Penciptaan Sel Bakteri Dikendalikan

oleh Genome Kimia Yang Disintesis

Pada tahun 1977 , Sanger dan rekan
ditentukan urutan genetik lengkap fag
X174 ( 1 ) , genom DNA pertama yang
menjadi benar-benar diurutkan . Delapan
belas tahun kemudian, pada 1995 , tim
kami mampu membaca lengkap pertama
urutan genetik dari bakteri mereplikasi diri
,Haemophilus
influenzae.
Membaca
genetic urutan berbagai spesies telah
meningkat eksponensial dari studi awal
Kemampuan untuk cepat mendigitalkan
informasi genomic telah meningkat lebih
dari delapan kali lipat
selama 25 tahun terakhir. Upaya untuk
memahami
semua informasi ini genomik baru
memiliki melahirkan berbagai komputasi
baru dan paradigma eksperimental ,
namun pengetahuan genom kami masih
sangat terbatas . Tidak ada sa67tu selular
Sistem
memiliki
semua
gen
yang
dipahami dalam hal peran biologis mereka
. Bahkan dalam bakteri sederhana sel ,
apakah kromosom mengandung seluruh
genetic repertoar? Jika demikian, bisa
sistem genetik lengkap direproduksi oleh
kimia sintesis mulai dengan hanya urutan
DNA digital yang terkandung di komputer?
Minat
kami
dalam
sintesis
molekul DNA besar dan kromosom tumbuh
dari upaya kami
selama
15
tahun
terakhir
untuk
membangun sel minimal yang hanya
mengandung gen penting. Karya ini
adalah diresmikan pada tahun 1995 ketika
kami membariskan genom Mycoplasma
genitalium, bakteri
dengan pelengkap terkecil gen dari setiap
dikenal organisme yang mampu tumbuh
sendiri di laboratorium. Lebih dari 100 dari
485 gen penyandi protein M. genitalium
adalah dibuang ketika terganggu satu per
satu (4-6). Kami mengembangkan strategi
untuk perakitan viralsized potongan untuk
menghasilkan molekul DNA besar yang
memungkinkan kita untuk merakit sebuah
M. sintetis genitalium. Genom dalam
empat tahap dari disintesis secara kimia.
Kaset DNA rata-rata sekitar 6 kb dalam
ukuran.Hal ini dilakukan melalui kombinasi
dalam metode enzimatik in vitro dan in
vivo rekombinasi

di Saccharomyces cerevisiae. Seluruh

genom sintetis [582.970 pasangan basa
(bp)] adalah stabil tumbuh sebagai
plasmid ragi centromeric (YCP) (7).
Beberapa rintangan dapat diatasi di
tanam dan mengekspresikan kromosom
disintesis secara kimia
dalam
sel
penerima.
Kita
perlu
meningkatkan
metode
untuk
mengekstraksi kromosom utuh dari ragi.
Kita juga perlu belajar bagaimana untuk
transplantasi genom ini menjadi penerima
sel
bakteri
ke
membangun
sel
dikendalikan hanya oleh genom sintetis.
Karena M. genitalium memiliki tingkat
pertumbuhan yang lambat, kita berpaling
ke dua lebih cepat tumbuh- spesies
Mycoplasma, M. mycoides subspecies
capri (GM12) sebagai donor, dan M.
capricolum subspesiescapricolum (CK)
sebagai penerima. Untuk membangun
kondisi dan prosedur untuk tanam genom
sintetik dari ragi, Kami mengembangkan
metode untuk kloning seluruh bakteri
kromosom sebagai plasmid centromeric
dalam ragi, termasuk asli M. mycoides
genom (8, 9).
Namun, upaya awal untuk mengekstrak M.
mycoides
genom
dari
ragi
dan
transplantasi itu ke M. capricolum gagal.
Kami menemukan bahwa donor dan
penerima mycoplasmas berbagi umum
sistem pembatasan. Donor genom adalah
termetilasi dalam asli M. mycoides sel dan
oleh karena itu dilindungi terhadap
pembatasan selama transplantasi dari sel
donor asli (10). Namun, genom bakteri
tumbuh dalam ragi yang unmethylated
dan
tidak
dilindungi
dari
sistem
pembatasan tunggal sel penerima. Kami
mengatasi hambatan pembatasan ini
dengan methylating DNA donor dengan
methylases dimurnikan atau minyak
mentah M. mycoides atau M. capricolum
ekstrak, atau dengan hanya mengganggu
pembatasan penerima sel. Kita sekarang
telah
menetapkan
prosedur
dan
melaporkan sintesis,
perakitan, kloning, dan transplantasi
sukses dari mycoides 1,08-Mbp M. JCVIsyn1.0 genom, untuk membuat sel baru
yang dikendalikan oleh ini genom sintetik.
Desain genom sintetik. Desain M.
mycoides JCVI-syn1.0 genom didasarkan
pada urutan genom yang sangat akurat

