Reaksi Transglukosidik Enzim -glukosidase Famili-3

Aspergillus niger : Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

serta Bukti bahwa Reaksi Transglukosidik
Tidak Terpengaruh pH

MAKALAH
Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah KI6161 Enzimology

Tunjung Mahatmanto (20506004)

Muhtar Kosim
(20506009)

Sumber :
Transglucosidic Reactions of The Aspergillus niger Family 3 -glucosidase: Qualitative and Quantitative
Analyses and Evidence that The Transglucosidic Rate is Independent of pH.
Heather F. Seidle, Reuben E. Huber. Archives of Biochemistry and Biophysics 436 (2005) 254264

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2006

PENDAHULUAN
Selulosa merupakan polimer utama dalam tanaman yang sangat melimpah di bumi.
Enzim yang mendegradasi selulosa menjadi glukosa sangat kompleks. Selulosa tersusun
dari rantai glukosa dengan ikatan -1,4 dengan bagian yang kristalin dan amorf.
Selulosa tidak larut dalam air. Selain itu, ikatan hidrogen dan interaksi van der Waals
membentuk jalinan antar rantai yang menghimpun 60-70 rantai selulosa menjadi fibril
yang membentuk kristal yang lebih teratur. Fibril ini berada dalam matriks hemiselulosa
dan lignin yang membuat degradasi selulosa menjadi sulit.

Enzim pendegradasi selulosa dinamai selulase dengan tiga pembagian aktivitas:

endoglukanase (E.C. 3.2.1.4) menghidrolisis selulosa dari dalam, selobiohidrolase (E.C.
3.2.1.91) memutus ujung rantai selulosa, -glukosidase ( E.C. 3.2.1.21) menghidrolisis
selobiosa dan oligosakarida menjadi glukosa.

Reaksi transglukosilasi terjadi jika ada akseptor (gula atau alkohol) yang menggantikan
air dalam hidrolisis selobiosa atau oligosakarida oleh -glukosidase. Mekanisme
transglukosilasi dengan substrat sebagai akseptor dijelaskan pada gambar di bawah ini.
Ikatan glikosidik dalam substrat dipecah oleh enzim -glukosidase, lalu pecahannya
meninggalkan enzim. Sisi yang ditinggalkan ini dinamakan sisi akseptor. Pada
hidrolisis, sisi akseptor ditempati oleh air. Tetapi pada transglukosilasi, sisi akseptor
diisi oleh sesuatu yang lain dalam mekanisme ini oleh glukosa atau oleh selobiosa.

reaksi hidrolitik.
reaksi yang terjadi pada akseptor ketika
substrat menjadi akseptor.
menunjukkan kompleks dengan enzim.
Tanda garis menunjukkan ikatan kovalen.
E: -glukosidase;
Glc-OR: substrat;
Glc:
D-glukosa;
Glc-Glc-OR: adduct transglukosidik
Ks:
konstanta disosiasi substrat;
Ki:
konstanta disosiasi substrat dari
sisi akseptor;
k2: laju tahap glikolitik;
k3: laju tahap hidrolitik;
k4: laju tahap transglukosidik.

Enzim glukosidase komersial yang banyak terdapat di pasaran berasal dari

Aspergillus niger. Sekuen, identitas sisi katalitik serta nukleofil enzim ini sudah
diketahui. Dalam penelitian ini reaksi transglukosilasi -glukosidase A. niger dipelajari
dengan titik berat pada pengaruh pH. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat
memberikan dasar bagi pengembangan enzim ini secara ekonomis.

METODA PENELITIAN
Enzim yang digunakan dalam penelitian ini dimurnikan (>95%) untuk dianalisis
selanjutnya. Studi NMR dilakukan untuk menentukan struktur kimia produk yang
dihasilkan selama proses transglukosilasi. Penentuan laju awal reaksi dilakukan dengan
satuan laju reaksi mikromol/menit/miligram. Analisis TLC dilakukan untuk mengetahui
secara kualitatif kemampuan beberapa jenis alkohol dan gula untuk bertindak sebagai
ekseptor dalam reaksi transglukosidik. Analisis kuantitatifnya dilakukan dengan
menggunakan GLC.
HASIL
Analisis Kinetika Reaksi
Grafik Michaelis-Menten antara v0 aglikon terhadap konsentrasi pNPGlc pada berbagai pH

Dari data laju reaksi didapat kurva garis dalam gambar di atas melalui regresi nonlinear. Dari kurva tersebut terlihat bahwa pada konsentrasi substrat rendah, laju reaksi

meningkat untuk semua pH. Namun, pada konsentrasi substrat tinggi, laju reaksi akan
turun untuk pH dibawah 6 tapi tetap naik untuk pH diatas 6.

