terjadi menurunan
produksi pro-inflamasi sitokin TNF-a dan IL-6
Chiu et al mengkomfirmasi mengenai efek inhibitor dari propofol
pada LPS atau lipoteichoic acid activated NF-kB pada makrofag.
Dibawah stress oxidatif yang menyebabkan inflamasi, propofol
menghalag phosphorylasi dan degradasi dari inhibitor kB (ikB)
kinase (IKK) dan iKB, hasilnya berupa inaktivasi NF-kB pada
hepatosit. Stimulasi propofol juga menghambat LPS atau aktivasi
asam lipotoichoic, aktivasi protein mitogen kinase
(MAPK)/extraxellular, regulasi signal kinase (ERK), upstream
regulator NF-kB nuclear translocation.

 Infeksi bakteri gram negatif menyebabkan endotoxemia

yang menyebabkan syndrom kegagalan/disfungsi
multiple organ, atau bisa juga menimbulkan penyakit
yang mengancam nyawa seperti shock septic.
Inflamasi organ sistemik berat mengambil peran
terhadap terjadinya sepsis, oleh karena itu pemberian
agent anti-inflamasi untuk melindungi sel dari
kerusakan seluler karena LPS. Inhibisi sinyal LPS
menimbulkan proses anti-inflamasi.

Latar Belakang Masalah

Anastesi propofol memiliki efek
immunomodulator, terutama sebagai antiinflamasi. Endotoxin liposakarida pada
bakteri merangsang inflamasi melalui 4
sinyal toll-like receptor (TLR).

Tujuan Penelitian
Penelitian ini mencari tau mekanisme
molekuler dari propofol terhadap LPS/TLR4
yang merangsang aktivas inflamasi pada
murine macrophage RAW264.7

Materials and Methods

Reagent
Propofol
LPS (lipopolisakarida)qqq derivad E-coli dilarutkan dalam saline
phosphate-buffered steril (PBS)
NF-kB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PBDTC),
Phospoinositide-3 kinase(PI3K) inhibitor LY294002, PP2A inhibitor
okadaic acid (OA), Antioxidant diphenyl iodonium (DPI),
dilarutkan dalam DMSO untuk didilusi dengan PBS
Rabbit anti-mouse iNOS, IKKB, Phopoho-IKKB (ser180), NF-kB,
phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr 182), JNK, phospho-JNK
(Thr180/Tyr 185), ERK1/2, phospho-Akt (Scr473), p38 MAPK,
phospo-ERK1/2, PTEN dan phopsp-PTN
Antibodi B-actin dan horseradish perogsidase-conjugated antirabbit IgG

Animal Treatment
Penelitian ini menggunakan 6 anak tikus
jantan berusia 6 minggu, diberimakan seperti
biasa dan air yang ditambah libitum, masingmasing disuntikan 15mg/kg LPS derivat E-coli
yang dilarutkan kedalam PBS steril,
konsetntrasi dari volume total yaitu
20uL/injeksi.
Untuk membuktikan peran anti-inflamasi
pada propofol, anak tikus diberi 5mg/kgb
propofol yang diencerkan dengan PBS

 Kultur cell
RAW264.7 murine makrofage, dibiakan didalam cawan
petri dengan 2mM L-glutamine, dan 15mM HEPES
disuplementasi dngan 10% serum bivine fetal (FBS), 100
unit penisilin dan 100ug/ml streptomisin. Disimpan
dengan suhu 37C dangan atmosphere CO2 5%

Penilaian Viabilitas
Menggunakan penilaian WST-8, sel dikultur dalam 96
jaringan didalam medium DMEM baik dengan adanya
propofol dan tanpa propofol. Reagent diberikan setelah
24 jam

 Penilaian Citotoxixitas
Penilaain colorimetric digunakan untuk mengevaluasi
kerusakan sel dan aktivitas lactac dehydrogenase.

Penilaian Apoptosis
Apoptosis dianalisa menggunakan propidium iodide (PI)

Western Blotting
Cell yang telah dikumpulkan di lisis dengan buffer
mengandung 1% Triton X-100, Tris (pH7.5) 50mM, EDTA
10mM, 0.02% sodium azide dan protease inhibitor
coctail selama 5 menit.

 Deteksi produksi NO
Produksi NO diukur sebagai akumulasi nitrin
(NO2) didalam medium menggunakan reaksi
kolometrik dengan reagen Griess. Sampel
dicampur dengan perbandingan 1:1. Sodium
nitrit dilarutkan dakam double-distlled kemudian
digunakan sebagai standar (1-50nM)
Cell kultur supernatants dan murine ascites
dikumpulkan dan dilihat kadar TNF-a, IL-6 dan IL10 dengan perangkat ELISA

 Immunocytochemistry staining
Seldidiamkan dalam 3.7% formaldehyd PBS selama 10 menit, setlah
dibersihkan 2x dengan PBS, lalu sel dicampurkan dengan nti-NF-kB p65
antibodi, dinkubasi dalam semalam dengan suhu 4C. Selanjutnya dicuci
lagi kemudian diinkubasi kembali selama 1 jam dalam suhu ruangan,
lalu dicucikembali dan dilihat melalui mikroskop fluroroscent. Kemudian
dihitung sell positif dalam tiga lapang pandang.

Pengukuran ROS Intraselullar

Stress oxidative intraselular diukur dengan oksidasi
dichrodihydroflurescein diacetat. Sel ditanam selama semalaman
kemudian dicuci 2x dengan Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)
sebelum dilakukan percobaan. Kadar ROS dikalkulasi dengan cara
melihat peningkatan persentasi dengan membandigkan dengan kontrol,
nilai kontrol normalnya hingga 100% dari nilai basal.

Analisa Statistik
Tiap kelompok diabndikan menggunakan ttest dua sisi atau analisa ANOVA satu sisi,
diikuti dengan test post-hic Dunnets.
Hasil analisis dianggap signifikan dengan p
value <0.05

Findings
Kadar non-cytotoxic propofol menurunkan inducible nitrit oxida sintase (iNOS)
dan NO yang dipengaruhi oleh LPS.
Propofol menurunkan produksi Tumor Nekrosis Faktor-a (TNF-a), IL-6 dan IL-10
yang terdeteksi melaluin pengukuran ikatan enzim immunosorbent. Analisis
wastern blot menampakan propohof menghambat aktivasi dan phosporilasi
IKKB (Ser180) dan nuklear factor (NF(-kB yang dipengaruhi oleh LPS,
translocasi nuklear NF-kB p65 menurun.
Propofol menghambat aktifasi dan phosphorilasi Akt sebagian dengan
mengurangi reactive oxygen species (ROS).
ROS meregulasi Akt diikuti oleh aktivasi NF-kb merupakan hal krusial pada LPS
dalam menimbulkan respon inflamasi pada makrofag. Melalui penelitian in vivo
pada tikus menunjukan adanya agen anti-inflammatory terhadap LPS didalam
makrofag peritonial

Kesimpulan
Hasil penelitian ini memberi kesan bahwa
propofol mengurangi LPS yang merangsang
respon inflamasi pada makrofag dengan
menghabat jalur sinyal interconnected
ROS/akt/IKK/NF-kB