dari
dua
strain
laboratorium
M.
mycoidessubspecies capri GM12 (8, 9, 11).
Salah satunya donor genom
yang
digunakan oleh Lartigue et al. [GenBank
aksesi CP001621] (10). Yang lainnya
adalah
strain
yang
dibuat
oleh
transplantasi dari genom yang telah diklon
dan rekayasa dalam ragi, YCpMmyc1.1DtypeIIIres [GenBank aksesi CP001668]
(8). Proyek ini sangat tergantung pada
keakuratan ini urutan. Meskipun kami
percaya bahwa kedua selesai M. mycoides
urutan genom dapat diandalkan, ada 95
situs di mana mereka berbeda. Kita mulai
merancang genom sintetik sebelum kedua
urutan selesai. Akibatnya, sebagian besar
kaset dirancang dan disintesis Berbasis
pada urutan CP001621 (11). Ketika itu
selesai, kami memilih urutan genom yang
berhasil dipindahkan dari ragi (CP001668)
sebagai acuan desain kami (kecuali bahwa
kami terus typeIIIres utuh gen). Semua
perbedaan yang muncul biologis signifikan
antara CP001668 dan kaset disintesis
sebelumnya dikoreksi untuk mencocokkan
persis (11). Perbedaan urutan antara kaset
sintetis dan CP001668 yang terjadi pada
19 situs muncul tidak berbahaya dan
sebagainya
tidak
dikoreksi.
Ini
memberikan 19 polimorfik perbedaan
antara genom sintetis kami (JCVI-syn1.0)
dan
alami
(nonsynthetic)
genom
(YCpMmyc1.1) yang telah kita kloning di
ragi dan digunakan sebagai standar untuk
transplantasi genom dari ragi. Untuk lebih
membedakan antara genom sintetis dan
yang alami,
kami merancang empat urutan watermark
(gbr. S1) ke mengganti satu atau lebih
kaset
di
daerah
eksperimental
menunjukkan [watermark 1 (1246 bp)
dan 2 (1081 bp)] atau diprediksi [tanda air
3 (1109 bp) dan 4 (1222 bp)] untuk tidak
mengganggu kelangsungan hidup sel.
Urutan watermark tersebut mengkodekan
pengidentifikasi
unik
sementara
membatasi terjemahan mereka menjadi
peptida. Tabel S1 daftar perbedaan antara
genom sintetis dan standar alam ini.
Gambar S2 menunjukkan peta dari
mycoides M. JCVI-syn1.0 genom. Kaset
dan
perakitan
menengah
batas,
watermark, penghapusan, sisipan, dan
gen dari syn1.0 M. mycoides JCVI
ditunjukkan pada gambar. S2, dan urutan

transplantasi
Mycoplasma
clone
sMmYCp235-1 telah disampaikan kepada
GenBank (aksesi CP002027).
Strategi Sintetis perakitan genom.
Kaset dirancang umumnya 1080 bp
dengan 80-bp tumpang tindih kaset yang
berdekatan (11). Mereka semua diproduksi
oleh perakitan kimia yang mensintesis
oligonukleotida oleh Blue Heron (Bothell,
Washington) . Setiap kaset itu secara
individual disintesis dan urutan diverifikasi
oleh produsen. Untuk membantu dalam
proses pembangunan , DNA kaset dan
perakitan
intermediet
dirancang
mengandung Tidak saya situs restriksi
pada mereka termini dan digabungkan
dengan adanya vector elemen untuk
memungkinkan pertumbuhan dan seleksi
dalam ragi ( 7 , 11 ) . Sebuah strategi
hirarkis dirancang untuk merakit genom
dalam tiga tahap oleh transformasi dan
rekombinasi homolog di
ragi dari 1.078 kaset 1 - kb ( Gambar . 1 ) (
12 , 13 ). Majelis intermediet sintetis 10 kb . Pada tahap pertama , kaset dan
vektor yang digabungkan dalam ragi dan
ditransfer ke Escherichia coli (11). DNA
plasmid kemudian diisolasi dari individu E.
coli klon dan dicerna untuk skrining sel
yang
mengandung
vektor
dengan
berkumpul 10-kb masukkan. Satu sukses
10-kb perakitan diwakili (Gbr. 2A). Secara
umum, setidaknya satu 10-kb dirakit
fragmen dapat diperoleh skrining 10 klon
ragi.
Namun,
tingkat
Keberhasilan
bervariasi dari 10 hingga 100%. Semua
tahap pertama intermediet disekuensing.
Sembilan belas out dari 111 rakitan
terdapat kesalahan. Bergantian klon
dipilih, urutan-diverifikasi, dan pindah ke
tahap perakitan berikutnya (11). Majelis
intermediet sintetis 100-kb. Dikumpulkan
rakitan 10-kb dan masing-masing vektor
kloning yang diubah menjadi ragi sebagai
di atas untuk menghasilkan intermediet
perakitan
100-kb
(11).
Hasil
kami
menunjukkan bahwa produk ini tidak
dapat bertahan stabil dalam E. coli,
sehingga
digabungkan
DNA
harus
diekstrak dari ragi. Polymerase chain
reaction Multiplex (PCR) adalah dilakukan
pada klon ragi yang dipilih (gbr. S3 dan
Tabel S2). Karena setiap perakitan 10-kb
menengah diwakili oleh sepasang primer
di analisis ini, kehadiran semua amplikon