Grafik di atas menunjukkan pengaruh pH terhadap kinetika reaksi hidrolisis serta reaksi
transglukosilasi. Harga Vmax(h) untuk ketiga substrat

([ ]: selobiosa; [ ]: oNPGlc; [ ]:

pNPGlc) menghasilkan kurva berbentuk bel. Harga Vmax(t) untuk ketiga substrat relatif
konstan (3, 12, 5 mol/min/mg berturut-turut untuk substrat pNPGlc, selobiosa,
oNPGlc). Vmax(h) dan Vmax(t) berpotongan pada pH ~ 5,5. Harga Km(h) turun seiring
dengan kenaikan pH. Harga Km(t) (tidak ditunjukkan) untuk tiap substrat turun ~ 2 kali
lipat antara pH 3-4 namun kemudian kembali konstan. Harga Vmax(h)/Km(h) meningkat
sampai pH 4,5 kemudian tetap konstan.

Analisis TLC dan NMR

Analisis TLC dari jalannya reaksi dilakukan untuk menunjukkan bahwa yang terjadi
adalah reaksi transglukosidik, bukan penghambatan oleh substrat. Dari analisis ini dapat
diketahui terbentuknya intermediet yang terbentuk dari reaksi transglukosilasi. Analisis
menggunakan NMR dilakukan untuk mengetahui struktur molekul hasil reaksi
transglukosilasi. Analisis ini menunjukkan bahwa reaksi transglukosilasi menghasilkan
senyawa baru dengan ikatan -1,6.
Analisis GLC
Analisis GLC dilakukan untuk memantau jalannya reaksi secara kuantitatif. Dari
analisis ini dikatahui bahwa konsentrasi selobiosa 5 mM menunjukkan intermediet
(trisakarida dan gentiobiosa) yang dihasilkan rendah. Sebaliknya, pada konsentrasi
selobiosa 50 mM intermediet yang dihasilkan tinggi. Laju awal reaksi hidrolisis sesuai
dengan persamaan vo (aglycone) sedangkan reaksi transglukosilasi sesuaidengan
persamaan Vo (trans).

Progress reaksi dengan selobiosa yang diikuti menggunakan GLC

A. Konsentrasi selobiosa 5 mM pada pH 4,5 (kiri) dan 7 (kanan)
B. Konsentrasi selobiosa 50 mM pada pH 4,5 (kiri) dan 7 (kanan)
([ ]: glukosa; [ ]: trisakarida; [ ]: gentiobiosa)

DISKUSI
Penelitian ini secara tidak sengaja menemukan bahwa reaksi transglukosilasi tidak
terpengaruh pH (3-7), sedangkan reaksi hidrolisis menurun lajunya. Selain itu,
ditemukan juga bahwa akseptor (gula) pada reaksi transglukosilasi hanya menggunakan
hidroksil C6-nya dan hidroksil C2 harus equatorial serta pembentukan gentiobiosa
merupakan reaksi intermolekular karena afinitas sisi akseptor yang lemah terhadap
akseptor gula.

Produk transglukosilasi pada konsentrasi substrat tinggi terjadi karena substrat terikat
pada sisi +1 dan +2 yang kosong sebelum glukosa pada sisi -1 lepas. Substrat yang
terikat bereaksi dengan glukosa membentuk produk transglukosidik. Ini terjadi pada
konsentrasi substrat tinggi. Tapi pada konsentrasi substrat rendah, reaksi hidrolisis
cenderung terjadi.
Data NMR menunjukkan bahwa hanya terjadi ikatan -1,6 yang menjadi produk
transglukosidik. Sehingga bisa dikatakan bahwa sisi akseptor spesifik menempatkan C 6
akseptor untuk reaksi transglukosilasi. Hal ini terjadi karena sifat nukleofil C 6 yang

digabungkan dengan akses yang lebih baik secara sterik. Sehingga hidroksil dari atom C
lainnya tidak bisa menjadi akseptor pada reaksi transglukosilasi.
Enzim

-glukosidase

dari

Aspergillus

niger

ini

secara

signifikan

bersifat

transglukosidik. Hal ini bisa disebabkan karena adanya mekanisme induksi pada proses
hidrolisis selulosa, mengingat hidrolisis ini memerlukan enzim yang kompleks.
Gentiobiosa bisa jadi merupakan inducer operon seperti alolaktosa pada E. coli dan
sophorosa pada T. reesei.