akan
menyarankan
dirakit
100-kb
menengah. Di umum, 25% atau lebih dari
klon disaring terkandung semua amplikon
diharapkan untuk perakitan lengkap. Salah
satu klon tersebut adalah dipilih untuk
skrining lebih lanjut. Melingkar plasmid
DNA diekstraksi dan ukuran pada gel
agarosa bersama penanda superkoil.
Secondstage sukses rakitan dengan
urutan vektor adalah ~ 105 kb panjang
(Gambar. 2B). Ketika semua amplikon
yang diproduksi multiplex berikut PCR,
secondstage sebuah perakitan menengah
ukuran yang benar adalah
biasanya
diproduksi.
Dalam
beberapa
kasus,
bagaimanapun, kecil penghapusan terjadi.
Dalam kasus lain, beberapa 10-kb
fragmen berkumpul, yang menghasilkan
besar kedua tahap perakitan menengah.
Untungnya,
perbedaan-perbedaan
ini
dapat dengan mudah dideteksi pada gel
agarosa
sebelum
genom
lengkap
perakitan. Perakitan genom lengkap.
Dalam persiapan untuk tahap akhir
perakitan, itu perlu untuk mengisolasi
jumlah mikrogram setiap 11
majelis
tahap
kedua
(11).
Seperti
dilaporkan (14),
plasmid melingkar ukuran tahap kedua
kami
majelis dapat diisolasi dari spheroplasts
ragi
setelah
prosedur
basa-lisis.
Untuk
selanjutnya
memurnikan 11 perakitan intermediet,
mereka
diobati dengan exonuclease dan melewati
sebuah
Kolom anion-exchange. Sebuah sebagian
kecil dari
Total plasmid DNA (1/100) dicerna dengan
Tidak
I
dan
dianalisis
dengan
elektroforesis gel lapangan inversi

(FIGE)
(Gambar.
2C).
Metode
ini
menghasilkan
~ 1 mg setiap perakitan per 400 ml ragi
Budaya (~ 1011 sel).
Metode
di
atas
tidak
benar-benar
menghapus
semua kromosom DNA ragi linear,
yang kami temukan secara substansial
dapat menurunkan
transformasi ragi dan efisiensi perakitan.
Untuk
lebih memperkaya untuk 11 intermediet
perakitan melingkar,
~ 200 sampel ng setiap perakitan
dikumpulkan
dan
dicampur
dengan
agarose cair. Sebagai
mengeras agarosa, serat benang melalui
dan topologi "perangkap" DNA melingkar
(15).
DNA linear untrapped kemudian dapat
dipisahkan
dari agarosa plug dengan elektroforesis,
sehingga
memperkaya untuk molekul melingkar
terperangkap. Itu
11 intermediet perakitan melingkar yang
dicerna
Tidak dengan saya sehingga insert dapat
dibebaskan.
Selanjutnya, fragmen yang diambil dari
plug agarosa, dianalisis dengan FIGE
(Gambar. 2D),
dan berubah menjadi spheroplasts ragi
(11). Di
tahap ini ketiga dan terakhir dari
perakitan, tambahan
urutan vektor tidak diperlukan karena
elemen ragi kloning yang sudah ada
dalam perakitan 811-900.